淋巴上皮瘤樣癌臨床病理特征及PD-L1表達(dá)分析

周仁鈺， 鐘麗娟， 彭麗琳， 楊 波， 陸元志

淋巴上皮瘤樣癌(lymphoepithelioma-like carcinoma,LELC)是發(fā)生于上皮源性的罕見(jiàn)惡性腫瘤，組織形態(tài)與未分化鼻咽癌相同，因較罕見(jiàn)而易被誤診為淋巴瘤或炎性病變。LELC可發(fā)生于全身多個(gè)器官，如涎腺、肺、皮膚、胸腺、胃、肝臟、泌尿系統(tǒng)和子宮頸等[1-2]，其中以肺內(nèi)發(fā)生最常見(jiàn)，約占非小細(xì)胞癌的0.7%[3]。肺LELC常發(fā)生于較年輕且不吸煙的亞洲人群，性別上無(wú)明顯差異[4]，與其他非小細(xì)胞肺癌患者相比，患者的診斷時(shí)間較早，預(yù)后更好[5]。本研究旨在探討LELC臨床病理特征以及程序性死亡配體1(programmed death-ligand 1,PD-L1)的表達(dá)情況，以期提高臨床醫(yī)師對(duì)其認(rèn)識(shí)，避免誤診、漏診。

1 資料與方法

1.1一般資料 收集2010年1月至2021年5月暨南大學(xué)附屬第一醫(yī)院臨床病理科確診的15例LELC的臨床資料。其中男4例，女11例，年齡28～81歲，中位年齡59歲。病變發(fā)生于肺部10例，涎腺3例，腎盂1例，鼻腔1例。所有患者無(wú)鼻咽癌病史。

1.2HE染色法 15例標(biāo)本均為手術(shù)切除后送檢。所有標(biāo)本經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、HE染色。HE染色操作步驟：(1)將切片放入65 ℃烤箱烘烤30 min；(2)放置于二甲苯溶液中脫蠟3次，5 min/次；(3)放置于梯度乙醇中去除二甲苯，乙醇濃度依次為無(wú)水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、75%乙醇,每次約為1 min，然后用自來(lái)水沖洗；(4)放入蘇木素染液染色7 min，具體時(shí)間根據(jù)染色情況進(jìn)行調(diào)整，水洗1 min，再放入1%鹽酸酒精進(jìn)行分化片刻后用自來(lái)水沖洗15 min，直到觀(guān)察細(xì)胞核呈藍(lán)色；(5)放入1%伊紅染液染色1 min，再進(jìn)行水洗；(6)放入梯度乙醇進(jìn)行脫水，乙醇濃度依次為85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇,每次約為1 min；(7)放入苯酚二甲苯、二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中透明處理3次，每次約3 min；(8)用中性樹(shù)膠封片；(9)光鏡下觀(guān)察。

1.3免疫組織化學(xué)染色法 采用EnVision二步法進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，并評(píng)估各種抗體染色陽(yáng)性結(jié)果。具體操作步驟：(1)將蠟塊連續(xù)切片約4 μm，放入65 ℃烤箱烘烤30 min。(2)放入二甲苯脫蠟3次，每次約5 min。(3)再依次放入梯度乙醇去除二甲苯，乙醇濃度為95%乙醇、90%乙醇、85%乙醇、80%乙醇、75%乙醇，各2 min，洗去二甲苯。(4)將切片放置于抗原修復(fù)液(修復(fù)液類(lèi)型：EDTA，pH 8.0)中，95 ℃ 20 min，使用Dako PT Link抗原修復(fù)儀修復(fù)，冷卻至室溫后取出，放置于蒸餾水中5 min。(5)將切片浸沒(méi)于3%濃度過(guò)氧化氫溶液中，室溫下10 min，蒸餾水沖洗干凈，再用磷酸鹽緩沖液(phosphate buffered saline，PBS)沖洗3次，每次約5 min。沖洗結(jié)束后，擦干切片組織周?chē)?，用特制免疫組織化學(xué)筆在組織周?chē)?huà)圈，防止抗體擴(kuò)散。(6)甩干玻片，分別滴加適量已配置好的一抗溶液，再將切片放置于濕盒中，室溫下孵育90 min。其中PD-L1抗體購(gòu)自Cell Signaling公司(Cat#13684，1∶200)；P40為即用型抗體，購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司(Cat# RAB-0666)；其余抗體為即用型抗體，購(gòu)自DAKO公司，包括廣譜細(xì)胞角蛋白(pan-cytokeratin，pan-CK)(Cat# GA053|IR053)、CK5/6(Cat# GA780|IR780)、白細(xì)胞共同抗原(leukocyte common antigen,LCA)(Cat# GA751|IR751)、突觸素(synaptophysin,Syn)(GA660|IR660)、Ki-67(Cat# GA626|IR626)。(7)使用PBS沖洗3次，5 min/次。(8)甩干玻片，滴加即用型二抗(購(gòu)自Dako公司)，放置于濕盒中，室溫下孵育20 min。(9)使用PBS沖洗3次，5 min/次。(10)將DAB顯色劑滴加在切片組織上，靜置2～3 min觀(guān)察顯色情況，當(dāng)陽(yáng)性對(duì)照組織出現(xiàn)棕色時(shí)，用自來(lái)水沖洗，停止顯色。(11)將切片放入蘇木素染液復(fù)染組織細(xì)胞核，約5 min，自來(lái)水沖洗，再放入1%鹽酸酒精進(jìn)行分化片刻后用自來(lái)水沖洗，再放入返藍(lán)液中返藍(lán)1 min。(12)放入梯度乙醇進(jìn)行脫水，乙醇濃度依次為85%乙醇、95%乙醇、95%乙醇、無(wú)水乙醇，每次約為1 min；放入苯酚二甲苯、二甲苯(Ⅰ)、二甲苯(Ⅱ)中透明處理3次，每次約3 min；用中性樹(shù)膠封片。(13)組織PD-L1表達(dá)水平以腫瘤比例評(píng)分(tumor proportion score,TPS)表示，所有切片由兩位病理醫(yī)師獨(dú)立判讀。PD-L1表達(dá)水平以任何強(qiáng)度膜染色的TPS為判讀標(biāo)準(zhǔn)，TPS<1%為陰性，TPS≥1%為陽(yáng)性；TPS 1%～49%為低表達(dá)，TPS≥50%為高表達(dá)[6]。

1.4原位雜交檢測(cè) EB病毒編碼的小RNA[Epstein-Barr(EB) virus-encoded small RNA,EBER]原位雜交檢測(cè)試劑盒購(gòu)于Dako公司。15例標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片、烤片，具體操作步驟：(1)將切片放置于二甲苯中脫蠟2次，每次約5 min。(2)將切片放置于無(wú)水乙醇中5 min后晾干。(3)將切片滴加新鮮配制的胃消化酶后放入濕盒中，再放置于37 ℃水浴箱內(nèi)，40 min。(4)取出切片后放入梯度乙醇，乙醇濃度依次為75%乙醇、85%乙醇、無(wú)水乙醇,每次約2 min。取出切片后晾干。(5)混勻探針溶液，每張切片滴加10～20 μl，蓋上蓋玻片，放入37 ℃水浴箱2 h。(6)取出標(biāo)本，移去蓋玻片，用PBS沖洗，再將切片浸于PBS中3次，每次約5 min。(7)滴加30～50 μl二抗溶液，放入37 ℃水浴箱，30 min。PBS沖洗3次，每次約1 min。(8)滴加50 μl DAB顯色液于切片，顯色5～10 min，光鏡下觀(guān)察顯色情況，適當(dāng)終止顯色。(9)蘇木素染色3～5 min，鹽酸酒精進(jìn)行分化片刻后自來(lái)水沖洗，再放入返藍(lán)液中返藍(lán)1 min。(10)脫水、透明與封片。

1.5影像學(xué)檢查 所有患者就診時(shí)進(jìn)行GE Highspeed 16螺旋CT平掃及增強(qiáng)檢查，其中腫瘤位于鼻腔及涎腺的患者均行GE discovery MR 750 3.0 T磁共振儀檢查。

1.6隨訪(fǎng) 通過(guò)電話(huà)和門(mén)診復(fù)查方式進(jìn)行隨訪(fǎng)，復(fù)查項(xiàng)目包括胸片、B超、血生化及腫瘤標(biāo)志物等。

2 結(jié)果

2.1臨床特征 15例LELC中10例發(fā)生于肺部，男2例，女8例，中位年齡為58歲?；颊邇H有輕微咳嗽或胸悶，或體檢時(shí)發(fā)現(xiàn)肺部腫塊。胸部CT常顯示團(tuán)塊狀高密度影，呈分葉狀，周?chē)?jiàn)長(zhǎng)短不一毛刺征。1例因發(fā)生L3椎體轉(zhuǎn)移，以左膝蓋疼痛伴左腰牽拉疼痛為首要癥狀而就診。LELC發(fā)生于涎腺3例，其中腮腺2例，頜下腺1例。3例患者均因發(fā)現(xiàn)無(wú)痛性腫塊而就診，專(zhuān)科查體發(fā)現(xiàn)腫塊呈卵圓形，邊界尚清，表面光滑，質(zhì)地中等偏韌，無(wú)波動(dòng)感，活動(dòng)度較差，無(wú)明顯壓痛。1例LELC發(fā)生于腎盂，為80歲女性患者，患者因無(wú)痛性肉眼血尿而就診，CT提示右側(cè)腎盂-輸尿管區(qū)見(jiàn)一不規(guī)則軟組織密度灶，邊界欠清，增強(qiáng)掃描明顯不均勻強(qiáng)化。1例LELC發(fā)生于鼻腔，為79歲女性患者，因無(wú)明顯誘因出現(xiàn)右側(cè)鼻腔流清水樣涕，伴鼻塞而就診，MRI提示右側(cè)鼻腔占位，考慮鼻息肉或內(nèi)翻乳頭狀瘤，右側(cè)額竇、上頜竇炎癥，此患者影像排除鼻咽癌轉(zhuǎn)移。見(jiàn)表1。

2.2病理學(xué)特征 腫瘤大體為灰白，少部分為灰紅或灰黃，質(zhì)稍硬，與周?chē)M織分界不清。鏡下特點(diǎn)：癌細(xì)胞呈巢狀、彌漫片狀或條索狀排列；細(xì)胞圓形、多角形或不規(guī)則，胞質(zhì)紅染，界不清，未分化或低分化狀；細(xì)胞核深染或呈空泡狀，可見(jiàn)明顯的核仁及核分裂像；間質(zhì)伴豐富的淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞浸潤(rùn)。見(jiàn)圖1。

2.3免疫組織化學(xué)染色結(jié)果 15例LELC病例中，pan-CK、P40均為陽(yáng)性，除病例2 Ki-67低表達(dá)外，其余病例Ki-67增殖指數(shù)≥40%。10例樣本顯示PD-L1膜陽(yáng)性表達(dá)，其中4例PD-L1高表達(dá)，TPS≥50%，6例PD-L1低表達(dá)，1%

表1 15例患者臨床特征

?腫瘤細(xì)胞呈巢團(tuán)小梁狀分布，間質(zhì)伴豐富淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)(×100)；?腫瘤細(xì)胞呈卵圓形或多角形(×200)；?觀(guān)察可見(jiàn)嗜酸性核仁(×400)

?腫瘤組織pan-CK表達(dá)陽(yáng)性；?腫瘤組織P40表達(dá)陽(yáng)性；?腫瘤組織Ki67高表達(dá)；?腫瘤組織PD-L1強(qiáng)性；?腫瘤組織Syn陰性；?背景浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞表達(dá)LCA

2.4原位雜交檢測(cè)結(jié)果 除病例5(病變發(fā)生于腎盂)外，其余14例樣本EBER均為陽(yáng)性。見(jiàn)圖3。

圖3 原位雜交EBER陽(yáng)性圖

2.5隨訪(fǎng)結(jié)果 隨訪(fǎng)截止日期為2021年5月17日，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為12個(gè)月。除2例失訪(fǎng)外，其余13例術(shù)后每3個(gè)月進(jìn)行復(fù)查。其中病例8確診時(shí)已發(fā)生椎體轉(zhuǎn)移，行化療治療，目前帶瘤生存，其余12例均無(wú)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移。

3 討論

3.1LELC于1987年首次報(bào)道，認(rèn)為其發(fā)生與EB病毒(Epstein-Barr virus,EBV)感染有關(guān)[7]。本研究中10例肺部LELC均為EBER陽(yáng)性。2015年世界衛(wèi)生組織的肺腫瘤分類(lèi)中將肺LELC歸為其他未分類(lèi)癌[8]。與常見(jiàn)的肺腺癌、鱗癌相比，肺LELC很少伴有EGFR突變或ALK重排等非小細(xì)胞肺癌常見(jiàn)驅(qū)動(dòng)基因變異。Hong等[9]通過(guò)對(duì)肺部LELC患者腫瘤組織樣本進(jìn)行全外顯子測(cè)序(whole exome sequencing,WES)、靶向深度測(cè)序和單核苷酸多態(tài)陣列(single nucleotide polymorphism，SNP)研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)LELC中一些抑癌基因出現(xiàn)高頻突變，包括TP53、NOTCH1、MGA、PTPRD、TRAF3和KMT2C等。TP53變異頻率仍然較低，且與患者生存期無(wú)顯著關(guān)聯(lián)。此外，拷貝數(shù)改變也較為常見(jiàn)，如5p(32%)、12p(54%)和12q(48%)擴(kuò)增；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)3p、5q、13q、9p21.3、14q和16q的頻繁丟失，其中9p21.3缺失與患者臨床不良預(yù)后密切相關(guān)，其中涉及CDKN2A、CDKN2B和MTAP抑癌基因。這些染色體缺失導(dǎo)致NF-κB通路的多個(gè)負(fù)調(diào)控因子失活，包括TRAF3[14q32.3，80%]、NFKBIA[14q13，52%]、NLRC5[16q13，52%]和CYLD[16q12.1，48%]等。更重要的是，約56%的病例存在Ⅰ型干擾素相關(guān)基因高頻缺失，這些基因與宿主對(duì)抗病毒感染有關(guān)。進(jìn)一步綜合分析顯示LELC基因變異譜與NF-κB、JAK/STAT和細(xì)胞周期信號(hào)通路相關(guān)聯(lián)，并證實(shí)EBV感染參與了肺LELC的發(fā)病機(jī)制。而且，通過(guò)多維基因組比較，揭示了肺LELC是一種獨(dú)特的肺癌亞型，這些改變與鼻咽癌的基因變異譜較為相似。Xie等[10]對(duì)27例肺LELC組織樣本進(jìn)行二代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)分析，其中1例樣本未檢測(cè)出突變，其余26例樣本共檢測(cè)出107個(gè)單核苷酸變異、12個(gè)插入或缺失和65個(gè)拷貝數(shù)擴(kuò)增。僅有2例樣本檢測(cè)出非小細(xì)胞肺癌中常見(jiàn)的驅(qū)動(dòng)突變基因，即KRASG12D和ERBB2基因擴(kuò)增。這項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)肺LELC最常見(jiàn)的突變基因包括CCND1、TP53、DAXX和NFκB1A，其發(fā)生率分別為30%(8/27)、26%(7/27)、22%(6/27)和22%(6/27)；并且發(fā)現(xiàn)FGF19、FGF3、FGF4、MDM4、STAT3和RPS6KB2基因擴(kuò)增與CCND1或DAXX基因擴(kuò)增伴隨出現(xiàn)。

3.2涎腺LELC常累及腮腺，需與轉(zhuǎn)移性鼻咽癌鑒別，首選影像學(xué)檢查，且其依然與EBV感染相關(guān)[11-12]。發(fā)生于泌尿系統(tǒng)的LELC極其罕見(jiàn)，臨床癥狀與一般的尿路上皮癌類(lèi)似，常以無(wú)痛性肉眼血尿?yàn)槭装l(fā)癥狀，與發(fā)生在肺部及涎腺的LELC不同的是，腎盂LELC與EBV感染相關(guān)性不顯著[13-14]。本研究中的1例腎盂LELC也顯示EBV陰性，提示可能存在其他惡性轉(zhuǎn)化驅(qū)動(dòng)變異。該患者已隨訪(fǎng)28個(gè)月，目前身體機(jī)能良好。有研究表明，尿路上皮LELC預(yù)后與常見(jiàn)尿路上皮癌無(wú)明顯差異[15]。由于尿路上皮LELC來(lái)源于尿路上皮細(xì)胞的轉(zhuǎn)化，2004年世界衛(wèi)生組織的泌尿系腫瘤分類(lèi)中，將LELC歸類(lèi)為尿路上皮癌的一個(gè)亞組[16]。發(fā)生于鼻腔的LELC必須首先排除存在鼻咽癌，影像學(xué)檢查是兩者主要的鑒別方法。本研究中有1例病變發(fā)生于鼻腔的患者，CT檢查提示鼻腔占位，但鼻咽部未見(jiàn)明顯異常，排除鼻咽癌蔓延或轉(zhuǎn)移可能。

3.3本研究進(jìn)一步通過(guò)免疫組織化學(xué)染色法對(duì)15例組織標(biāo)本進(jìn)行PD-L1檢測(cè)，結(jié)果顯示腫瘤中PD-L1膜染色陽(yáng)性率為66.7%(10/15)，其中4例PD-L1高表達(dá)，6例為低表達(dá)。近年研究顯示，免疫檢查點(diǎn)抑制劑對(duì)EBV感染相關(guān)的胃癌、鼻咽癌、Merkel細(xì)胞癌等療效顯著[17-19]。一項(xiàng)包含66例肺LELC的研究發(fā)現(xiàn)，約75.8%(50/66)病變組織PD-L1表達(dá)陽(yáng)性，提示肺LELC中EBV陽(yáng)性且PD-L1高表達(dá)可能是免疫檢測(cè)點(diǎn)抑制劑使用的重要標(biāo)志物[20]。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，3例PD-L1的TPS分別為15%、30%和60%的LELC患者進(jìn)行免疫治療后，均取得良好療效，提示肺LELC患者可從免疫檢查點(diǎn)抑制劑中獲益[10]。

綜上所述，由于LELC較為罕見(jiàn)，其發(fā)生的機(jī)制尚未完全闡明，但已有部分研究表明其與EBV感染有關(guān)，基因組變異譜與鼻咽癌相似，可能從免疫治療中獲益，預(yù)后較好。由于本研究病例數(shù)較少，且只進(jìn)行了免疫組織化學(xué)染色及EBER原位雜交檢測(cè)，尚未進(jìn)行NGS檢測(cè)。因此，未來(lái)尚需進(jìn)一步對(duì)其確切基因組變異譜進(jìn)行探討，為L(zhǎng)ELC精準(zhǔn)診療提供新的依據(jù)和靶點(diǎn)。