高濃度中藥廢水降解微生物的篩選及其效果

尚家澄，吳麗紅，馬思揚(yáng)，邵 楠

(遼寧科技學(xué)院 生物醫(yī)藥與化學(xué)工程學(xué)院，遼寧 本溪117002)

近年來(lái)，隨著人們對(duì)天然藥物療效認(rèn)識(shí)程度的提高，中藥制藥行業(yè)得到了迅猛發(fā)展，隨之大量的中藥生產(chǎn)廢水需要處理。中藥廢水有機(jī)污染物濃度高，根據(jù)中藥原材料及生產(chǎn)工藝不同，其廢水成分復(fù)雜且水質(zhì)水量變化較大，廢水的可生化性較好。目前，我國(guó)關(guān)于中藥廢水的處理技術(shù)報(bào)道得不多，許多研究停留于實(shí)驗(yàn)室小試階段〔1-2〕。

中藥廢水的基本處理方法分三類：物化法、生物法和物化-生物法〔3〕。用物化法處理中藥廢水的成本高，勞動(dòng)強(qiáng)度大，極易引起二次污染，是一種高投入低產(chǎn)出的方法。生物處理方法就是利用微生物的新陳代謝功能，使廢水中呈溶解和膠體狀態(tài)的有機(jī)污染物被降解并轉(zhuǎn)化為無(wú)害的物質(zhì)，使廢水得以凈化。常用的生物處理方法有厭氧生物處理工藝、好氧生物處理工藝、厭氧-好氧工藝和水解(酸化)-好氧工藝等。物化-生物處理法是以生物處理法為主體處理工藝，物化處理法為預(yù)處理或后處理的工藝。

在現(xiàn)有污水處理系統(tǒng)基礎(chǔ)上結(jié)合生物強(qiáng)化技術(shù)向廢水處理系統(tǒng)中投加功能微生物菌劑，可以進(jìn)一步提高難降解有機(jī)污染物的處理效率〔4-5〕，獲得用于投加系統(tǒng)的高效菌種是進(jìn)行生物強(qiáng)化技術(shù)的關(guān)鍵點(diǎn)〔6〕，菌種可以是單一菌種也可以是復(fù)合菌種，可以從污水處理系統(tǒng)中篩選獲得，也可以外源添加，最終目的是提高系統(tǒng)的污染物處理能力。

為了提高中藥廢水的處理效果，本試驗(yàn)針對(duì)中藥廢水的特點(diǎn)在傳統(tǒng)單一生物處理工藝基礎(chǔ)上開發(fā)了一體化廢水處理裝置(水解酸化+接觸氧化+BAF)，本試驗(yàn)從穩(wěn)定運(yùn)行的處理中藥廢水的一體化裝置水解酸化段和接觸氧化段定向分離篩選功能菌，以CODcr為考察指標(biāo)，通過對(duì)CODcr的處理能力考察目的功能菌對(duì)高濃度中藥廢水的降解效果，獲得中藥廢水處理高效菌種，以便為生物強(qiáng)化處理中藥廢水提供菌源，從而在實(shí)際工藝中達(dá)到快速啟動(dòng)反應(yīng)器，縮短污泥適應(yīng)期，進(jìn)而在工藝運(yùn)行過程中獲得高效穩(wěn)定的運(yùn)行效果。

1 試驗(yàn)方法

1.1 菌種來(lái)源

本試驗(yàn)過程中分離篩選菌種來(lái)源于穩(wěn)定運(yùn)行的中藥廢水處理一體化處理裝置(水解酸化+接觸氧化+BAF)的水解酸化段和接觸氧化段，該裝置水解酸化段是將廢水中難降解大分子有機(jī)物轉(zhuǎn)化為小分子有機(jī)物，利于后續(xù)工藝中微生物對(duì)有機(jī)物的降解與轉(zhuǎn)化；生物接觸氧化池屬于生物膜法去除系統(tǒng)中的有機(jī)物，并具有反硝化脫氮作用；曝氣生物濾池(BAF)集生物接觸氧化與懸浮物濾床截留功能于一體，可有效去除水中的懸浮物、氨氮、有機(jī)物。實(shí)際運(yùn)行過程中，裝置對(duì)中藥廢水(1∶1稀釋)COD有較好的去除效果，但還達(dá)不到直接處理原水(COD在6 000 mg/L～8 000 mg/L范圍內(nèi))的能力，所以結(jié)合生物強(qiáng)化法可以進(jìn)一步提高系統(tǒng)的污染物去除效果，以達(dá)到直接處理原水達(dá)標(biāo)排放的目的。

本試驗(yàn)取一體化處理裝置的水解酸化段和接觸氧化段活性污泥混合液進(jìn)行高濃度COD降解功能菌的篩選。

1.2 中藥廢水原水水質(zhì)

工藝運(yùn)行所用的中藥廢水取自遼寧省本溪市藥都某中藥廠。原水水質(zhì)隨生產(chǎn)周期有一定的波動(dòng)性，COD：6 000 mg/L～8 000 mg/L，BOD5：2 500 mg/L～4 000 mg/L，氨氮：20 mg/L～30 mg/L，pH值7～9。COD采用COD快速測(cè)定儀測(cè)定，BOD5采用五日培養(yǎng)法。

1.3 COD降解菌的分離、純化與篩選

1.3.1 培養(yǎng)基〔7〕

(1)富集培養(yǎng)基(葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基)：6.0 g葡萄糖，2.0 g蛋白胨，1.0 g KH2PO4，1.0 g MgSO4·7H2O，1 000 mL蒸餾水pH值7.2～7.5，121 ℃高壓滅菌20 min。

(2)馴化選擇培養(yǎng)基：3.0 g(NH4)2SO4，0.5 g Na2HPO4，0.5 g KH2PO4，0.2 g MgSO4·7H2O，微量元素1 mL，pH值7.2～7.5，1 000 mL水(中藥廢水比例按梯度馴化逐漸提高，直到與原污水濃度相同為止)，121 ℃高壓滅菌20 min。其中微量元素：0.5 g FeSO4·7H2O，0.2 g CaCl2·2H2O，0.15 g MnSO4·7H2O，0.15 g ZnSO4，1 000 mL蒸餾水。

(3)菌種分離培養(yǎng)基：在馴化培養(yǎng)基中加入15 g-20 g瓊脂，用中藥廢水代替蒸餾水，其他條件與馴化選擇培養(yǎng)基相同。

馴化培養(yǎng)基與菌種分離培養(yǎng)基中均不外加碳源，碳源完全由中藥廢水中的有機(jī)物提供。

1.3.2 菌種培養(yǎng)

(1)富集培養(yǎng)：分別取水解酸化段和接觸氧化段活性污泥混合液5 mL，接入葡萄糖蛋白胨培養(yǎng)基富集培養(yǎng)基的培養(yǎng)瓶中，在30 ℃，120 r/min條件下振蕩培養(yǎng)，72 h為一個(gè)周期，如此反復(fù)富集三個(gè)周期。

(2)定向選擇馴化培養(yǎng)：將50 mL在1.3.2(1)條件下富集混合菌液接種在1.3.1(2)培養(yǎng)液中，不添加其他外加碳源，以中藥廢水為唯一碳源進(jìn)行恒溫?fù)u床培養(yǎng)，中藥廢水初始添加量為培養(yǎng)液的20%，定時(shí)取樣測(cè)定培養(yǎng)液菌濁(A600 nm)的變化情況。培養(yǎng)基明顯渾濁后，表明菌種適應(yīng)中藥廢水中有機(jī)物的種類與濃度，即可將混合菌液轉(zhuǎn)接于新鮮選擇培養(yǎng)基中，并逐步增加中藥廢水的比例，中藥廢水比例以20%遞增，直到中藥廢水原水濃度相同為止。在馴化過程中，能適應(yīng)該中藥廢水環(huán)境的菌體得以生存且耐受力逐漸得到加強(qiáng)，成為優(yōu)勢(shì)菌，其他菌體則被淘汰。

1.3.3 菌種分離

菌種分離取選擇馴化培養(yǎng)時(shí)中藥廢水最高濃度的混合菌培養(yǎng)液作為菌源，用中藥廢水原水配制的固體選擇培養(yǎng)基進(jìn)行高效有機(jī)物降解目的菌種的分離，無(wú)菌條件下通過平板劃線法反復(fù)分離純化(混合細(xì)菌平板培養(yǎng)—單菌落分離、純化培養(yǎng))。

1.3.4 菌種篩選

將在1.3.3過程中分離得到的不同純菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，然后用高速冷凍離心機(jī)進(jìn)行離心處理，用無(wú)菌水將離心物洗出制備不同菌種的純菌液。純菌液有效活菌數(shù)約為108CFU/mL～109CFU/mL，取等量純菌液接種到裝有200 mL中藥廢水(測(cè)定COD為6 500 mg/L)的培養(yǎng)瓶進(jìn)行搖床培養(yǎng)，每間隔一定的時(shí)間測(cè)定培養(yǎng)液COD濃度，根據(jù)不同純菌種對(duì)中藥廢水COD的降解能力篩選高效菌種。

1.3.5 優(yōu)選菌種的保藏

以無(wú)菌接種環(huán)挑取篩選得到的單菌落接種到滅菌試管斜面上，30 ℃恒溫培養(yǎng)至菌落長(zhǎng)出。置冰箱保存?zhèn)溆?，用于后續(xù)菌種相關(guān)特性研究及生物強(qiáng)化擴(kuò)大培養(yǎng)時(shí)使用。

1.3.6 功能菌株相關(guān)特性研究

對(duì)篩選出的高效菌株進(jìn)行其單一菌種相關(guān)特性研究，進(jìn)行形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)〔7〕。固體培養(yǎng)特征主要考察了菌體形態(tài)、菌落形狀、菌落隆起形狀、菌落邊緣形狀、菌落顏色、菌落透明程度、菌落黏稠度等。染色實(shí)驗(yàn)主要進(jìn)行了革蘭氏染色、芽孢染色、莢膜染色、鞭毛染色等、生理生化實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了需養(yǎng)性試驗(yàn)、葡萄糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)。

2 結(jié)果與討論

2.1 富集培養(yǎng)

富集培養(yǎng)是在適于目標(biāo)微生物生長(zhǎng)的條件下培養(yǎng)，目標(biāo)微生物將成為優(yōu)勢(shì)種而大量生長(zhǎng)從而得到純培養(yǎng)的一種微生物培養(yǎng)方法。經(jīng)富集培養(yǎng)后會(huì)有大量的目標(biāo)微生物增殖，但其他非目標(biāo)微生物也會(huì)大量增殖，所以經(jīng)富集培養(yǎng)后迅速得到渾濁度雜菌培養(yǎng)液。

2.2 梯度選擇培養(yǎng)

選擇培養(yǎng)具有只允許特定的微生物生長(zhǎng)，而同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)的功能。中藥廢水中的高濃度有機(jī)污染物會(huì)抑制普通微生物的生長(zhǎng)，而保留對(duì)難降解有機(jī)物具有降解或耐受能力的菌種。為了分離出對(duì)能夠高效降解高濃度有機(jī)物的功能菌，通過定向馴化培養(yǎng)增強(qiáng)菌種的降解性能。

在中藥廢水比例為20%，即COD濃度為1 000 mg/L～1 500 mg/L范圍內(nèi)培養(yǎng)液迅速渾濁，12 h即可觀察到培養(yǎng)液明顯渾濁，說明在該有機(jī)物濃度下菌種生長(zhǎng)良好，菌種對(duì)該濃度的有機(jī)污染物具有良好的降解能力；當(dāng)中藥廢水比例為40%，即COD濃度為2 000 mg/L～3 000 mg/L范圍內(nèi)，菌種比上一梯度時(shí)生長(zhǎng)適應(yīng)期稍變長(zhǎng)，大概經(jīng)過約20 h后菌濁明顯增加，菌種生長(zhǎng)良好，說明菌種在適應(yīng)該有機(jī)物濃度范圍后也有較好的降解效果；在后續(xù)提高中藥廢水比例的過程中，培養(yǎng)基開始變渾濁的初始時(shí)間越來(lái)越長(zhǎng)，但后期菌種均有一定的生長(zhǎng)，表明隨中藥廢水比例的提高，COD濃度升高，能適應(yīng)高濃度有機(jī)物的微生物種類越來(lái)越少，菌株生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制，但在高濃度中藥廢水中也有相應(yīng)的菌種適應(yīng)環(huán)境，具有一定的污染物降解能力。本試驗(yàn)過程中，當(dāng)廢水濃度提高到與原中藥廢水相同，即不需稀釋時(shí)，經(jīng)36 h后，菌濁度也有明顯提高，表明在該濃度下，微生物能夠生存并降解污染物。理論上，此時(shí)由于高降解能力和耐受性的菌種種類和數(shù)量上均有所減少。

2.3 功能菌分離篩選及其降解效果

在菌種分離固體培養(yǎng)基平板上多次劃線，獲得19株純菌，根據(jù)菌株外觀典型性及對(duì)中藥廢水的去除效果，最終有9株菌具有較強(qiáng)的有機(jī)物降解能力，其中從水解酸化段篩選出5株，分別取代號(hào)為sj1、sj2、sj3、sj4、sj5；從接觸氧化池段篩選出4株，分別取代號(hào)為jc1、jc2、jc3、jc4。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖1、圖2。

在中藥廢水COD濃度均為6 500 mg/L條件下，培養(yǎng)1 d后，各菌株對(duì)有機(jī)物的去除雖有差異，但均有較好的去除效果，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，COD濃度進(jìn)一步降低，最終9株菌的COD去除率均在85%以上。除sj2、sj5、jc1外，其他5種菌4 d后COD降解基本達(dá)到最高，第五天測(cè)定結(jié)果沒有明顯變化，最終COD去除率sj1為87.2%、sj3為89.9%、sj4為87.2%、jc2為85.3%、jc3為88%、jc4為87.7%。而菌株sj2、sj5、jc1第5 d對(duì)COD仍有很好的去除，最終COD去除率分別為97.8%、96.1%和97.3%，對(duì)高濃度中藥廢水有很強(qiáng)的去除效果。兩株水解酸化菌sj2、sj5還有個(gè)共同特點(diǎn)，即一天后并不是9株功能菌中降解有機(jī)物速度最快的，但降解效果持久，最終COD去除效果好。

可以看出，由于中藥廢水進(jìn)水濃度高，雖然功能菌的COD去除率都較高，即便是去除率最高的sj2，COD去除率達(dá)到97.8%，但其出水COD值仍達(dá)140 mg/L左右。所以在廢水處理實(shí)際工藝中水解酸化段必須配合其他好氧工藝才能使出水達(dá)到排放標(biāo)準(zhǔn)。在本實(shí)驗(yàn)實(shí)際運(yùn)行中，一體化處理裝置接觸氧化段的進(jìn)水為水解酸化段的出水，進(jìn)水COD較原水已有明顯降低，如果采用生物強(qiáng)化技術(shù)將從水解酸化段和接觸氧化段分離出的高效功能菌擴(kuò)大培養(yǎng)后分別應(yīng)用于一體化處理裝置的對(duì)應(yīng)處理段，應(yīng)具有很好的出水效果，甚至有可能解放曝氣生物濾池(BAF)段，這樣可以大大減少成本與工藝整體運(yùn)行時(shí)間。

2.4 功能菌形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)

對(duì)篩選出的9菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，結(jié)果見表1。

表1 不同菌株形態(tài)特征及其生理生化試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，查閱微生物鑒定手冊(cè)初步判斷篩選到的9株具有高濃度有機(jī)物降解性能的菌種8株為細(xì)菌，1株為霉菌，具體微生物學(xué)類別還需進(jìn)一步研究后確定。

3 結(jié)論

(1)從穩(wěn)定運(yùn)行的一體化裝置水解酸化段篩選出5株高效COD降解功能菌，接觸氧化段篩選出4株高效COD降解功能菌。在進(jìn)水中藥廢水COD濃度為6 500 mg/L條件下進(jìn)行菌種的污染物降解試驗(yàn)，該9株微生物對(duì)COD的去除率均在85%以上，其中菌株sj2、sj5、jc1 COD降解率分別約為97.8%、96.1%和97.3%，體現(xiàn)出了很強(qiáng)的高濃度有機(jī)物降解能力。

(2)對(duì)9株菌株進(jìn)行了形態(tài)觀察及生理生化試驗(yàn)，判斷8株為細(xì)菌，1株為霉菌，說明真菌在高濃度有機(jī)物降解中也有很好的去除效果。在后續(xù)工作中應(yīng)進(jìn)一步通過分子生物學(xué)手段鑒定菌種，同時(shí)考察優(yōu)勢(shì)菌的有機(jī)物降解特性，為生物強(qiáng)化處理高濃度中藥廢水提供參數(shù)。

(3)在后續(xù)采用生物強(qiáng)化法處理中藥廢水時(shí)，可以按水解酸化段和接觸氧化段分別強(qiáng)化運(yùn)行，不同菌種有針對(duì)性地分別投入不同工藝段會(huì)有更好的應(yīng)用性。