電針足三里對小鼠術(shù)后腸麻痹及線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

袁 偉，李巖松，楊亞男，張廣建，劉 昌，王 強(qiáng)

(西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院,陜西 西安 710061)

腸麻痹為術(shù)后腸道動力障礙相關(guān)疾病，是術(shù)后最常見的并發(fā)癥之一，其中腹部相關(guān)手術(shù)引起腸麻痹發(fā)生的頻率最高，障礙持續(xù)時間最長[1]。術(shù)后腸麻痹可延遲術(shù)后恢復(fù)，延長住院時間，增加病死率。目前對術(shù)后腸麻痹尚無療效確切的西醫(yī)療法，多主張保守治療，但效果并不明顯。而大量涌現(xiàn)的中藥療法，鑒于術(shù)后腸麻痹患者常處于腸外營養(yǎng)支持狀態(tài)，故不具有可操作性。針灸是祖國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)瑰寶，2016年中國中醫(yī)科學(xué)院首席研究員、世界針灸學(xué)會聯(lián)合會主席劉保延教授的研究團(tuán)隊的多中心、隨機(jī)對照研究證實電針干預(yù)能夠治療便秘，改善腸動力[2]。以往研究證實氧化應(yīng)激介導(dǎo)的線粒體功能障礙和核DNA損傷會導(dǎo)致不穩(wěn)定的細(xì)胞氧化還原狀態(tài)，這可能與腹部大手術(shù)后胃腸道動力不足有關(guān)[3-4]。鑒于此，本實驗采用術(shù)后腸麻痹小鼠模型，基于線粒體功能探討了電針對術(shù)后腸麻痹腸動力減低的保護(hù)作用及其機(jī)制，旨在為臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料與方法

1.1實驗動物 雄性C57BL/6小鼠30只，體重18～25 g，空軍軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心提供，合格證號：SCXK 2007-001。實驗室內(nèi)溫度恒定在22～24 ℃，濕度恒定在55%～70%，保持動物實驗室通風(fēng)換氣和整潔干凈。

1.2主要試劑與設(shè)備 Nrf-1抗體、TFAM抗體、 COX-Ⅳ抗體(Genetex公司，美國)，HRP山羊抗兔 IgG( Genetex公司，美國)，JC-1 試劑液(Sigma，USA)，熒光顯微鏡(Olympus 公司，日本)，透射電鏡(日立 H7500 TEM)，華佗牌SD-Ⅱ型電子針療儀(蘇州醫(yī)療用品有限公司)，DW2000動物人工呼吸機(jī)(上海益聯(lián)科教設(shè)備公司)。

1.3實驗方法 將30只C57BL/6小鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、電針組，每組10只。參考文獻(xiàn)[5]使用擠壓法進(jìn)行術(shù)后腸麻痹造模：術(shù)前12 h禁食禁水，腹腔內(nèi)注射1%戊巴比妥鈉35 mg/kg麻醉后，腹部正中切口約3 cm 進(jìn)腹，假手術(shù)組僅打開腹腔；模型組和電針組將整個小腸放在潮濕的紗布墊上，用2個無菌濕潤的棉花施用器對Treitz韌帶到回盲部腸腔進(jìn)行壓迫，要求動作輕柔，不能觸摸腸系膜，持續(xù)壓迫15 min后將腸道放回腹腔中，并使用2層連續(xù)縫合線將切口封閉。小鼠術(shù)后在加熱的恢復(fù)籠中進(jìn)行麻醉恢復(fù)，在12 h內(nèi)可以自由獲取水和鼠食。術(shù)后24 h開始，電針組參考《實驗針灸學(xué)》[6]選取雙側(cè)足三里穴(后肢脛骨粗隆外側(cè)至踝間上1/5處，即腓骨頭下約0.5 cm 處)進(jìn)行電針干預(yù)，具體操作：用1%～2%異氟醚麻醉誘導(dǎo)后，以0.5%～0.8%異氟醚進(jìn)行麻醉維持，采用2 Hz/10 Hz 疏密波、強(qiáng)度1 mA進(jìn)行電針刺激，30 min/d ，連續(xù)5 d。

1.4檢測指標(biāo)及方法

1.4.1腸動力檢測 ①結(jié)腸排珠時間：在肛門塞入直徑為2 mm的玻璃珠，用定制的覆蓋硅管的套管輕輕推入2 cm ，觀察玻璃珠排出時間。②腸運(yùn)輸時間：小鼠灌胃100 μL伊文氏藍(lán)甲基纖維素溶液，分籠飼養(yǎng)，籠中鋪白布觀察藍(lán)色物質(zhì)排出時間。以第1次出現(xiàn)藍(lán)色糞便為終點(diǎn)，每只小鼠觀察8 h。③排泄物分析：小鼠分籠飼養(yǎng)，收集小鼠10:00—11:00排泄物，稱重，然后將排泄物放入60 ℃烤箱過夜后記錄干重，計算糞便液體百分比，連續(xù)3 d記錄均值。

1.4.2腸神經(jīng)線粒體形態(tài)、數(shù)量和體積 取2 cm×0.5 mm回盲部遠(yuǎn)端2 cm處結(jié)腸，固定、脫水、包埋、固化后超薄切片機(jī)震動切片60 nm，進(jìn)行鉛鈾染色，經(jīng)半薄層定位在光鏡下定位腸道環(huán)形肌和縱行肌之間的腸道神經(jīng)節(jié)，薄層切片，使用透射電鏡觀察形態(tài)，采用點(diǎn)數(shù)法測量線粒體的結(jié)構(gòu)參數(shù)，以細(xì)胞立體學(xué)定量法計算數(shù)密度、平均體積[7]。

1.4.3腸神經(jīng)線粒體功能

1.4.3.1線粒體制備 將小腸置于冰水浴中，全程低溫操作。組織勻漿后收集上清液， 4 ℃下800×g離心5 min，將上清液轉(zhuǎn)移到新離心管，在4 ℃下12 000×g離心10 min，離心后的上清液含胞漿成分，線粒體即沉淀在管底，轉(zhuǎn)移上清液。洗滌線粒體后加入0.2 mL Mito-Cyto Buffer重懸線粒體沉淀， 離心棄上清。用 Mito-Cyto Buffer反應(yīng)緩沖液重懸線粒體沉淀，達(dá)到50 μL/100 mg 組織后測定蛋白濃度，或-70 ℃保存。

1.4.3.2線粒體膜電位檢測 將各組線粒體懸液和JC-1工作液在37 ℃下孵育15 min,2 000 r/min 離心(離心半徑13.5 cm)5 min,棄上清, 用緩沖液重新懸浮。采用激光共聚焦顯微鏡(Lecia Tcs SP2,Germen)觀察線粒體膜電位變化。在線粒體膜電位較高時，JC-1聚集在線粒體的基質(zhì)中，形成聚合物，產(chǎn)生紅色熒光；在線粒體膜電位較低時，JC-1不能聚集在線粒體的基質(zhì)中，此時JC-1為單體，產(chǎn)生綠色熒光。通過熒光顏色的轉(zhuǎn)變檢測線粒體膜電位的變化。

1.4.3.3線粒體ATP含量測定 采用螢火蟲熒光素酶催化熒光素發(fā)光法檢測線粒體ATP含量,將ATP標(biāo)準(zhǔn)溶液用ATP檢測裂解液按200，100，50，25，12.5，6.25，0 μmol/L 濃度梯度稀釋，加100 μL到檢測管內(nèi)，加入10 μL熒光素酶溶液，以6 s發(fā)光強(qiáng)度積分值的對數(shù)為縱坐標(biāo)，ATP濃度的對數(shù)為橫坐標(biāo)，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。在200 μL 反應(yīng)介質(zhì)中依次加入0.05 mg 線粒體和20 μmol/L螢光素酶，記錄本底發(fā)光強(qiáng)度，然后加入4 μmol/L ADP啟動反應(yīng)，6 s后記錄發(fā)光強(qiáng)度，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算ATP含量。

1.4.4腸神經(jīng)線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)情況Western blot法檢測Nrf-1、TFAM和COX-Ⅳ蛋白表達(dá)情況：取出制備好的組織標(biāo)本，按說明加入適當(dāng)裂解液和蛋白質(zhì)抑制劑，冰上研磨勻漿，使用T hermo BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量。根據(jù)分子量大小，制備12%分離凝膠、5%濃縮膠，上層膠電壓80 V、下層膠電壓120 V電泳，300 mA恒流轉(zhuǎn)膜2 h。封閉2 h后孵育一抗(Nrf-1，1∶500；TFAM,1∶2 000;COX-IV,1∶3 000;β-actin，1∶5 000)，4 ℃搖床中過夜，室溫孵育二抗(羊抗兔，1∶10 000)2 h。ECL顯色后曝光顯影，以目標(biāo)蛋白與β-actin的積分灰度值比值作為目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié) 果

2.1各組小鼠腸動力比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠結(jié)腸排珠時間、腸運(yùn)輸時間均明顯延長(P均<0.05)，糞便干重明顯降低(P<0.05)，糞便液體百分比明顯增高(P<0.05)；與模型組比較，電針組小鼠結(jié)腸排珠時間、腸運(yùn)輸時間明顯縮短(P均<0.05)，糞便干重增加(P<0.05)，糞便液體百分比減少(P<0.05)。見表1。

表1 假手術(shù)組和術(shù)后腸麻痹各組小鼠腸動力比較

2.2各組小鼠腸神經(jīng)元線粒體形態(tài) 透射電鏡下觀察，假手術(shù)組小鼠線粒體大小基本正常，基質(zhì)均勻，邊界及結(jié)構(gòu)清晰，線粒體的嵴致密飽滿，未見明顯的線粒體腫脹及空泡樣改變；模型組小鼠線粒體數(shù)量明顯減少，大小不一、無規(guī)律，形態(tài)不規(guī)整，排列不規(guī)則，邊界不清，線粒體大部分有明顯的腫脹和空泡樣變性，基質(zhì)不均勻，結(jié)構(gòu)模糊，腫脹的線粒體嵴有較明顯的斷裂；電針組小鼠線粒體損傷明顯輕于模型組。見圖1。

圖1 透射電鏡觀察假手術(shù)組和術(shù)后腸麻痹各組小鼠腸神經(jīng)元線粒體形態(tài)(×4 000)

2.3各組小鼠小腸肌間神經(jīng)叢腸神經(jīng)元線粒體數(shù)量和體積比較 與假手術(shù)組比較，模型組小鼠線粒體數(shù)量明顯減少(P<0.05)，線粒體體積明顯增大(P<0.05)；與模型組比較，電針組小鼠線粒體數(shù)量明顯增加(P<0.05)，線粒體體積明顯縮小(P<0.05)。見表2。

表2 假手術(shù)組和術(shù)后腸麻痹各組小鼠透射電鏡下腸神經(jīng)元線粒體數(shù)量和體積比較

2.4各組小鼠線粒體膜電位及ATP含量比較 模型組小鼠線粒體膜電位及線粒體ATP含量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，電針組小鼠線粒體膜電位及線粒體ATP含量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表3。

表3 假手術(shù)組和術(shù)后腸麻痹各組小鼠線粒體膜電位及ATP含量比較

2.5各組小鼠線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白表達(dá)情況比較 模型組小鼠線粒體中Nrf-1、TFAM和COX-Ⅳ蛋白相對表達(dá)量均明顯低于假手術(shù)組(P均<0.05)，電針組小鼠線粒體中Nrf-1、TFAM和COX-Ⅳ蛋白相對表達(dá)量均明顯高于模型組(P均<0.05)。見表4。

表4 假手術(shù)組和術(shù)后腸麻痹各組小鼠線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白相對表達(dá)量比較

3 討 論

術(shù)后腸麻痹指整個消化道的協(xié)調(diào)運(yùn)動出現(xiàn)延遲，表現(xiàn)為不同程度的腹脹和腸鳴音消失，造成大量分泌物和氣體聚集，出現(xiàn)惡心、嘔吐、腹脹和腹痛等癥狀，重者可持續(xù)數(shù)天到數(shù)周，麻痹持續(xù)3 d以上進(jìn)展為麻痹性腸梗阻，病死率劇增。術(shù)后腸麻痹還增加了患者醫(yī)院獲得性感染和深靜脈血栓形成的風(fēng)險，另外腸功能異常者免疫力下降，易導(dǎo)致細(xì)菌及內(nèi)毒素移位，發(fā)生系統(tǒng)性炎癥反應(yīng)綜合征，更嚴(yán)重者會出現(xiàn)多器官功能障礙，威脅生命。因此，改善術(shù)后腸麻痹有重要意義。

目前術(shù)后腸麻痹的發(fā)病機(jī)制并不明確，可能為多因素共同作用的結(jié)果，臨床上缺乏行之有效的確切治療方法，仍然是臨床治療的難點(diǎn)。中醫(yī)認(rèn)為術(shù)后腸麻痹屬“腹脹”“腸結(jié)”的范疇，腸為傳化之腑，司飲食之傳化物，傳化物而不藏，實而不滿。氣機(jī)運(yùn)動主降，以通為用，腹部手術(shù)使臟腑氣機(jī)逆亂，造成氣滯血瘀，痞滿不通，且手術(shù)耗傷津血，患者氣血虧損，血脈空虛，無力推動氣機(jī)運(yùn)行。中醫(yī)治法上強(qiáng)調(diào)“補(bǔ)正為先，稍佐疏導(dǎo)”，多采用補(bǔ)虛行氣之中藥方劑治療，如補(bǔ)中益氣湯、四君子湯、復(fù)方承氣湯等[8]，但效果不理想，并且在循證醫(yī)學(xué)的支持下，很多傳統(tǒng)治療術(shù)后腸麻痹的中藥方法已被證實無效。

針灸療法是中醫(yī)學(xué)中重要而又獨(dú)具特色的治療疾病的方法，經(jīng)過多年的經(jīng)驗總結(jié)，已經(jīng)得出系統(tǒng)的理論體系。電針療法源自于針灸療法，且相對于針灸療法具有可重復(fù)性。眾多研究表明應(yīng)用電針足三里治療胃腸動力障礙具有不良反應(yīng)少且療效較好等優(yōu)勢。足三里為足陽明胃經(jīng)的合穴，是調(diào)整胃腸功能的要穴，有疏通經(jīng)絡(luò)作用，并可調(diào)節(jié)脾胃之清濁、氣機(jī)之升降、陰陽之協(xié)調(diào)而使大便自通，毒邪隨之而去，同時具有扶正培元之功效。張立儉等[9]和王磊等[10]研究發(fā)現(xiàn)電針足三里通過調(diào)節(jié)胃腸激素分泌、改善胃腸黏膜的血液循環(huán)等多個環(huán)節(jié)改善胃腸道黏膜屏障。Ng等[11]研究報道，電針足三里、三陰交、合谷、支溝穴可縮短結(jié)直腸癌腹腔鏡手術(shù)患者術(shù)后腸梗阻的持續(xù)時間。Hsiung等[12]報道，胃癌術(shù)后電針胃腸經(jīng)的足三里穴及心包經(jīng)的內(nèi)關(guān)穴，能夠明顯縮短術(shù)后首次排氣時間。 Liu等[13]隨機(jī)對照研究證實，在全麻下進(jìn)行肝臟和血管外科手術(shù)前電針內(nèi)關(guān)、足三里、下巨虛，能明顯縮短術(shù)后首次排氣、排便時間及住院時間。本實驗結(jié)果顯示，電針能縮短術(shù)后腸麻痹小鼠結(jié)腸排珠時間和腸運(yùn)輸時間，增加糞便干重，降低糞便的干濕比，能夠改善結(jié)腸動力及吸收水分的能力。

線粒體是機(jī)體能量的供應(yīng)站，細(xì)胞活動所需要的能量的95%由線粒體氧化磷酸化產(chǎn)生的ATP提供[14]。線粒體的結(jié)構(gòu)和功能不僅僅對細(xì)胞、乃至對整個機(jī)體的正常運(yùn)轉(zhuǎn)都具有重大意義。線粒體在多種疾病的發(fā)病過程中扮演著重要的角色，其正常形態(tài)及功能需要線粒體生物合成、線粒體融合分裂、運(yùn)動和自噬的動態(tài)平衡來維持[15]。當(dāng)線粒體受損時，線粒體生物功能發(fā)生障礙，導(dǎo)致細(xì)胞功能異常，影響機(jī)體器官及活動。 Chen等[16]研究發(fā)現(xiàn)，術(shù)后腸麻痹發(fā)生后，ROS含量和MDA含量增加，線粒體腫脹、變性，線粒體這種超微結(jié)構(gòu)的退行性變化可能與胃腸動力障礙有關(guān)。另有研究證實，棕櫚酸可通過線粒體損傷降低腸神經(jīng)元細(xì)胞活力，其誘導(dǎo)的腸神經(jīng)元丟失可能導(dǎo)致腸道運(yùn)輸延遲[17]，同時線粒體膜電位降低，ATP產(chǎn)生減少，呼吸復(fù)合物活性表達(dá)減少，解耦聯(lián)增加，線粒體的抗氧化能力和線粒體DNA 含量也會減少，生物發(fā)生現(xiàn)象受影響[18]。本實驗結(jié)果顯示，術(shù)后腸麻痹模型組線粒體數(shù)量減少，纖維排列紊亂，肌絲斷裂，線粒體腫脹、嵴斷裂，其內(nèi)部形成囊泡，線粒體膜電位和ATP含量較假手術(shù)組明顯降低；電針組線粒體數(shù)量增加，形態(tài)改善，線粒體膜電位和ATP含量增加。說明術(shù)后腸麻痹可導(dǎo)致線粒體損傷，電針能夠改善術(shù)后腸麻痹時線粒體能量代謝障礙。線粒體的生物發(fā)生是指線粒體的生長和分裂，包括核基因組編碼的蛋白質(zhì)的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)、線粒體DNA 復(fù)制、線粒體基因組編碼的蛋白質(zhì)合成和核聚變裂變等過程[19]。線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白分子Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ主要參與調(diào)節(jié)線粒體生物發(fā)生[20]，線粒體的生物發(fā)生現(xiàn)象目的是恢復(fù)線粒體功能。Nrf-1有誘導(dǎo)線粒體基因轉(zhuǎn)錄的作用，與編碼呼吸亞基的基因啟動子、線粒體轉(zhuǎn)錄因子TFAM和TFBs結(jié)合，共同調(diào)節(jié)線粒體轉(zhuǎn)錄，是調(diào)控線粒體電子傳遞鏈功能的關(guān)鍵因子。TFAM也是體內(nèi)決定線粒體基因是否開始轉(zhuǎn)錄的關(guān)鍵調(diào)控因子，對線粒體生物發(fā)生和胚胎發(fā)育至關(guān)重要，并對線粒體 DNA 復(fù)制的數(shù)量、組裝等過程起著調(diào)節(jié)作用。故上調(diào) Nrf-1和TFAM有助于促進(jìn)線粒體的生物發(fā)生。本實驗結(jié)果顯示，模型組Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ蛋白相對表達(dá)量明顯低于假手術(shù)組,電針組Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ蛋白相對表達(dá)量明顯高于模型組，提示電針可能通過促進(jìn)線粒體生物發(fā)生而改善線粒體功能。

綜上所述，電針可能通過上調(diào)腸神經(jīng)元線粒體生物發(fā)生相關(guān)蛋白Nrf-1、TFAM、COX-Ⅳ的表達(dá)，改善線粒體能量代謝障礙而增強(qiáng)術(shù)后腸麻痹小鼠的腸動力。本研究不僅有助于深入探討術(shù)后腸麻痹的發(fā)生機(jī)制，也為預(yù)防和治療術(shù)后腸麻痹提供了新的思路及治療靶點(diǎn)。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突。