黑果枸杞原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生

寧曉春，高思丹，楊莉娜，陳生蓉，何 濤*

(1 青海大學(xué) 生態(tài)環(huán)境工程學(xué)院，西寧 810016；2 青海省園林植物與觀賞園藝重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；3 省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016；4 青海大學(xué) 農(nóng)牧學(xué)院，西寧 810016)

黑果枸杞(Lyciumruthenicum)，屬茄科(Solanaceae)枸杞屬(Lycium)植物，為多棘刺灌木，主要分布于西北荒漠地區(qū)，具有非常高的藥用價(jià)值、營(yíng)養(yǎng)價(jià)值及經(jīng)濟(jì)價(jià)值[1]。黑果枸杞是原花青素含量最高的天然野生果實(shí)，是最有效的原生態(tài)天然抗氧化劑[2]。果實(shí)成熟后呈紫黑色，藏藥中稱其為“旁瑪”，可清心熱，治療婦科疾病[3]。黑果枸杞果實(shí)中氨基酸種類豐富，含有7種必需氨基酸[4]，對(duì)降血脂[5]、降血糖[6]、抗氧化[7]、抗腫瘤等有一定的功效。黑果枸杞抗旱性、耐鹽性較好，且高度耐貧瘠，可正常生長(zhǎng)于沙地、鹽堿地、荒漠化地區(qū)，對(duì)水土保持、防風(fēng)固沙具有重大意義[8]。近年來(lái)，隨著商業(yè)利益的驅(qū)動(dòng)，野生黑果枸杞的生存空間受到嚴(yán)重威脅，野生資源遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)需求。因此，眾多學(xué)者利用人工種植、引種馴化、組織培養(yǎng)等方法對(duì)野生黑果枸杞的資源保護(hù)和品種改良展開(kāi)研究[9-10]。

植物原生質(zhì)體是去除了細(xì)胞壁的裸露細(xì)胞，在適宜培養(yǎng)條件下能夠細(xì)胞壁再生、分裂分化從而發(fā)育成完整植株[11]。原生質(zhì)體的分離和再生在植物遺傳育種、遺傳轉(zhuǎn)化、性狀改良、分子鑒定、基因重組等領(lǐng)域具有重要的意義[12-14]。目前這種技術(shù)手段已成功應(yīng)用于薔薇科(Rosaceae Juss.)、十字花科(Brassicaceae Burnett)、傘形科(Apiaceae)、豆科(Leguminosae sp.)、茄科(Solanaceae)等數(shù)十個(gè)科的植物中[15-19]，寧夏枸杞(Lyciumbarbarum)原生質(zhì)體的分離與再生已有報(bào)道[20]，而與之同屬的黑果枸杞原生質(zhì)體再生尚未建立成熟的實(shí)驗(yàn)體系。

本研究以野生黑果枸杞無(wú)菌苗為外植體，以愈傷組織為游離材料，在獲得高產(chǎn)量、高活力原生質(zhì)體的基礎(chǔ)上開(kāi)展培養(yǎng)條件優(yōu)化，并對(duì)分化得到的再生植株進(jìn)行遺傳穩(wěn)定性分析。此研究為原生質(zhì)體水平上枸杞的生理生化和基因轉(zhuǎn)移創(chuàng)建了新的實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)，為利用體細(xì)胞雜交技術(shù)轉(zhuǎn)移野生植物抗逆遺傳性狀奠定基礎(chǔ)，并為枸杞優(yōu)良品種的選育提供材料。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

野生黑果枸杞(Lyciumruthenicum)采自青海省柴達(dá)木盆地都蘭縣。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 愈傷組織的誘導(dǎo)將野生黑果枸杞種子消毒，置于不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中萌發(fā)，待無(wú)菌苗生長(zhǎng)30 d后，切取葉片、葉柄及莖段作為外植體，接種于含有不同濃度2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)和6-芐氨基腺嘌呤(6-BA)的MS培養(yǎng)基中，于24 ℃、16 h光照/8 h黑暗光周期、2 000 Lx光照強(qiáng)度下培養(yǎng)，30 d后觀察愈傷組織誘導(dǎo)情況。

1.2.2 原生質(zhì)體的游離分別取3 g幼嫩葉片和愈傷組織(葉片、葉柄、莖段誘導(dǎo)得到)作為游離材料，置于10 mL酶液中(含1.5%纖維素酶，1%離析酶，0.5% 半纖維素酶，0.5 mol·L-1甘露醇，0.1% MES和0.05 mol·L-1CaCl2)，在搖床上以70 r·min-1轉(zhuǎn)速25 ℃黑暗處理11 h，用150目細(xì)胞網(wǎng)篩過(guò)濾，洗液(含0.5 mol·L-1甘露醇，0.1% MES和0.05 mol·L-1CaCl2)洗滌，18%蔗糖純化，培養(yǎng)液洗滌并離心收集原生質(zhì)體。

1.2.3 原生質(zhì)體培養(yǎng)及植株再生將純化后的原生質(zhì)體密度調(diào)整至104～105個(gè)·g-1左右，使用液體淺層和固液雙層兩種方式培養(yǎng)，培養(yǎng)基選用MS1和MS2(表1)；24 ℃黑暗靜置培養(yǎng)，每2周添加1次新鮮培養(yǎng)基，待形成小愈傷組織后，轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)(先弱光后正常)。30 d后，將固體培養(yǎng)基上生長(zhǎng)較好的愈傷組織，轉(zhuǎn)移至含有不同濃度6-BA(0～2.0 mg·L-1)和IBA(0～0.2 mg·L-1)的MS分化培養(yǎng)基上，45 d后觀察不定芽的形成情況。不定芽長(zhǎng)至2 cm左右后，移入不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)。取根系生長(zhǎng)健壯的再生苗煉苗1周，移栽至混有營(yíng)養(yǎng)土和蛭石(2∶1)的基質(zhì)中，30 d后觀察再生植株生長(zhǎng)情況。

1.2.4 再生植株遺傳穩(wěn)定性分析(1)流式細(xì)胞儀檢測(cè)。參照高思丹等[21]的方法，以野生黑果枸杞親本植株作為參照樣本用于裂解和染色處理，植物倍性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海月下生物科技中心，采用美國(guó)Beckman公司的Cytoflex LX流式細(xì)胞儀，激發(fā)波長(zhǎng)為405 nm，檢測(cè)結(jié)果用CytExpert軟件分析。

表1 原生質(zhì)體培養(yǎng)所需培養(yǎng)基

(2)ISSR分子檢測(cè)。以野生黑果枸杞親本植株作為對(duì)照，隨機(jī)選取6株原生質(zhì)體再生植株進(jìn)行ISSR分子檢測(cè)。DNA提取采用CTAB法，引物UBC 824(TCTCTCTCTCTCTCTCG)和UBC 834(AG-AGAGAGAGAGAGAGYT)由上海生工生物工程有限公司合成，退火溫度分別為48.4和48.7℃。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性45 s，退火45 s，72 ℃延伸2 min，36個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸7 min。擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE配制的1.5%瓊脂糖凝膠中進(jìn)行電泳分離，電壓150 V，時(shí)間60 min。電泳結(jié)束后用凝膠成像儀拍照并分析。

1.2.5 統(tǒng)計(jì)分析數(shù)據(jù)處理和分析采用Excel和SAS軟件。

(1)原生質(zhì)體活力檢測(cè)使用熒光雙醋酸酯(FDA)法。原生質(zhì)體活力(%)=發(fā)黃綠色熒光原生質(zhì)體數(shù)/視野中的原生質(zhì)體總數(shù)×100%，原生質(zhì)體產(chǎn)量(個(gè)·g-1)=(懸浮液中原生質(zhì)體數(shù)/mL×總體積)/材料總鮮重(g)。

(2)倍性計(jì)算公式：待測(cè)樣本倍性=參照樣本倍性水平×(待測(cè)樣本峰熒光均值/參照樣本峰熒光均值)。

(3)ISSR只計(jì)算清晰穩(wěn)定的條帶，在同一遷移率位置有譜帶記為“1”，無(wú)譜帶記為“0”，記錄譜帶構(gòu)建“0，1”矩陣。

GS=2Nij/(Ni+Nj)

GS為遺傳相似系數(shù)，Nij為親本植株和再生植株中相同條帶數(shù)，Ni為親本植株條帶數(shù)，Nj為再生植株條帶數(shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同外植體愈傷組織的誘導(dǎo)

葉片、葉柄和莖段3種外植體在含有單一2,4-D(0.5～1.5 mg·mL-1)的MS培養(yǎng)基上，均可誘導(dǎo)出愈傷組織(表2)。葉片外植體接種2～3 d后，外植體出現(xiàn)卷曲(圖1，A2)；15 d左右邊緣膨大，在切口周圍有愈傷組織產(chǎn)生(圖1，A3)；25 d后，形成大量黃綠色顆粒狀愈傷組織，質(zhì)地均一、松散(圖1，A4)。葉柄及莖段外植體接種后，15 d左右外植體膨大；25 d后大量愈傷組織形成，顏色較葉片愈傷組織淺，質(zhì)地較松散(圖1，B4、C4)。

表2 不同外植體愈傷組織誘導(dǎo)率及生長(zhǎng)情況

在含有2,4-D(0.5～1.5 mg·mL-1)的MS培養(yǎng)基中添加6-BA(0.2～1.0 mg·mL-1)后，愈傷組織的誘導(dǎo)率和生長(zhǎng)情況不及只有單一2,4-D的MS培養(yǎng)基(表2)。在含有同一濃度2,4-D的培養(yǎng)基中，隨著6-BA濃度的增加，愈傷組織的誘導(dǎo)率下降，這一現(xiàn)象在葉片、葉柄和莖段外植體中均存在。在含有6-BA的MS培養(yǎng)基中，誘導(dǎo)的愈傷組織少，顏色淺，生長(zhǎng)緩慢，質(zhì)地較軟，有的褐變或水漬化(圖1)。

綜合比較，黑果枸杞葉片為誘導(dǎo)愈傷組織的最適外植體，含有0.5 mg·mL-12,4-D的MS培養(yǎng)基為誘導(dǎo)愈傷組織的最適培養(yǎng)基。在該培養(yǎng)條件下，愈傷組織的誘導(dǎo)率可達(dá)100%，愈傷組織呈黃綠色顆粒狀，質(zhì)地松散，生長(zhǎng)迅速。

A1-A7. 葉片愈傷組織在不同培養(yǎng)基上處理不同天數(shù)；B1-B7. 葉柄愈傷組織在不同培養(yǎng)基上處理不同天數(shù)；C1-C7. 莖段愈傷組織在不同培養(yǎng)基上處理不同天數(shù)圖1 黑果枸杞不同外植體在不同培養(yǎng)基上誘導(dǎo)的愈傷組織A1-A7. The leaf calli were treated on different media for different days；B1-B7. The petiole calli were treated on different media for different days；C1-C7. The stem segment calli were treated on different media for different daysFig.1 Calli induced from different explants of L. ruthenicum on different media

表3 不同外植體及不同繼代次數(shù)愈傷組織的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力

2.2 外植體來(lái)源及愈傷組織繼代次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體游離的影響

在外植體來(lái)源上，用葉片和愈傷組織游離產(chǎn)生的原生質(zhì)體存在顯著差異(表3)。以葉片、葉柄、莖段的愈傷組織作為外植體，繼代1次后產(chǎn)生的原生質(zhì)體在產(chǎn)量和活力上均顯著高于葉片，其中葉片愈傷組織原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高，分別為7.77×106個(gè)·g-1和92%；而直接用葉片游離產(chǎn)生的原生質(zhì)體產(chǎn)量只有2.34×106個(gè)·g-1，活力為66%。

在愈傷組織繼代上，葉片、葉柄、莖段的愈傷組織隨著繼代次數(shù)的增加，游離產(chǎn)生的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力逐漸降低(表3)。繼代1次的葉片愈傷組織游離產(chǎn)生的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力分別為7.77×106個(gè)·g-1和92%；繼代2次時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力分別下降為4.06×106個(gè)·g-1和83%；繼代3次時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力分別下降到2.07×106個(gè)·g-1和64%。綜合比較，繼代1次的葉片愈傷組織是黑果枸杞原生質(zhì)體游離的最適外植體。

2.3 不同甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體的影響

酶液中不同甘露醇濃度對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力有顯著影響(表4)。當(dāng)甘露醇濃度較低時(shí)(0.3 mol·L-1)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力均較低，分別只有1.44×106個(gè)·g-1和71%，且溶液中細(xì)胞團(tuán)多、細(xì)胞碎片多，存在大量脫壁不全的原生質(zhì)體。當(dāng)甘露醇濃度為0.5 mol·L-1時(shí)，原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力最高，分別為7.77×106個(gè)·g-1和92%，游離產(chǎn)生的原生質(zhì)體為規(guī)則的球形。

2.4 原生質(zhì)體培養(yǎng)

在培養(yǎng)方式上，固液雙層培養(yǎng)優(yōu)于液體淺層培養(yǎng)(表5)。在相同培養(yǎng)方式下，不同培養(yǎng)基(MS1、MS2)產(chǎn)生的培養(yǎng)效果也不同(表5)。以固液雙層培養(yǎng)為例，使用MS2培養(yǎng)基，2 d時(shí)出現(xiàn)第一次細(xì)胞分裂，培養(yǎng)10 d后的分裂頻率為45.9%，培養(yǎng)20 d后形成細(xì)胞團(tuán)的比例為22.9%；而使用MS1培養(yǎng)基，3 d時(shí)才出現(xiàn)第一次細(xì)胞分裂，培養(yǎng)10 d后的分裂頻率為32.7%，培養(yǎng)20 d后形成細(xì)胞團(tuán)的比例為25%。綜合比較認(rèn)為，MS2-固液雙層培養(yǎng)適于黑果枸杞原生質(zhì)體培養(yǎng)。在該培養(yǎng)方式下，培養(yǎng)第2天可觀察到第1次細(xì)胞分裂(圖2，D)，5 d左右進(jìn)行第二次細(xì)胞分裂(圖2，E)，接著開(kāi)始第三次細(xì)胞分裂(圖2，F(xiàn))，培養(yǎng)10 d時(shí)的分裂頻率為45.9%，14 d左右形成細(xì)胞團(tuán)(圖2，G)，培養(yǎng)20 d時(shí)形成細(xì)胞團(tuán)的比例達(dá)到22.9%，此時(shí)可在培養(yǎng)皿中看到肉眼可見(jiàn)的小愈傷組織(圖2，H)。

2.5 植株再生

將培養(yǎng)皿中的小愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有0.5 mg·mL-12,4-D的 MS固體培養(yǎng)基中(圖2，I)，約30 d后形成質(zhì)地松散的黃綠色愈傷組織(圖2，J)；將長(zhǎng)勢(shì)較好的愈傷組織轉(zhuǎn)移至含有1.5 mg·mL-16-BA和0.1 mg·mL-1IBA的MS分化培養(yǎng)基中，4周后愈傷組織分化出不定芽(圖2，K)；將不定芽轉(zhuǎn)移至不含植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的MS固體培養(yǎng)基中(圖2，L)，10 d左右不定芽開(kāi)始生根(圖2，M)；經(jīng)煉苗后，將再生苗移栽至土壤基質(zhì)中，再生苗可正常生長(zhǎng)(圖2，N)。

2.6 遺傳穩(wěn)定性分析

2.6.1 ISSR分子檢測(cè)對(duì)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)并分析。只對(duì)清晰條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，UBC824引物在黑果枸杞親本植株和原生質(zhì)體再生植株中共擴(kuò)增出7條譜帶，其中多態(tài)性譜帶為2條(圖3，A)；UBC834引物在黑果枸杞親本植株和原生質(zhì)體再生植株中共擴(kuò)增出9條譜帶，多態(tài)性譜帶有3條(圖3，B)。經(jīng)計(jì)算，6株再生植株與親本植株之間的遺傳相似系數(shù)在0.815～0.929之間，平均遺傳相似系數(shù)為0.875，說(shuō)明由原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得的再生植株能較好地保持親本的遺傳性狀。

表4 不同甘露醇濃度下原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力

表5 不同培養(yǎng)條件原生質(zhì)體培養(yǎng)

A. 黑果枸杞原生質(zhì)體；B. FDA活力檢測(cè)；C. 葉片愈傷組織游離的原生質(zhì)體；D. 第一次細(xì)胞分裂；E. 第二次細(xì)胞分裂；F. 第三次細(xì)胞分裂；G. 細(xì)胞團(tuán)的形成；H. 小愈傷組織的形成；I. 轉(zhuǎn)移至固體培養(yǎng)基中的愈傷組織；J. 生長(zhǎng)30 d的愈傷組織；K. 愈傷組織分化出不定芽；L. 原生質(zhì)體再生植株；M. 再生植株生根；N. 移栽后正常生長(zhǎng)的再生植株圖2 黑果枸杞原生質(zhì)體的培養(yǎng)A. Protoplast of L. ruthenicum；B. Viability of freshly isolated protoplasts stained by FDA；C. Protoplast derived from leaf calli；D. The first cell division；E. The second cell division；F. The third cell division；G. Microcolony formation；H. Micro-calli formation；I. Regenerating calli transferred to the solid medium；J. Regenerating calli grown for 30 days；K. Adventitious buds differentiated by regenerating calli；L. Complete regenerated plant from protoplasts；M. Rooting of regenerated plant；N. Regenerated plants normal grow after transplantingFig.2 Protoplast culture of L. ruthenicum

A. 引物UBC824；B.引物UBC834；M. DL5000；Q. 黑果枸杞(親本植株)；1-6. 由原生質(zhì)體培養(yǎng)獲得的再生植株圖3 野生黑果枸杞ISSR檢測(cè)結(jié)果A. Primer UBC824；B. Primer UBC834；M. DL5000；Q. L. ruthenicum (parent plant)；1-6. Regenerated plant from protoplast cultureFig.3 ISSR results of L. ruthenicum

A. 親本植株(參照樣本)；B. 原生質(zhì)體再生植株圖4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果A. Parental plant (control sample)；B. Regenerated plant of L. ruthenicumFig.4 Flow cytometry test results

2.6.2 流式細(xì)胞檢測(cè)根據(jù)流式細(xì)胞儀檢測(cè)原理，峰的平均熒光強(qiáng)度可以反映細(xì)胞核中DNA總量的變化。結(jié)果顯示，原生質(zhì)體再生植株的熒光均值為2 294 178.3，變異系數(shù)為5.67；而親本植株的熒光均值為2 387 634.8，變異系數(shù)為4.55。通過(guò)計(jì)算可知，原生質(zhì)體再生植株為二倍體，與親本植株相同，在倍性上沒(méi)有發(fā)生改變(圖4)。

3 討 論

制備原生質(zhì)體的材料來(lái)源是影響原生質(zhì)體培養(yǎng)成功的關(guān)鍵因素。目前，懸浮培養(yǎng)或愈傷組織培養(yǎng)最為廣泛，相比之下，愈傷組織是建立高效原生質(zhì)體分離體系的必要條件，而懸浮培養(yǎng)具有較高的胚胎發(fā)生能力，是極好的原生質(zhì)體來(lái)源，但實(shí)驗(yàn)條件要求嚴(yán)格，耗時(shí)耗力。Li等[22]首次成功建立油茶(Camelliaoleifera)懸浮培養(yǎng)的原生質(zhì)體分離方法時(shí)是在高質(zhì)量的愈傷組織基礎(chǔ)上進(jìn)行的，Taylor等[23]發(fā)現(xiàn)一些品種的懸浮培養(yǎng)周期甚至達(dá)到10～14周，而且并不一定會(huì)獲得再生植株。本研究利用不同外植體誘導(dǎo)愈傷組織，在此基礎(chǔ)上直接分離原生質(zhì)體，既縮短了培養(yǎng)周期，也簡(jiǎn)便了培養(yǎng)方法，而且能獲得高產(chǎn)高效的原生質(zhì)體細(xì)胞，是一種更加快捷高效的培養(yǎng)體系。另外，較植物本身而言，葉片組織是能夠釋放大量原生質(zhì)體的寶貴材料，在原生質(zhì)體培養(yǎng)初期為細(xì)胞密度、再生愈傷組織形成等都具有一定的貢獻(xiàn)。舒小娟等[24]分離葡萄(VitisviniferaL.cv.‘Heixiangjiao’)原生質(zhì)體時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片愈傷組織來(lái)源的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力都較高；Chand等[25]分離龍葵(Solanumdulcamara)原生質(zhì)體時(shí)也得出一致結(jié)論，并發(fā)現(xiàn)繼代3次的葉片愈傷組織產(chǎn)量和活力最高；本研究對(duì)比了3種不同外植體的愈傷組織，同樣發(fā)現(xiàn)葉片愈傷組織是分離優(yōu)質(zhì)原生質(zhì)體的最佳材料來(lái)源，且繼代1次后的葉片愈傷組織產(chǎn)量和活力最高，隨著繼代次數(shù)的增加，游離得到的原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力逐漸降低。因此，推測(cè)愈傷組織繼代次數(shù)可影響原生質(zhì)體產(chǎn)量和活力變化，未經(jīng)繼代的初始愈傷組織因存在外植體，其愈傷組織形態(tài)多變且穩(wěn)定性較差，對(duì)原生質(zhì)體純化及培養(yǎng)形成干擾，初始愈傷組織經(jīng)過(guò)1～3次繼代后逐漸穩(wěn)定，且指數(shù)生長(zhǎng)期階段的愈傷組織正處于細(xì)胞分裂旺盛期，選取該階段愈傷組織可大大提高原生質(zhì)體的產(chǎn)量和活力，但二者存在的正相關(guān)關(guān)系還有待進(jìn)一步研究證明。

原生質(zhì)體培養(yǎng)的另一個(gè)關(guān)鍵因素是培養(yǎng)方法與培養(yǎng)基的選擇。Borgato等[26]發(fā)現(xiàn)利用液體淺層直接培養(yǎng)時(shí)，原生質(zhì)體細(xì)胞壁無(wú)法再生和分裂。本研究發(fā)現(xiàn)液體淺層培養(yǎng)黑果枸杞原生質(zhì)體時(shí)，細(xì)胞大多聚集于培養(yǎng)皿周圍，細(xì)胞團(tuán)形成率相對(duì)較低，且易褐化、易污染。Yang等[27]認(rèn)為雙層培養(yǎng)體系是棉原生質(zhì)體培養(yǎng)的最佳方法。本研究以固液雙層的培養(yǎng)方法，讓原生質(zhì)體在既含有液體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分的同時(shí)又能吸收到固體培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，同時(shí)又將次生代謝物被固體培養(yǎng)基所吸附，不僅迅速提高了原生質(zhì)體第一次分裂時(shí)間，降低了褐化程度，而且增加了細(xì)胞的透氣性，培養(yǎng)效果優(yōu)于單一液體淺層培養(yǎng)的方式。培養(yǎng)基成分對(duì)原生質(zhì)體培養(yǎng)時(shí)的細(xì)胞分裂水平起關(guān)鍵作用[28]，決定了離體細(xì)胞能否持續(xù)分裂并生長(zhǎng)[29]。Xu Ziqin等[30]發(fā)現(xiàn)無(wú)機(jī)鹽濃度過(guò)高后原生質(zhì)體在培養(yǎng)時(shí)出現(xiàn)嚴(yán)重褐變現(xiàn)象；Zhao Kongnan等[29]研究蕓苔屬(Brassica)原生質(zhì)體時(shí)提出，添加過(guò)多氨基酸以及核苷酸等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)并不一定會(huì)引起原生質(zhì)體的高頻率分裂，反而容易引起褐變，因此認(rèn)為改良MS培養(yǎng)基是大多數(shù)蕓苔屬原生質(zhì)體培養(yǎng)的最佳培養(yǎng)基；本研究利用MS1和MS2培養(yǎng)基(表1)培養(yǎng)黑果枸杞原生質(zhì)體時(shí)改變了培養(yǎng)基成分，適量添加谷氨酰胺、葡萄糖等成分參與蛋白質(zhì)合成及細(xì)胞代謝，有效降低了原生質(zhì)體褐化，但本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)過(guò)培養(yǎng)的原生質(zhì)體分裂率保持在最高水平的狀態(tài)下時(shí)其細(xì)胞團(tuán)形成率卻呈現(xiàn)較低水平，這可能與MS2培養(yǎng)基中添加的成分有很大關(guān)系，猜測(cè)黑果枸杞原生質(zhì)體第一次分裂時(shí)間、培養(yǎng)后的分裂率及細(xì)胞團(tuán)形成率都可能受MS2培養(yǎng)基成分的影響。

植物由親本到再生的整個(gè)過(guò)程中遺傳的完整性也十分關(guān)鍵，微小的突變很可能造成植株的遺傳變異[31]。Irene等[32]、Karp等[33]檢測(cè)原生質(zhì)體培養(yǎng)過(guò)程中各階段DNA含量時(shí)發(fā)現(xiàn)愈傷增殖階段、不定芽再生階段均可能發(fā)生變異。本研究通過(guò)ISSR以及FCM技術(shù)分析再生植株時(shí)并未發(fā)現(xiàn)明顯變異現(xiàn)象，再生植株在遺傳相似系數(shù)以及倍性檢測(cè)中均與親本保持一致，但值得注意的是，高思丹等[21]研究黑果枸杞葉片再生植株時(shí)發(fā)現(xiàn)葉片再生植株與親本植株在DNA總量上表現(xiàn)出差異，這一現(xiàn)象在本研究結(jié)果中也有體現(xiàn)，推測(cè)是造成ISSR條帶部分增加或缺失的原因之一。植物體細(xì)胞發(fā)生變異一方面可培育產(chǎn)生新品種，另一方面為遺傳穩(wěn)定性研究增加困難。遺傳穩(wěn)定性研究常見(jiàn)的有ISSR、FCM等技術(shù)，ISSR技術(shù)在小麥(TriticumaestivumL.)、水稻(OryzasativaL.)、辣椒(CapsicumannuumL.)等多個(gè)品種的遺傳鑒定中都發(fā)揮出重要作用[34]，F(xiàn)CM技術(shù)可清楚地體現(xiàn)親本植株與再生植株之間遺傳倍性的穩(wěn)定性水平，可靠且快速，Jedrzejczyk等[35]、Faisal等[36]在鑒定遺傳穩(wěn)定性時(shí)都用到該方法。本研究以這兩種為主要鑒定方法，發(fā)現(xiàn)黑果枸杞再生植株與親本植株之間有不明顯差異，再生植株由原生質(zhì)體生長(zhǎng)為完整植株的過(guò)程中，需經(jīng)過(guò)細(xì)胞培養(yǎng)、愈傷形成以及不定芽產(chǎn)生等，這一系列過(guò)程都需要激素誘導(dǎo)，上述提到細(xì)胞在愈傷增殖階段以及不定芽再生階段都可能發(fā)生變異，因此產(chǎn)生這一結(jié)果可能的原因有多種，是植物激素的相互作用還是培養(yǎng)過(guò)程中植株本身存在的變異，需要利用細(xì)胞、分子等手段進(jìn)一步研究。