異色瓢蟲(chóng)丙酮酸激酶基因序列分析及其調(diào)控海藻糖代謝功能

葛欣竺，史宇星，王莎莎，劉智慧，蔡文杰，周敏，王世貴，唐斌

杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，杭州 311121

0 引言

【研究意義】相比于使用化學(xué)農(nóng)藥控制害蟲(chóng)，天敵昆蟲(chóng)在控制害蟲(chóng)發(fā)生、防止抗藥性產(chǎn)生、保護(hù)環(huán)境、維持生態(tài)平衡等方面具有明顯優(yōu)勢(shì)。在捕食性瓢蟲(chóng)中，異色瓢蟲(chóng)（Harmonia axyridis）廣泛分布于中國(guó)各地，是一類(lèi)重要的天敵昆蟲(chóng)資源。但對(duì)該物種的開(kāi)發(fā)利用一直受到各種因素的制約，比如人工飼料。昆蟲(chóng)的生長(zhǎng)發(fā)育與能量代謝密切相關(guān)，因此，探究異色瓢蟲(chóng)的能量代謝有助于促進(jìn)天敵昆蟲(chóng)應(yīng)用于害蟲(chóng)防治?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】糖酵解是葡萄糖氧化的主要代謝途徑，為其他途徑提供能量和中間前體。丙酮酸激酶（pyruvate kinase，PYK）能催化磷酸烯醇式丙酮酸轉(zhuǎn)化為烯醇式丙酮酸，并產(chǎn)生ATP[1]。且丙酮酸激酶負(fù)責(zé)調(diào)節(jié)糖酵解和糖異生之間的平衡[2]，因此它是能量代謝過(guò)程中的一個(gè)關(guān)鍵酶。據(jù)報(bào)道，大豆食心蟲(chóng)（Leguminivora glycinivorella）和棉鈴蟲(chóng)（Helicoverpa armigera）在滯育期間體內(nèi)主要的代謝酶為丙酮酸激酶[3-4]。美洲蟑螂（Periplaneta americana）和沙漠蝗（Schistocerca gregaria）的飛行肌肉中丙酮酸激酶的酶促反應(yīng)符合 Michaelis-Menten動(dòng)力學(xué)[5-6]。PAPADOPOULOS等研究發(fā)現(xiàn)，面對(duì)各種生理變化，比如傷害、饑餓、殺蟲(chóng)劑、注射丙酮，黃粉蟲(chóng)（Tenebrio molitor）體內(nèi)丙酮酸激酶的動(dòng)力學(xué)特征發(fā)生變化[7]。丙酮酸激酶作為在糖酵解過(guò)程中催化形成第二個(gè)ATP反應(yīng)的酶，在丙酮酸穩(wěn)態(tài)調(diào)節(jié)和昆蟲(chóng)生命活動(dòng)方面起著重要作用。在昆蟲(chóng)中，海藻糖是一種非還原性的二糖，主要在脂肪體內(nèi)合成，既是一種貯藏性碳水化合物，也是應(yīng)激代謝的重要產(chǎn)物[8]。海藻糖作為昆蟲(chóng)的血糖，其在昆蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育和抵抗逆境方面扮演著重要的角色[9-10]。對(duì)于昆蟲(chóng)，尿苷二磷酸葡萄糖和 6-磷酸葡萄糖首先在海藻糖-6-磷酸合成酶（trehalose-6-phosphate synthase，TPS）的催化下合成 6-磷酸海藻糖，接著在海藻糖-6-磷酸磷酸酯酶（trehalose 6-phosphate phosphatase，TPP）催化下去磷酸化生成海藻糖，該過(guò)程被稱(chēng)為 TPS/TPP途徑[9,11]。海藻糖酶（trehalase，TRE）是昆蟲(chóng)體內(nèi)能夠水解海藻糖的酶類(lèi)，每個(gè)海藻糖分子都可以通過(guò)海藻糖酶水解為兩個(gè)葡萄糖分子[11]。迄今為止，已鑒定出兩種形式的海藻糖酶，分別為可溶性海藻糖酶（TRE1）和在 N-羥基上具有跨膜結(jié)構(gòu)的膜結(jié)合型海藻糖酶（TRE2）[9,12-13]。【本研究切入點(diǎn)】昆蟲(chóng)海藻糖代謝是能量代謝的重要部分，不僅異色瓢蟲(chóng)丙酮酸激酶基因（HaPYK）未見(jiàn)報(bào)道，而且有關(guān)丙酮酸激酶在海藻糖代謝中的功能研究幾乎空白。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】分析異色瓢蟲(chóng) HaPYK的序列特征和結(jié)構(gòu)，進(jìn)一步抑制HaPYK在mRNA水平上的表達(dá)，檢測(cè)對(duì)海藻糖代謝的影響，為理解丙酮酸代謝與海藻糖代謝之間的聯(lián)系及后續(xù)研究 HaPYK在異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)的其他生物學(xué)功能提供依據(jù)。

1 材料與方法

試驗(yàn)于2020年5月至2021年4月在杭州師范大學(xué)完成。

1.1 供試材料

將2020年5—7月從杭州師范大學(xué)倉(cāng)前校區(qū)及周邊田間采集得到的異色瓢蟲(chóng)與本實(shí)驗(yàn)室長(zhǎng)期飼養(yǎng)的種群混合飼養(yǎng)。首先種植蠶豆苗供豌豆蚜（Acyrthosiphon pisum）取食，然后將接有蚜蟲(chóng)的蠶豆苗放入養(yǎng)蟲(chóng)籠里供異色瓢蟲(chóng)取食。飼養(yǎng)條件為溫度（25±1）℃，相對(duì)濕度（70±5）%，光周期為14L∶10D。

1.2 HaPYK序列的生物信息學(xué)分析

從異色瓢蟲(chóng)全基因組中獲得3條HaPYK序列，然后用在線工具ORF Finder（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/）預(yù)測(cè) HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2（GenBank登錄號(hào)：MZ327965、MZ327966、MZ327967）的開(kāi)放閱讀框；利用ExPASy的ProtParam在線分析軟件（http://web.expasy.org/protparam/）對(duì)氨基酸序列進(jìn)行理化性質(zhì)的預(yù)測(cè)；使用NCBI CD Search在線分析軟件（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）對(duì)HaPYK氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)；用SOPMA在線分析軟件（http://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?apge=npsa_gor4.html）進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；用 Biozentrum SWISS-MODEL在線分析軟件（http://www.swissmodel.expasy.org/）進(jìn)行蛋白質(zhì)三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè)；利用MEGA 5軟件的鄰接法構(gòu)建丙酮酸激酶蛋白質(zhì)氨基酸序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3 雙鏈RNA合成

首先，采用Trizol法提取異色瓢蟲(chóng)總RNA[14]，然后制備 1%的瓊脂糖凝膠用于電泳以檢測(cè)抽提出的總RNA的質(zhì)量，使用微量核酸測(cè)定儀NanoDropTM2000測(cè)定 RNA的濃度和純度。接著使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒TaKaRa PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser合成cDNA的第一條鏈。

采用Primer 5軟件設(shè)計(jì)3個(gè)HaPYK雙鏈RNA（dsRNA）特異性引物用于 PCR反應(yīng)（表 1），1%的瓊脂糖凝膠電泳方法檢測(cè)PCR產(chǎn)物。對(duì)特異性且片段大小合適的條帶進(jìn)行切膠回收，根據(jù)膠回收試劑盒TaKaRa MiniBEST Agarose Gel DNA Extraction Kit Ver. 4.0說(shuō)明書(shū)的方法進(jìn)行操作。使用載體pMD?18-T和DH5α感受態(tài)細(xì)胞對(duì)回收得到的PCR產(chǎn)物進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，隨后將經(jīng)過(guò)菌落PCR驗(yàn)證后的菌液送往浙江尚亞生物技術(shù)有限公司進(jìn)行測(cè)序并返回質(zhì)粒。使用帶T7啟動(dòng)子的引物對(duì)測(cè)序正確的質(zhì)粒進(jìn)行交叉PCR反應(yīng)，接著根據(jù)dsRNA合成試劑盒Promega T7 RiboMAXTMExpress RNAi System說(shuō)明書(shū)方法合成目的基因的dsRNA。同時(shí)，以注射綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）基因的dsRNA為對(duì)照組，用相同的方法合成dsGFP。

表1 dsRNA合成和實(shí)時(shí)熒光定量PCR所需引物Table 1 Primers used for dsRNA synthesis and real-time fluorescent quantitative PCR (qRT-PCR)

1.4 顯微注射dsRNA

使用Eppendorf TransferMan? 4r顯微注射系統(tǒng)進(jìn)行注射。注射齡期為羽化第1天的瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)，未區(qū)分雌雄；注射部位為瓢蟲(chóng)成蟲(chóng)腹部柔軟部位；注射量為600 ng（濃度約5 000 ng·μL-1），注射后分別于48、72 h取材用于后續(xù)試驗(yàn)，試驗(yàn)材料未區(qū)分雌雄。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）

使用TaKaRa TB Green? Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus）試劑盒檢測(cè)，PCR反應(yīng)體系（20 μL）為正反向引物各1 μL，TB Green試劑10 μL，異色瓢蟲(chóng)cDNA 2 μL，滅菌水6 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃預(yù)變性30 s，95℃變性5 s，60℃延伸20 s，40個(gè)循環(huán)。以核糖體蛋白質(zhì) 49（ribosomal protein 49，rp49；GenBank 登錄號(hào)：AB552923）為內(nèi)參基因[15]，qRT-PCR數(shù)據(jù)采用 2-ΔΔCT法進(jìn)行分析[16]。

1.6 糖含量與海藻糖酶活性的檢測(cè)

將注射后3只成蟲(chóng)放進(jìn)同一個(gè)離心管中，并進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。每個(gè)樣品先加入200 μL磷酸緩沖鹽溶液（PBS）超聲破碎30 min，然后用PBS溶液補(bǔ)足至1 000 μL。在4℃，1 000×g條件下離心20 min，將上清液轉(zhuǎn)移到兩個(gè)離心管中，各350 μL。一部分上清液用于檢測(cè)海藻糖、糖原、蛋白質(zhì)含量，另一部分上清液在4℃，20 800×g條件下繼續(xù)離心60 min。然后取300 μL上清液用于檢測(cè)葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及可溶性海藻糖酶活性，向原離心管中加入300 μL PBS混勻制成懸浮液，用于檢測(cè)葡萄糖、蛋白質(zhì)含量及膜結(jié)合型海藻糖酶活性。海藻糖含量通過(guò)蒽酮法檢測(cè)，葡萄糖、糖原、酶活性的測(cè)定使用 Sigma葡萄糖分析試劑盒，蛋白質(zhì)含量使用貝博BCA試劑盒檢測(cè)。具體試驗(yàn)步驟參考文獻(xiàn)[14]。

1.7 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Office Excel 2010軟件整理和分析試驗(yàn)數(shù)據(jù)。以dsGFP注射組為對(duì)照，采用IBM SPSS Statistics 20軟件中獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析差異顯著性，*：P＜0.05，**：P＜0.01。使用 GraphPad Prism version 8.4.0軟件繪制柱狀圖。

2 結(jié)果

2.1 HaPYK理化性質(zhì)

對(duì)3條異色瓢蟲(chóng)HaPYK的mRNA序列進(jìn)行生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2的開(kāi)放閱讀框分別為1 350、1 569、1 656 bp，蛋白大小分別為449、522、551 aa，其他具體信息見(jiàn)表2。

表2 HaPYK序列的基本理化性質(zhì)Table 2 Basic physicochemical properties of HaPYK sequences

2.2 HaPYK序列結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

HaPYK1-1和HaPYK1-2氨基酸有兩個(gè)特異性位點(diǎn)，分別是pyruv_kin和PykF（圖1-A、1-B）。3條HaPYK均為Pyruvate_kinase超家族成員（圖1）。利用SOPMA對(duì)3條HaPYK蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)（圖2），發(fā)現(xiàn)HaPYK的開(kāi)放閱讀框蛋白序列的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要為α-螺旋（藍(lán)色）和無(wú)規(guī)則卷曲（紫色），另外也含有延伸鏈（紅色）和β-轉(zhuǎn)角（綠色）。HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2預(yù)測(cè)得到α-螺旋所占比例分別為37.64%、36.02%、35.93%；無(wú)規(guī)則卷曲所占的比例分別為30.73%、34.87%、36.48%；延伸鏈所占比例分別為21.60%、20.50%、19.96%；β-轉(zhuǎn)角所占比例分別為10.02%、8.62%、7.62%。圖3為三維結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果，HaPYK1-1基于Template 6du6.1.A建立，序列同源性為72.79%，建模范圍為2—440；HaPYK1-2和HaPYK2均基于Template 1aqf.1.A建立，序列同源性分別為52.64%和33.08%，建模范圍分別為12—522、26—538。3條序列的寡聚物類(lèi)型均為同源四聚體。

2.3 HaPYK的進(jìn)化樹(shù)分析

選取赤擬谷盜（Tribolium castaneum）、馬鈴薯甲蟲(chóng)（Leptinotarsa decemlineata）、埃及伊蚊（Aedes aegypti）、德國(guó)小蠊（Blattella germanica）、東方黏蟲(chóng)（Mythimna separata）等昆蟲(chóng)的丙酮酸激酶采用鄰接法構(gòu)建分子系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（圖 4）。結(jié)果表明，HaPYK1-1和HaPYK1-2聚在一支，與同為鞘翅目的馬鈴薯甲蟲(chóng) PYK1（LdPYK1）親緣關(guān)系更近。而HaPYK2與同為鞘翅目的赤擬谷盜PYK（TcPYK）聚為一支。

2.4 異色瓢蟲(chóng)目的基因干擾效果評(píng)價(jià)

注射dsHaPYK1-1后，在48和72 h檢測(cè)到HaPYK1-1和HaPYK1-2在mRNA水平的表達(dá)量極顯著降低，而HaPYK2在48 h表現(xiàn)為極顯著升高（P＜0.01）（圖5）。當(dāng)注射dsHaPYK1-2后，靶標(biāo)基因HaPYK1-2在兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)的檢測(cè)結(jié)果均表現(xiàn)為極顯著下調(diào)（圖 5-B）。另外，HaPYK2的表達(dá)水平也受到影響，在48和72 h檢測(cè)結(jié)果為顯著升高（P＜0.05）。而注射 dsHaPYK2組與對(duì)照組相比，僅在48 h時(shí)HaPYK2極顯著下調(diào)，在72 h后HaPYK2表達(dá)量上升，抑制作用減弱（圖5-C）。

2.5 RNAi后對(duì)海藻糖代謝途徑相關(guān)基因表達(dá)量的影響

研究結(jié)果顯示，當(dāng)抑制HaPYK1-1表達(dá)后72 h，qRT-PCR檢測(cè)得到僅HaTRE1-4的表達(dá)水平顯著下調(diào)（P＜0.05）（圖6-D），多個(gè)基因表現(xiàn)為上調(diào)，其中包括 HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE2-like、HaTPS（圖6-A、6-B、6-F、6-H）。dsHaPYK1-2組與對(duì)照dsGFP注射組相比，在48 h檢測(cè)到HaTRE1-1、HaTRE1-3、HaTPS在mRNA水平的表達(dá)量顯著升高（圖6-A、6-C、6-H），在 72 h檢測(cè)到 HaTRE1-1、HaTRE1-2、HaTRE1-5、HaTRE2、HaTPS表達(dá)水平也顯著升高（圖6-A、6-B、6-E、6-G、6-H）。注射 dsHaPYK2后，與對(duì)照組相比，在48 h發(fā)現(xiàn)僅HaTRE1-1的表達(dá)量極顯著上調(diào)（P＜0.01）（圖 6-A），而 HaTRE1-3、HaTRE1-4、HaTRE1-5的表達(dá)水平顯著下降（圖6-C、6-D、6-E），在 72 h發(fā)現(xiàn) HaTRE1-3、HaTRE1-5、HaTRE2-like、HaTRE2的表達(dá)水平均表現(xiàn)為顯著或極顯著下調(diào)（圖6-C、6-E、6-F、6-G）。

2.6 HaPYK RNAi后對(duì)海藻糖酶活性的影響

與對(duì)照組相比，僅dsHaPYK1-2組的可溶性海藻糖酶的活性在48 h表現(xiàn)為極顯著減弱（P＜0.01）（圖7-A）。根據(jù)圖7-B結(jié)果顯示，與注射dsGFP組相比，注射后72 h dsHaPYK組膜結(jié)合型海藻糖酶的活性均有所上升，其中dsHaPYK1-1和dsHaPYK2組具有顯著性差異（P＜0.01）。

2.7 HaPYK RNAi后葡萄糖、海藻糖及糖原含量的變化

與dsGFP組相比，注射dsHaPYK1-1和dsHaPYK2后48 h可以檢測(cè)到葡萄糖含量極顯著下降（P＜0.01），而 72 h葡萄糖含量在兩組中表現(xiàn)為顯著上升（P＜0.05）（圖 8-A）。在注射后 48 h，檢測(cè)結(jié)果顯示dsHaPYK1-2組海藻糖含量極顯著上升（P＜0.01），而dsHaPYK2組顯著降低；在注射后72 h，dsHaPYK1-1和dsHaPYK2兩組海藻糖含量均顯著升高（P＜0.05）（圖8-B）。糖原含量在注射dsHaPYK1-2或dsHaPYK2后48 h極顯著上升（P＜0.01）（圖8-C）。

3 討論

目前，丙酮酸激酶基因在多種生物體內(nèi)被鑒定和克隆，包括雙翅目埃及伊蚊[17]、黑腹果蠅（Drosophila melanogaster）[18]，半翅目褐飛虱（Nilaparvata lugens）[19]、桃蚜（Myzus persicae）[20]，等翅目黑胸散白蟻（Reticulitermes chinensis）[21]，鱗翅目家蠶（Bombyx mori）[22]。分析結(jié)果顯示異色瓢蟲(chóng)3條HaPYK均屬于Pyruvate_kinase超家族（圖1），但在HaPYK2中未發(fā)現(xiàn)特異性位點(diǎn)，可能與所得的片段并非全長(zhǎng)有關(guān)。在埃及伊蚊中鑒定出編碼丙酮酸激酶的兩種可變剪接的mRNA變體，即AaPYK1和AaPYK2[17]。蜜蜂和果蠅體內(nèi)也存在多條能編碼 PYK的基因[19]。本文根據(jù)編碼的蛋白與馬鈴薯甲蟲(chóng)LdPYK1和LdPYK2的親緣關(guān)系（圖4），分別命名為HaPYK1-1、HaPYK1-2、HaPYK2。張志林等研究表明，家蠶微孢子蟲(chóng)（Nosema bombycis）丙酮酸激酶的蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示其含有38%的螺旋、21%的延伸片段和40%的無(wú)規(guī)則卷曲[23]，同樣地，異色瓢蟲(chóng) HaPYK也具有這些特征，但所占比例存在差異。大多數(shù)情況下，PYK是以相同亞基的四聚體形式存在[24-25]，本研究結(jié)果與此一致（圖3）。

本研究首先檢測(cè)了靶標(biāo)基因的表達(dá)水平是否被成功抑制。結(jié)果顯示，注射dsHaPYK1-1后48 h，不僅HaPYK1-1的表達(dá)水平顯著下降，HaPYK1-2的表達(dá)水平也受到影響，但抑制程度不及HaPYK1-1（圖5）。這可能是由于HaPYK1-1和HaPYK1-2的序列同源性較高，合成的 dsHaPYK1-1片段同時(shí)也作用于HaPYK1-2。合成的dsHaPYK1-2和dsHaPYK2的特異性高，只作用于靶標(biāo)基因（圖 5）。由此可證明本研究 RNAi效果明顯，后續(xù)試驗(yàn)結(jié)果可靠。但當(dāng)HaPYK1-1和HaPYK1-2被抑制表達(dá)時(shí)，HaPYK2的表達(dá)水平顯著上升，推測(cè)HaPYK2可能具有協(xié)調(diào)平衡的作用。在弓形蟲(chóng)（Toxoplasma gondii）中表達(dá)兩種PYK，雖然數(shù)據(jù)表明PYK1為主要酶，但是在PYK1耗盡時(shí)，PYK2就表現(xiàn)出其重要性[26]。由此可見(jiàn)，昆蟲(chóng)可能通過(guò)調(diào)節(jié)多個(gè)PYK的表達(dá)水平來(lái)維持丙酮酸穩(wěn)態(tài)。

昆蟲(chóng)的各類(lèi)生命活動(dòng)離不開(kāi)能量代謝，其中海藻糖代謝尤為重要。研究證實(shí)，海藻糖用于細(xì)胞代謝之前必須先由海藻糖酶分解成葡萄糖，然后葡萄糖可用于合成糖原或者通過(guò)糖酵解以及戊糖磷酸途徑被分解[27]。糖原可經(jīng)過(guò)多步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為尿苷二磷酸葡萄糖，接著可在TPS和TPP的催化下合成海藻糖[14]。為滿足細(xì)胞需求，葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸的速率受到己糖激酶、磷酸果糖激酶和丙酮酸激酶的嚴(yán)格調(diào)控[25]。本研究結(jié)果表明，HaPYK與海藻糖代謝關(guān)鍵基因之間調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)。注射dsHaPYK1-1后48 h，所測(cè)基因的表達(dá)水平均無(wú)差異性變化，推測(cè)與檢測(cè)時(shí)間有關(guān)，影響可能延遲；進(jìn)一步檢測(cè)72 h的影響情況，發(fā)現(xiàn)部分HaTRE的表達(dá)水平升高，而HaTRE1-4等基因表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)，推測(cè)以上結(jié)果綜合導(dǎo)致海藻糖酶（TRE）活性無(wú)顯著性變化（圖6、圖 7）。另外，dsHaPYK1-1注射組瓢蟲(chóng)海藻糖在72 h時(shí)積累可能是受HaTPS表達(dá)水平增加的影響，但HaTRE的表達(dá)水平上調(diào)又促進(jìn)海藻糖轉(zhuǎn)化為葡萄糖（圖6、圖8）。在dsHaPYK1-2組中，推測(cè)在可溶性海藻糖酶（TRE1）活性降低，HaTPS表達(dá)量增加的共同作用下使得48 h時(shí)海藻糖含量升高，之后在海藻糖酶的催化下海藻糖不斷被消耗利用，從而導(dǎo)致含量減少（圖6—圖8）。然而，生物體內(nèi)的調(diào)控機(jī)制是精密而復(fù)雜的，如dsHaPYK2組中2個(gè)HaTRE2的表達(dá)水平顯著下調(diào)，但膜結(jié)合型海藻糖酶（TRE2）的活性卻增加（圖6、圖7）。推測(cè)原因在于基因轉(zhuǎn)錄水平到酶代謝水平中間還存在有待研究的調(diào)控機(jī)制。此外，3個(gè)HaPYK單獨(dú)被RNAi后，引起3個(gè)基因的表達(dá)水平存在差異（圖5），進(jìn)而導(dǎo)致對(duì)海藻糖代謝途徑的影響情況不同。在關(guān)于弓形蟲(chóng)的研究中也提到，敲除PYK1后會(huì)提高丙酮酸上游的大多數(shù)糖酵解代謝物，包括葡萄糖-6-磷酸、果糖-6-磷酸、磷酸烯醇式丙酮酸的豐度，而丙酮酸、乳酸、谷氨酰胺、谷氨酸的水平降低[26]。這些結(jié)果表明PYK在生物碳代謝中起著穩(wěn)態(tài)的作用。結(jié)合三唑磷和dsPYK處理，GE等檢測(cè)發(fā)現(xiàn)褐飛虱體內(nèi)可溶性糖含量降低[19]。除了 PYK外，磷酸果糖激酶（PFK）也是糖酵解通路的限速酶，邱玲玉研究發(fā)現(xiàn)調(diào)低其表達(dá)后，褐飛虱海藻糖酶基因 TRE1-1、TRE1-2、TRE2的表達(dá)量顯著下調(diào)，膜結(jié)合型海藻糖酶活性明顯下降，海藻糖含量無(wú)差異表現(xiàn)，葡萄糖和糖原含量顯著上升[28]。綜上可知，糖酵解與海藻糖代謝之間聯(lián)系緊密。實(shí)際上，不僅PYK可調(diào)控碳水化合物水平，反之碳水化合物水平也可對(duì)PYK產(chǎn)生影響。在哺乳動(dòng)物中，PYK以4種不同的組織特異性同工酶L、R、M1和 M2類(lèi)型存在[29]。FAN 等[30]在草魚(yú)（Ctenopharyngodon idella）中克隆得到3個(gè)PYK，分別為PYKL、PYKMa和PYKMb，且發(fā)現(xiàn)飼喂草魚(yú)高碳水化合物飼料會(huì)顯著提高 PYK的表達(dá)水平?？傮w來(lái)看，抑制PYK表達(dá)會(huì)對(duì)海藻糖代謝產(chǎn)生影響。

雌激素相關(guān)受體（ERR）在發(fā)育、能量代謝中起著不可或缺的作用，已有多篇論文證實(shí)ERR和糖酵解限速酶（己糖激酶、丙酮酸激酶、磷酸果糖激酶）之間存在調(diào)節(jié)關(guān)聯(lián)，從而調(diào)控能量代謝影響昆蟲(chóng)胚胎發(fā)育和繁殖力[20,22,31]。在埃及伊蚊和黑腹果蠅胚胎發(fā)生過(guò)程中，丙酮酸激酶的活性也被證明升高，表明在胚胎中糖酵解增加[18,32]。從中可以推斷出丙酮酸激酶可能在昆蟲(chóng)繁殖力中起作用。GE等[19]研究表明，褐飛虱NlPYK可能通過(guò)增加葡萄糖代謝而在昆蟲(chóng)繁殖力中起作用。然而，在異色瓢蟲(chóng)中未見(jiàn)報(bào)道，將來(lái)可進(jìn)一步研究HaPYK表達(dá)與成蟲(chóng)繁殖力之間的關(guān)系。

4 結(jié)論

異色瓢蟲(chóng)體內(nèi)存在 3個(gè) HaPYK，HaPYK屬于Pyruvate_kinase超家族，二級(jí)結(jié)構(gòu)較簡(jiǎn)單，以相同亞基的四聚體形式存在。此外，通過(guò)RNAi技術(shù)能成功干擾靶標(biāo)基因的表達(dá)水平，且抑制表達(dá)后海藻糖代謝會(huì)受到影響，但3個(gè)HaPYK的調(diào)控機(jī)制存在差異。