超表達(dá)OsPR1A增強(qiáng)了Xa21介導(dǎo)的水稻對(duì)白葉枯病的抗性反應(yīng)

劉玉晴，燕高偉，張彤，蘭金蘋，郭亞璐，李莉云，劉國(guó)振?，竇世娟?

1河北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北保定 071001；2北京生物制品研究所有限責(zé)任公司，北京 102600；3河北北方學(xué)院生命科學(xué)研究中心，河北張家口 075000；4中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)基因組研究所，廣東深圳 518116

0 引言

【研究意義】水稻（Oryza sativa L.）是中國(guó)重要的糧食作物之一，也是全球一半以上人口的主糧[1]。但是，水稻經(jīng)常會(huì)遭受細(xì)菌、真菌和病毒等病原體的侵害，其中，由革蘭氏陰性菌黃單孢菌水稻變種（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）引起的水稻白葉枯病是嚴(yán)重影響水稻產(chǎn)量的細(xì)菌性病害之一，嚴(yán)重情況下可造成絕收[2]。目前，從根本上提高水稻產(chǎn)量的有效途徑：一是培育和種植高產(chǎn)雜交水稻；二是提高水稻的抗性水平。水稻病程相關(guān)蛋白質(zhì) OsPR1A是最早被鑒定和克隆出來的重要水稻病程相關(guān)蛋白質(zhì)[3]，許多抗病基因都涉及OsPR1A的改變，它可能是多個(gè)抗病基因下游響應(yīng)的共享元件，OsPR1A經(jīng)常被作為抗性反應(yīng)發(fā)生的標(biāo)志基因。迄今為止，其生理學(xué)功能或生理生化機(jī)制研究甚少。本文通過獲得OsPR1a-OX超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，為鑒定OsPR1A功能提供依據(jù)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，已知鑒定出 45個(gè)對(duì)Xoo具有抗性的基因[4]，其中12個(gè)已經(jīng)被克隆，分別命名為Xa1、Xa3/Xa26、Xa4、xa5、Xa7、Xa10、xa13、Xa21、Xa23、xa25、Xa27、xa41[5-6]。Xa21 是水稻中第一個(gè)被克隆的抗性基因，對(duì)多種 Xoo菌株均具有抗性[7-8]。Xa21編碼跨膜受體激酶，胞內(nèi)激酶結(jié)構(gòu)域可以自我磷酸化[9]，并誘導(dǎo) MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中磷酸化事件，這些事件改變WRKY轉(zhuǎn)錄因子家族的亞細(xì)胞定位或DNA結(jié)合活性，從而將抗性信號(hào)傳遞給下游病程相關(guān)蛋白質(zhì)（pathogenesis-related proteins，PRs），引發(fā)抗病反應(yīng)[10-12]。Xa21介導(dǎo)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中多個(gè)元件已被鑒定，如負(fù)調(diào)控因子有OsWRKY62.1（XB10）[13]、XB15[14]、XB24[9]和OsBiP3[15]等，正調(diào)控因子有 XB3[16]、XB21[17]、XB25[18]、OsWRKY67[11]、XIK1[19]和 OsSERK2[20]等。OsWRKY6和 OsWRKY13超表達(dá)后可以誘導(dǎo) OsPR1a表達(dá)，增強(qiáng)了水稻對(duì)白葉枯病的抗性[21-22]。OsWRKY62.1超表達(dá)后會(huì)抑制OsPR1a的表達(dá)，從而負(fù)調(diào)控水稻對(duì)白葉枯病的抗性[13]。OsWRKY67超表達(dá)后可上調(diào)病程相關(guān)基因（OsPR1a、OsPR1b、OsPR4、OsPR10a和OsPR10b）的表達(dá)，增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性[10]。OsWRKY114超表達(dá)后可以激活 OsPR1a和幾丁質(zhì)酶的表達(dá)，來增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性[23]。OsDR8-RNAi轉(zhuǎn)基因植株會(huì)使OsPR1a表達(dá)下調(diào)，降低水稻對(duì)白葉枯病的抗性[24]。此外，還有一些其他的抗病元件通過調(diào)控OsPR1a的表達(dá)最終增強(qiáng)或降低水稻對(duì)其他病菌的抗病性，如OsWRKY4正調(diào)控JA/ET依賴的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，促進(jìn)OsPR1a、OsPR1b、OsPR5和OsPR10大量表達(dá)，從而提高了水稻對(duì)紋枯病的抗性[25]。OsAOS2超表達(dá)后會(huì)增強(qiáng) OsPR1a、OsPR3和OsPR5的表達(dá)，并增強(qiáng)了水稻對(duì)稻瘟病的抗性[26]。由此可見，水稻病程相關(guān)蛋白質(zhì)OsPR1A位于該信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的下游發(fā)揮作用，廣泛參與了水稻對(duì)病原菌的抗性反應(yīng)。利用免疫印跡（western blot，WB）技術(shù)發(fā)現(xiàn)OsPR1A的表達(dá)受Xoo的誘導(dǎo)[27]。通過溫度調(diào)節(jié)控制水稻苗期的抗感反應(yīng)體系[28]，在27℃培養(yǎng)條件下，對(duì)水稻苗期4021接種Xoo，發(fā)現(xiàn)OsPR1A于接菌第2天被誘導(dǎo)表達(dá)，4021呈現(xiàn)抗病反應(yīng)；TP309接種Xoo后，OsPR1A于接菌第8天后被誘導(dǎo)表達(dá)，TP309呈現(xiàn)感病反應(yīng)[29]。說明在接菌后早期啟動(dòng)OsPR1A較高水平的表達(dá)對(duì)水稻抵抗白葉枯病菌至關(guān)重要。在31℃培養(yǎng)條件下，水稻幼苗期，TP309呈現(xiàn)感病反應(yīng)，4021也表現(xiàn)為感病反應(yīng)，這一體系對(duì)于鑒定 OsPR1a-OX超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株的抗病性提供良好的對(duì)照基礎(chǔ)?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】目前，對(duì)于OsPR1A的研究絕大部分是作為抗性反應(yīng)發(fā)生的標(biāo)志基因佐證其他基因或途徑在抗性中的作用，缺乏直接的證據(jù)證實(shí)OsPR1A本身的生物學(xué)功能。前期已獲得OsPR1a-RNAi轉(zhuǎn)基因植株，研究發(fā)現(xiàn)，接種Xoo后第12天，OsPR1a-RNAi轉(zhuǎn)基因植株葉片的病斑長(zhǎng)度長(zhǎng)于 4021植株，說明下調(diào)OsPR1A的表達(dá)降低了水稻對(duì)白葉枯病菌的抗性反應(yīng)[29]。超表達(dá)植株與抗性的關(guān)系需進(jìn)一步探究?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以 Xa21介導(dǎo)的抗白葉枯病信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)體系為依托，以抗感表型明顯的水稻材料為對(duì)照（4021-Xoo P6為抗病組合，TP309-Xoo P6為感病組合），通過構(gòu)建OsPR1a-OX載體，獲得OsPR1A超表達(dá)轉(zhuǎn)基因植株，調(diào)查其表型和農(nóng)藝性狀，明確OsPR1A表達(dá)時(shí)間和表達(dá)豐度與水稻抗感反應(yīng)的關(guān)系，從而建立抗感模型，進(jìn)一步探究OsPR1A在水稻抗病中的功能及其生理生化機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 水稻材料及培養(yǎng)條件

TP309為粳稻品種，4021為以TP309為背景，轉(zhuǎn)入抗白葉枯病基因 Xa21的純合轉(zhuǎn)基因株系。OsPR1a-OX為超表達(dá)OsPR1a的4021。水稻大田種植在河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)的水稻試驗(yàn)田中進(jìn)行。

苗期培養(yǎng)：在光照培養(yǎng)箱（31℃，15 h光照/9 h黑暗）中水稻種子浸種3 d，將露白的種子種植到已滅菌的營(yíng)養(yǎng)土（蛭石∶營(yíng)養(yǎng)土=1∶2）中，培養(yǎng) 14 d，備用。

1.2 水稻OsPR1a-OX轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

首先，構(gòu)建pUC57-3HA質(zhì)粒，在pUC57質(zhì)粒上引入 3HA-終止子序列，3HA上游帶有 XbaⅠ和 KpnⅠ雙酶切位點(diǎn)，下游帶有SpeⅠ和HindⅢ雙酶切位點(diǎn)。其次，構(gòu)建含有目的基因的中間載體 pEASY-T1-OsPR1a-3HA，用 XbaⅠ和 HindⅢ限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pEASY-T1質(zhì)粒和pUC57-3HA質(zhì)粒，用連接酶將 3HA-終止子序列連接到 pEASY-T1質(zhì)粒上。將含有目的基因的質(zhì)粒反轉(zhuǎn)錄，獲得全長(zhǎng)cDNA序列，并且在全長(zhǎng)cDNA序列的上、下游設(shè)計(jì)引物，分別引入KpnⅠ和EcoRⅠ 2個(gè)酶切位點(diǎn)，進(jìn)行PCR、瓊脂糖凝膠電泳，用KpnⅠ和EcoRⅠ分別雙酶切PCR產(chǎn)物（OsPR1a全長(zhǎng)cDNA）和pEASY-T1-3HA質(zhì)粒，用連接酶將目的基因的片段連接到 pEASY-T1-3HA質(zhì)粒上，進(jìn)行酶切驗(yàn)證。最后，構(gòu)建終載體 pUBIC4300-T1-OsPR1a-3HA的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒，驗(yàn)證條帶正確后用 SpeⅠ和 KpnⅠ限制性內(nèi)切酶分別雙酶切pEASY-T1-OsPR1a-3HA質(zhì)粒和pUBI-C4300質(zhì)粒，用連接酶將 OsPR1a-3HA-終止子片段插入到pUBIC4300質(zhì)粒上，連接轉(zhuǎn)化后用SpeⅠ和KpnⅠ雙酶切驗(yàn)證結(jié)果。

含有水稻目的片段OsPR1a（LOC_Os07g03710）全長(zhǎng)的cDNA序列的質(zhì)粒購(gòu)自日本農(nóng)業(yè)生物資源研究所水稻基因組資源中心（Rice Genome Resource Center，National Institute of Agrobiological Sciences）。擴(kuò)增目的片段使用的引物分別為 OsPR1a-OX-F：5’-GCGGTACC ATGGCGAGTTCGTCGAGCAGG-3’（下劃線為 KpnⅠ酶切位點(diǎn)），OsPR1a-OX-R：5’-GCGAATTCTCAGTAGGGAGATTGGCCGAC-3’（下劃線為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)）。

1.3 水稻轉(zhuǎn)化

利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將轉(zhuǎn)化質(zhì)粒 pUBI-C4300-T1-OsPR1a-3HA轉(zhuǎn)入水稻受體4021中，通過甘露糖進(jìn)行篩選，轉(zhuǎn)化工作由武漢伯遠(yuǎn)生物科技有限公司完成。

1.4 菌株的培養(yǎng)及接菌方法

試驗(yàn)所用水稻白葉枯病菌的菌株為 Xoo Philippine Race 6（PR6）。將保存在-70℃超低溫冰箱里的菌液，用接種針挑取菌液在土豆培養(yǎng)基上劃線活化，培養(yǎng)溫度為28℃，約活化3次后，用無(wú)菌水稀釋成菌液進(jìn)行涂板，培養(yǎng) 2 d后，用無(wú)菌水稀釋菌液濃度為OD600=0.5。對(duì)培養(yǎng)14 d的水稻幼苗進(jìn)行接菌處理，具體方法為：用滅菌的剪刀在距離葉尖約2 cm處，采用斜刀法剪切水稻葉片進(jìn)行接菌，每棵水稻苗對(duì)第3個(gè)葉片進(jìn)行接菌，每個(gè)處理接種100個(gè)單株左右。

1.5 病斑長(zhǎng)度測(cè)量

水稻TP309、4021和OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因水稻接菌后，27℃培養(yǎng)，分別在0、2、4、6、8、10和12 d時(shí)測(cè)量病斑長(zhǎng)度，每個(gè)株系測(cè)4個(gè)葉片取平均值。在12 d時(shí)將水稻葉片壓在玻璃板下拍照。試驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 水稻取材

取材方法（2 cm取材法）：當(dāng)病斑長(zhǎng)度小于2 cm時(shí)，取水稻葉片的前2 cm；當(dāng)病斑長(zhǎng)度大于2 cm時(shí)，取病斑線（Xoo侵染與未侵染的分界線）上、下各1 cm之間的葉片。

取材時(shí)間：在接菌0、4和6 d時(shí)分別對(duì)TP309、4021和OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行取材，葉片稱量后放置到裝有鋼珠的離心管中，并迅速放置到液氮中，-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.7 PCR鑒定

以水稻基因組 DNA作為模板，正向引物為P-OsPR1a-OX-F：5’-ATGGCGAGTTCGTCGAGCAG G-3’，反向引物為 P-HA-R：5’-CTGGAACGTCATATG GATAGG-3’。擴(kuò)增結(jié)束后，每個(gè)樣品的PCR產(chǎn)物取20 μL，用1%瓊脂糖凝膠跑電泳并檢測(cè)。

1.8 水稻樣品全蛋白質(zhì)的提取及WB檢測(cè)

取出儲(chǔ)藏在-70℃超低溫冰箱里的樣品，用高速震蕩研磨儀將樣品研磨成粉末狀；每 0.1 克樣品粉末中加入1 mL蛋白質(zhì)提取緩沖液；渦旋混勻30 s，冰上放置2 min，重復(fù)5次；4℃ 12 000 r/min離心20 min；取上清液，加入上清液體積1/4的5×Loading Buffer，煮沸10 min，12 000 r/min離心3 min，蛋白質(zhì)樣品提取完成，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩＞唧w方法參考文獻(xiàn)[30]。

（154）列胞耳葉苔 Frullania moniliata（Reinw.，Blume＆Nees）Mont. 熊 源 新 等 （2006）； 楊 志 平（2006）；馬俊改 （2006）； 王小琴等 （2007）； 洪文（2007，2008）；姚發(fā)興等（2003）；李粉霞等（2011）；余夏君等（2018）

用10% Tricine膠分離已提取好的水稻總蛋白質(zhì)樣品；電泳條件為80 V，20 min和160 V，90 min；分離完成后將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；OsPR1A一抗為anti-OsPR1A多克隆抗體，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗兔二抗；OsHSP82作為校準(zhǔn)上樣量?jī)?nèi)參蛋白，一抗為OsHSP82單克隆抗體[31]，二抗為HRP標(biāo)記的羊抗鼠二抗；二抗孵育結(jié)束后進(jìn)行WB檢測(cè)，首先將皮克級(jí)的顯色液A液與B液進(jìn)行1∶1的配制，搖勻，然后將發(fā)光液均勻地滴加到PVDF膜上，再將PVDF膜放到膜保護(hù)卡上，用Sage Capture軟件檢測(cè)OsPR1A蛋白質(zhì)條帶的信號(hào)。

2 結(jié)果

2.1 水稻OsPR1a-OX轉(zhuǎn)化載體的構(gòu)建

為了探究OsPR1A在Xa21介導(dǎo)的抗病途徑中的功能，構(gòu)建 OsPR1a-OX轉(zhuǎn)化載體。首先，根據(jù)目的基因設(shè)計(jì)引物（上、下游引物的5’端分別引入限制性酶切位點(diǎn)KpnⅠ和EcoRⅠ），然后擴(kuò)增目的條帶，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳（圖1-a）。結(jié)果表明，擴(kuò)增的目的條帶大小與OsPR1a大小相符，為507 bp。其次，用限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ和 EcoRⅠ雙酶切 PCR產(chǎn)物和pEASY-T1-3HA質(zhì)粒，酶切產(chǎn)物純化后進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，構(gòu)建pEASY-T1-OsPR1a-3HA質(zhì)粒，用KpnⅠ和EcoRⅠ進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證（圖 1-b）。結(jié)果表明，目的條帶符合預(yù)期，大小為507 bp，將重組質(zhì)粒測(cè)序，測(cè)序結(jié)果正確后，用限制性內(nèi)切酶 KpnⅠ、SpeⅠ雙酶切pEASY-T1-OsPR1a-3HA質(zhì)粒，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，目的片段OsPR1a-3HA回收并連接到用KpnⅠ和SpeⅠ雙酶切的 pUBI-C4300質(zhì)粒中，然后將重組質(zhì)粒pUBI-C4300-OsPR1a-3HA進(jìn)行雙酶切（KpnⅠ和 SpeⅠ）驗(yàn)證（圖1-c）。結(jié)果表明，帶有插入的目的基因的酶切產(chǎn)物大小為2 568 bp，即獲得OsPR1a-OX轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。

2.2 水稻OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株的鑒定

獲得轉(zhuǎn)化質(zhì)粒后，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)入水稻受體4021中。T0代獲得16個(gè)轉(zhuǎn)基因株系，取其葉片分別提取基因組DNA和全蛋白質(zhì)進(jìn)行PCR和WB鑒定，篩選陽(yáng)性轉(zhuǎn)基因株系并收獲種子，即為T1代。經(jīng)過進(jìn)一步篩選，在T2代獲得OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因純合株系#704和#709。如圖2所示，以4021作為負(fù)對(duì)照，其PCR結(jié)果和WB結(jié)果均沒有條帶即為陰性，2個(gè)轉(zhuǎn)基因株系#704和#709中PCR結(jié)果和WB結(jié)果均有條帶，說明OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因株系#704和#709為超表達(dá)轉(zhuǎn)基因純合株系。

2.3 水稻OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株的農(nóng)藝性狀

在成熟期調(diào)查 OsPR1a-OX植株的株高、穗長(zhǎng)、分蘗數(shù)、結(jié)實(shí)率和籽粒的大小等農(nóng)藝性狀，并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析（圖3），與對(duì)照4021相比，OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株#704和#709的株高較矮、穗長(zhǎng)較短、結(jié)實(shí)率降低、分蘗數(shù)減少，并且統(tǒng)計(jì)學(xué)分析具有差異顯著性，但籽粒比水稻4021的稍大，可能與結(jié)實(shí)率低有關(guān)。說明超表達(dá)OsPR1A影響了水稻的正常生長(zhǎng)發(fā)育過程。

2.4 水稻OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株接種Xoo后病斑長(zhǎng)度的分析

為了探究OsPR1A在Xa21介導(dǎo)的抗白葉枯病的途徑中的功能，31℃條件下培養(yǎng)水稻TP309、4021、#704和#709，2周后接種Xoo，并在接種0、2、4、6、8、10和12 d時(shí)測(cè)量病斑長(zhǎng)度，并于12 d時(shí)拍照。如圖4-a所示，接種2 d后葉片接菌部位開始出現(xiàn)病斑，隨著接菌時(shí)間的延長(zhǎng)，水稻不同材料的病斑長(zhǎng)度呈現(xiàn)差別。TP309葉片的病斑長(zhǎng)度隨著接菌時(shí)間延長(zhǎng)不斷增加；4021葉片的病斑長(zhǎng)度增加緩慢；OsPR1a-OX植株#704和#709葉片的病斑長(zhǎng)度始終控制在較低水平。接種12 d時(shí)取樣拍照，如圖4-b所示，TP309呈全感狀態(tài)，病斑長(zhǎng)度平均為14.8 cm；4021呈半感狀態(tài)，病斑長(zhǎng)度平均為2.9 cm；而#704、#709的病斑長(zhǎng)度平均為1.2 cm，顯著短于4021。對(duì)接種12 d時(shí)不同水稻材料的病斑長(zhǎng)度進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因水稻#704、#709的病斑長(zhǎng)度與對(duì)照4021相比具有顯著性差異（P＜0.05）（圖 4-c）。結(jié)果表明，超表達(dá)OsPR1A后增強(qiáng)了 Xa21介導(dǎo)的水稻對(duì)白葉枯病的抗性反應(yīng)。

2.5 水稻OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株接種Xoo后OsPR1A蛋白質(zhì)的表達(dá)特征

通過 OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株來進(jìn)一步探究OsPR1A在水稻抗白葉枯病反應(yīng)中的作用。在31℃培養(yǎng)條件下，調(diào)查了TP309、4021、#704和#709水稻植株在接菌0、4和6 d時(shí)OsPR1A的表達(dá)豐度，并采用2 cm取材法收集水稻葉片材料。如圖5所示，在接菌0 d時(shí)，水稻TP309和4021中OsPR1A均不表達(dá)，#704和#709中本底表達(dá)豐度比較高；接種 4和 6 d時(shí)OsPR1A在TP309中均沒有誘導(dǎo)表達(dá)，4021中出現(xiàn)誘導(dǎo)條帶，并隨時(shí)間延長(zhǎng)有所增加，#704和#709中OsPR1A始終處于較高恒定水平表達(dá)狀態(tài)?？梢姡琌sPR1A接菌后的早期誘導(dǎo)表達(dá)或組成型本底表達(dá)對(duì)水稻抗白葉枯病發(fā)揮著重要作用。

3 討論

PR蛋白質(zhì)是由植物病原體和防御相關(guān)信號(hào)分子誘導(dǎo)的一類蛋白質(zhì)的總稱[32]。PR首先被發(fā)現(xiàn)在被感染煙草花葉病毒的煙草植物中，另外，在番茄、水稻和擬南芥等中也有發(fā)現(xiàn)，它們往往在抗病反應(yīng)的下游發(fā)揮作用，具有攻擊病原物、降解病原物細(xì)胞壁、蛋白酶的抑制劑和防御素等功能[3,33-35]。目前，水稻PR蛋白質(zhì)根據(jù)它們的蛋白質(zhì)序列相似性、酶活性和其他生物學(xué)特性分為17個(gè)家族[36-38]。OsPR1a是水稻PR1家族成員中第一個(gè)被報(bào)道的成員，編碼一種酸性的低分子量的蛋白質(zhì)，屬于絲氨酸羧肽酶[3]。OsPR1a在水稻防御和脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用，例如，當(dāng)受到機(jī)械傷害、光信號(hào)、蛋白磷酸酶抑制劑（CN和EN）、茉莉酸（jasmonic acid，JA）、水楊酸（salicylic acid，SA）、脫落酸（abscisic acid，ABA）、過氧化氫（hydrogen peroxide，H2O2）、稻瘟病菌（Magnaporthe grisea）、白葉枯病菌和紋枯病菌（Rhizoctonia solani）處理后均可誘導(dǎo)其轉(zhuǎn)錄水平表達(dá)，因此，在水稻中經(jīng)常被作為一個(gè)抗病標(biāo)記基因[3,25-26,39]。

病程相關(guān)蛋白中類絲氨酸羧肽酶家族的存在不單單是為防衛(wèi)反應(yīng)而準(zhǔn)備的，在植物正常生活中也需要它們定量的表達(dá)。類絲氨酸羧肽酶在植物中具有廣泛的生理學(xué)功能，參與種子萌發(fā)有關(guān)的蛋白質(zhì)降解[40]、調(diào)節(jié)水稻籽粒大小和水稻產(chǎn)量[41-42]、油菜素類固醇受體（brassinosteroid-insensitive 1，BRI1）信號(hào)途徑[43]、具有?；D(zhuǎn)移酶活性參與次級(jí)代謝產(chǎn)物的生物合成[44-45]以及參與除草劑代謝[46]等。GS5編碼絲氨酸蛋白酶，可以正調(diào)控水稻粒重的數(shù)量性狀，超表達(dá)GS5可促進(jìn)水稻穎殼細(xì)胞的橫向分裂，進(jìn)而增大穎殼的寬度，繼而加快谷粒的充實(shí)和胚乳的生長(zhǎng)速度，最終增大種子的大小以及增加谷粒的重量，從而提高水稻的產(chǎn)量[41]。OsSCP46編碼絲氨酸羧肽酶，可能通過參與ABA信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)來實(shí)現(xiàn)參與水稻種子灌漿和萌發(fā)過程[47]。在本研究中類絲氨酸羧肽酶家族成員 OsPR1A，超表達(dá)植株表現(xiàn)為籽粒變大，但結(jié)實(shí)率降低，同時(shí)表現(xiàn)為株高較矮、穗長(zhǎng)較短以及分蘗數(shù)減少（圖3）。由此可見，維持 OsPR10A表達(dá)量的平衡對(duì)于保證水稻的正常生長(zhǎng)發(fā)育和抗性需求至關(guān)重要。

前期研究表明，攜帶Xa21的水稻在幼苗期對(duì)Xoo不具有抗病性，只有在成熟期抗性才被完全激活[48]。但近期宋文源課題組發(fā)現(xiàn)在 27℃條件下培養(yǎng)水稻幼苗，接種Xoo后激活了Xa21介導(dǎo)的抗性；而當(dāng)轉(zhuǎn)移到 31℃條件下培養(yǎng)，Xa21介導(dǎo)的抗性又會(huì)喪失[28]。說明 Xa21介導(dǎo)的抗白葉枯病不僅具有發(fā)育時(shí)期依賴性還具有溫度依賴性。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，大田種植條件下，水稻 4021（非親和互作）接種 Xoo后OsPR1A被誘導(dǎo)表達(dá)，并且在接菌144 h時(shí)OsPR1A的表達(dá)豐度高于TP309（親和互作）[27]。在27℃培養(yǎng)條件下，對(duì)水稻幼苗TP309和4021接種Xoo，TP309呈現(xiàn)感病反應(yīng)，4021呈現(xiàn)抗病反應(yīng)，且在 4021中OsPR1A被提前誘導(dǎo)表達(dá)[29]，表明OsPR1A在病菌侵染早期的誘導(dǎo)表達(dá)對(duì)水稻抗病至關(guān)重要。OsPR1a-RNAi轉(zhuǎn)基因植株接種Xoo后會(huì)降低Xa21介導(dǎo)的對(duì)白葉枯病的抗性反應(yīng)[29]。本研究發(fā)現(xiàn) OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株的病斑長(zhǎng)度短于4021和TP309（圖4），說明OsPR1A在Xa21介導(dǎo)的免疫反應(yīng)中發(fā)揮正調(diào)控作用，可增強(qiáng)水稻對(duì)白葉枯病的抗性。

OsPR1A屬于類絲氨酸羧肽酶，一般作為分泌蛋白，定位在細(xì)胞外間隙，參與對(duì)抗病原菌的反應(yīng)，但其生理生化機(jī)制研究甚少，如亞細(xì)胞定位、酶學(xué)分析和參與的代謝組分析等探究 OsPR1A的生理生化功能，為研究抗病反應(yīng)機(jī)制奠定堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。

Xa21介導(dǎo)的抗性有幾個(gè)限制因素：一是發(fā)育時(shí)期依賴性，田間情況下是成株期抗性，幼苗期不抗；二是溫度依賴性，苗期在27℃表現(xiàn)抗性，31℃表現(xiàn)感??；三是具有Xoo小種依賴性，沒有RaxX的Xoo是不抗的[49]。除Xa21介導(dǎo)的Xoo抗性中，還有多個(gè)Xoo抗病基因，其中許多抗病基因都涉及OsPR1A的改變，所以O(shè)sPR1A可能是多個(gè)抗病基因下游響應(yīng)的共享元件，是重要的病程相關(guān)蛋白質(zhì)。OsPR1A沒有病原菌結(jié)合特異性，可能是更具廣譜及長(zhǎng)效抗性的基因資源。如果確定了在不同抗病途徑都發(fā)揮作用，則通過調(diào)控該基因的表達(dá)進(jìn)行水稻品種的改良，可能實(shí)現(xiàn)一定程度的廣譜抗性，即非抗病基因依賴、非病原菌小種依賴、非溫度和發(fā)育時(shí)期依賴的非?；剐裕M(jìn)一步增強(qiáng)水稻的抗病性，拓寬水稻的抗病譜，為基于基因整合的廣譜抗病育種提供分子水平的指導(dǎo)。

4 結(jié)論

構(gòu)建了OsPR1a-OX載體，獲得了OsPR1a-OX轉(zhuǎn)基因植株；超表達(dá)OsPR1A后增強(qiáng)了Xa21介導(dǎo)的水稻對(duì)白葉枯病的抗性；超表達(dá)OsPR1A也會(huì)影響水稻的正常發(fā)育過程，主要表現(xiàn)為株高變矮、分蘗數(shù)顯著減少、穗長(zhǎng)顯著變短、結(jié)實(shí)率顯著降低和籽粒變大。