綿羊胚胎移植技術(shù)關(guān)鍵步驟優(yōu)化*

晁旭東，李 軍，劉長(zhǎng)彬，李守江，谷紅偉，王智鵬，郭延華.，倪建宏，王 萌

（1.佛山守仁生物技術(shù)有限公司，廣東 佛山 528000；2.新疆農(nóng)墾科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/省部共建綿羊遺傳改良與健康養(yǎng)殖國(guó)建重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室）

胚胎移植（Embryo Transfer）亦稱“借腹懷胎”，即選擇優(yōu)良的種畜，超數(shù)排卵后人工授精，在授精后的第6天，采取手術(shù)法沖胚，獲得桑椹胚、囊胚或擴(kuò)張囊胚等早期胚胎，移植于相同物種同一生理狀態(tài)的母畜子宮內(nèi)，使之妊娠并發(fā)育為另一新生命體的過(guò)程[1]。胚胎移植技術(shù)是試管嬰兒、體外受精、轉(zhuǎn)基因、體細(xì)胞核移植等的基礎(chǔ)性環(huán)節(jié)。所以，胚胎生物工程技術(shù)又被譽(yù)為繁殖技術(shù)的第二次生物技術(shù)革命，其發(fā)展歷程已有100多年的歷程。1890年英國(guó)劍橋大學(xué)的Heape，在安哥拉兔上取得了胚胎移植的成果，奠定了胚胎移植的生物學(xué)基礎(chǔ)。隨著研究的不斷深入，人們不斷在超排方案、藥品選擇和同期發(fā)情程序等方面展開(kāi)研究，并著重在實(shí)踐中應(yīng)用[2]。1990年美國(guó)胚胎移植普及率為27.5%，種畜為44%，經(jīng)濟(jì)效益超過(guò)了650億美元。美國(guó)、法國(guó)等每年參加測(cè)定的青年公牛80%為胚胎移植牛[3]。截止目前，胚胎移植已發(fā)展到分割胚、嵌合體、轉(zhuǎn)基因胚、核移植胚、性別鑒定以及制造生物反應(yīng)器等，胚胎移植研究領(lǐng)域以及在應(yīng)用實(shí)踐上的價(jià)值巨大[4-9]。

我國(guó)胚胎移植技術(shù)起步較晚，但發(fā)展速度驚人，1974—1994年20年間完成了引進(jìn)、學(xué)習(xí)、消化和吸收、到再創(chuàng)新的階段。1994—2014年間完成了胚胎移植技術(shù)由實(shí)驗(yàn)室走出來(lái)，開(kāi)始服務(wù)于畜牧業(yè)生產(chǎn)，胚胎移植技術(shù)在種畜養(yǎng)殖場(chǎng)的應(yīng)用，已經(jīng)成為畜牧業(yè)發(fā)展中最具有價(jià)值和生機(jī)的應(yīng)用技術(shù)之一[10-13]。

本試驗(yàn)對(duì)胚胎移植系統(tǒng)工程中供體挑選、FSH超數(shù)排卵、沖胚管放置位置和氣球大小、子宮角牽出和打孔等關(guān)鍵技術(shù)環(huán)節(jié)進(jìn)行進(jìn)一步深入研究，通過(guò)對(duì)這些關(guān)鍵環(huán)節(jié)的完善，在胚胎移植的獲胚率和移植受胎率上有了明顯提升（P＜0.05）。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)羊的選擇與分組

隨機(jī)選擇健康、無(wú)繁殖疾病、具有產(chǎn)羔經(jīng)歷、膘情在2.5～3.0分的薩福克肉羊，隨機(jī)分組。共選擇供體母羊86只，受體母羊115只。所選羊只舍飼，自動(dòng)飲水機(jī)飲水。公羊選擇本地體質(zhì)健壯、性欲旺盛、精液質(zhì)量?jī)?yōu)良的成年羊，按1∶25的比例做試情公羊。

1.2 試驗(yàn)藥品與材料

CIDR栓（燕瑞生物科技有限公司）、FSH（寧波三生藥業(yè)有限公司）、PMSG（寧波三生藥業(yè)有限公司）、PGF2a（上海計(jì)劃生育研究所、寧波三生藥業(yè)有限公司）、8號(hào)沖胚管（進(jìn)口）；生理鹽水、酒精、碘酒、噴壺、套管針、青霉素、新潔爾滅等均為國(guó)產(chǎn)；開(kāi)膣器、輸精槍、1 mL注射器、水浴鍋、顯微鏡。

1.3 實(shí)施時(shí)間及應(yīng)用地點(diǎn)

于2019年4月至2020年12月在喀什、克拉瑪依、和第八師一四五團(tuán)開(kāi)展相關(guān)試驗(yàn)。

1.4 胚胎采集

采用羊用沖胚管（8號(hào)管）從子宮體打孔插入相對(duì)應(yīng)的子宮一側(cè)，然后氣球打氣，氣球打氣量一般在3～5 mL為宜，固定好位置后，向子宮內(nèi)注入PBS液至子宮充滿，然后從宮管結(jié)合部，迅速插入套管針，將沖胚液引流至培養(yǎng)皿（100 mm），沖胚結(jié)束后將培養(yǎng)皿送至實(shí)驗(yàn)室撿胚胎，并做胚胎質(zhì)量鑒定。

1.5 供體羊營(yíng)養(yǎng)狀況

在整個(gè)處理期，保持供體羊的飼養(yǎng)水平均衡，切勿更換飼料。在撤栓時(shí)頸部肌肉注射維生素ADE液。

1.6 數(shù)據(jù)處理

用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，經(jīng)t檢驗(yàn)評(píng)估不同組之間的差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體羊體況對(duì)超排效果和胚胎質(zhì)量的影響

在同一飼養(yǎng)管理和同一品種的情況下，按照羊體況評(píng)分（參照奶牛評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)），分值為1～5分，當(dāng)體況評(píng)分在2.5～3.0分時(shí)，超數(shù)排卵效果較4.0分以上效果好，且差異顯著（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 供體羊體況對(duì)超數(shù)排卵和胚胎質(zhì)量的影響

2.2 超排藥物對(duì)獲胚數(shù)的影響

在本試驗(yàn)中，選擇不同的超排藥物組合，取得了不一樣的超排結(jié)果，且兩組數(shù)據(jù)之間差異顯著（P＜0.05），100 IU/支組平均獲得的胚胎數(shù)高于500 IU/支組，見(jiàn)表2。

表2 超排藥物組合對(duì)獲胚胎數(shù)的影響

2.3 沖胚管在子宮角內(nèi)放置位置與獲胚數(shù)的關(guān)系

對(duì)沖胚管氣球放置在子宮角內(nèi)的位置對(duì)獲胚胎數(shù)的影響，以及子宮角大彎前段與子宮角大灣段平均獲胚胎數(shù)的關(guān)系進(jìn)行研究，結(jié)果顯示，沖胚管氣球放置在子宮角大彎前段獲胚數(shù)優(yōu)于子宮角大灣段，且差異明顯（P＜0.05），見(jiàn)表3。

表3 沖胚管子宮角內(nèi)不同放置位置對(duì)獲胚數(shù)的影響

2.4 胚胎移植時(shí)子宮角打孔出血率與受胎率的關(guān)系

胚胎在移植時(shí)，需要在子宮角小彎處打孔，前期研究者一般使用回形針打孔，打孔后子宮角打孔部位出血明顯，本研究中使用了子宮角打孔器（專利號(hào)：ZL 2015 2 0272750.4）打孔，子宮角打孔部位出血現(xiàn)象極顯著減少（P＜0.01）。因?yàn)槌鲅壤慕档?，受胎率顯著提高（P＜0.05），見(jiàn)表4。

表4 子宮角不同打孔方式出血率與受胎率

3 討論

本研究從體況評(píng)分、超排方法、沖胚管放置位置和子宮角打孔等方面對(duì)綿羊胚胎移植影響因素進(jìn)行了試驗(yàn)與分析。研究表明，體況評(píng)分在2.5～3.0分之間的供體羊獲得的可用胚胎數(shù)高于評(píng)分為4.0分的供體羊，且差異顯著（P＜0.05）。不同超排藥物組之間也存在顯著性差異（P＜0.05）。沖胚管氣球在子宮內(nèi)所在位置對(duì)獲得胚胎數(shù)方面存在顯著性差異，本研究對(duì)氣球放在子宮角大彎處和大灣前所獲得的胚胎數(shù)進(jìn)行了對(duì)比，從研究數(shù)據(jù)可以看出，氣球放在子宮角大彎前獲得的胚胎數(shù)多于子宮角大彎處，且差異顯著（P＜0.05），除此之外，在對(duì)供體進(jìn)行沖胚操作時(shí)，應(yīng)根據(jù)子宮的體積大小、子宮角長(zhǎng)短和子宮角粗細(xì)等因素來(lái)綜合判定沖胚管氣球所處的位置，只有通過(guò)綜合判斷，恰當(dāng)放置沖胚管氣球位置才能取得較好的沖胚效果。最后，還研究了鈍性（曲別針）打孔和打孔器打孔對(duì)受胎率的影響，通過(guò)分組數(shù)據(jù)可以看出，采用鈍性（曲別針）打孔，子宮角出血率較高，達(dá)到83.93%，而采用打孔器打孔，出血率僅為8.41%，差異極顯著（P＜0.01）。子宮角打孔出血直接影響移植受胎率，從試驗(yàn)數(shù)據(jù)可以看出，子宮角打孔器打孔獲得受胎率極顯著高于鈍性（曲別針）打孔（P＜0.01）。