ZIF-8納米載體的制備及負載黃芩素性能研究

時慧 ，汪河濱 ，連培涵 ，楊玲*

(1塔里木大學生命科學學院，新疆 阿拉爾 843300)

（2塔里木盆地生物資源保護利用重點實驗室，新疆 阿拉爾 843300）

（3天水師范學院，甘肅 天水 741001）

金屬-有機骨架（metal-organic framework，MOF）作為一種有序結晶結構且含有雜化晶態(tài)的配位聚合物多孔材料［1-2］，應用領域十分廣泛［3］。其中類沸石咪唑酯金屬骨架是MOFs材料中的一個重要分支［4］，在藥物遞送領域最具代表性的類沸石咪唑酯金屬骨架是ZIF-8，其有較高的藥物負載率、生物易降解性、多功能性和良好的生物相容性［5］。

黃芩素是高活性黃酮類化合物，能夠通過促進胰島素分泌，增加胰島素的敏感度從而降低血糖水平，同時也具備抗菌消炎、免疫調節(jié)、保肝利膽、抗氧化等多種藥理作用［6-7］。但黃芩素半衰期短、水溶性差且體內易分解、生物利用率低等缺點，導致黃芩素在生物體內的使用受到制約［8-9］。

本研究以金屬離子Zn2+和有機配體2-甲基咪唑（2-Methylimidazole，2-MI）制備不同粒徑的ZIF-8納米顆粒［10-13］，并探討鋅鹽種類、參與反應原料之間的摩爾比例、反應的溫度對產(chǎn)物形貌及結構方面的影響，對比篩選出結晶度高、晶型好的反應條件來制備載體。通過藥物分子和金屬離子之間的靜電相互作用將BA包裹于ZIF-8中形成新型納米給藥體系，解決黃芩素在溶液中易氧化，在堿性［14］條件下易降解的問題。用ZIF-8負載黃芩素后增加對酸環(huán)境的響應性釋放功能，在體內緩慢釋放，延長藥物的作用時間，從而減少用藥頻率避免藥物突釋后不能被及時有效吸收造成的浪費。同時ZIF-8作為載藥材料又具有優(yōu)異的化學穩(wěn)定性、熱穩(wěn)定性、細胞毒性低及簡單易制備等優(yōu)點，可廣泛應用于納米給藥系統(tǒng)［15-19］。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與儀器設備

甲醇（AR）和無水乙醇（AR）購自天津市鑫鉑特化工有限公司；六水合硝酸鋅（AR，99%）購自國藥集團化學試劑有限公司；二水合乙酸鋅（AR，98%）和2-甲基咪唑（98%）購自上海麥克林生化科技有限公司。

LGJ-10C型冷凍干燥機，北京四環(huán)科學儀器廠有限公司；Apreo-S場發(fā)射掃描電子顯微鏡，賽默飛世爾科技有限公司；D8 Advance型X射線多晶衍射儀，德國Bruker公司，測試電壓40 kV，電流40 mA，輻射源Cu Kα，λ=0.15418 nm，步長0.02°，測試速度0.1 s/step，掃描范圍2θ=5°～80°；UV-2600型紫外-可見分光光度計，島津儀器有限公司，測試掃描范圍200～800 nm，精準度1 nm；ZEN3700型Zeta電位儀，英國Malvern有限公司；Frontier型紅外光譜儀，Perkin Elmer有限公司，測量波長范圍是4000～450 cm-1，精準度1 cm-1。

測得實驗數(shù)據(jù)采用Origin 2018軟件進行繪制分析，掃描電鏡圖用Adobe Photoshop 2021軟件處理。

1.2 試驗方法

1.2.1 ZIF-8的制備

分別采用硝酸鋅、乙酸鋅作為金屬源，稱取1 mmol鋅鹽溶解于10 mL甲醇，形成溶液A；按不同摩爾比稱取2-甲基咪唑溶解于30 mL甲醇，形成溶液B。將溶解后的A、B溶液快速混合，密封攪拌12 h，高速離心收集沉淀，用甲醇洗滌3次除去未反應的原料和雜質。在80℃烘箱中放置6 h干燥后研磨得到白色的固體粉末即為ZIF-8。對比探究不同金屬陰離子、反應物摩爾比例、溫度對產(chǎn)物的影響，如表1所示。采用SEM觀察其形貌及大小，采用FTIRXRD對其進行結構表征。

表1 不同反應條件設置表

1.2.2 藥物的裝載

按質量比為1∶4稱取黃芩素與ZIF-8分別加入適量無水乙醇，超聲至藥物完全溶解、ZIF-8分散均勻，混合后密封遮光，室溫攪拌24 h，用無水乙醇反復離心洗至上清液無色后，低溫冷凍干燥得到BA＠ZIF-8。采用掃描電鏡觀察其形貌及大小。

1.2.3 載藥率和包封率計算

配置1 mg/mL的黃芩素無水乙醇溶液作為儲備液，分別取不同體積的儲備液于10 mL的容量瓶中，定容后得到 17 μg/mL、15 μg/mL、13 μg/mL、11 μg/mL、9 μg/mL、7 μg/mL、5 μg/mL的黃芩素溶液，通過紫外-可見分光光度法測量各溶液在325 nm處的吸光度值，繪制標準曲線。

將經(jīng)過真空冷凍干燥的BA＠ZIF-8粉末于10 mL容量瓶中，加入30 μL的1 mol/L鹽酸和5 mL無水乙醇振蕩混勻3 min，至溶液呈澄清透明的淡黃色無沉淀后定容，在325 nm處測得溶液OD值，使用以下公式計算其包封率（EE）和載藥率（DLC）：

式（1）、式（2）中：mA為復合物中黃芩素的質量，mg；mB為BA＠ZIF-8復合物的總質量，mg；mC為稱取的黃芩素總質量，mg。

1.2.4 黃芩素的穩(wěn)定性

用移液槍吸取5 mL上述黃芩素貯備液分別溶于45 mL不同pH值 (pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2)的磷酸緩沖溶液和無水乙醇中，用封口膜密封后于暗處磁力攪拌，當攪拌0.2 h、0.5 h、1 h、3 h、6 h、12 h時，分別取樣1 mL于容量瓶中用乙醇稀釋定容并測量325 nm處的OD值，計算溶液中黃芩素的量。

1.2.5 BA＠ZIF-8的藥物釋放

將稱取的20 mg BA＠ZIF-8均勻分散在pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2的磷酸緩沖溶液中，密封后于暗處攪拌，當攪拌0.25 h、1 h、2 h、4 h、6 h、14 h、24 h、36 h、48 h、72 h、96 h時，分別取樣2 mL離心后倒掉上清液保留沉淀，加入30 μL的1 mol/L鹽酸溶解，釋放出材料中剩余的黃芩素，用無水乙醇稀釋定容后測量325 nm處的OD值以計算剩余黃芩素的質量，并繪制BA釋放量曲線。

式（3）中：mB為BA＠ZIF-8復合物的總質量，mg；mD為復合物中剩余的黃芩素質量，mg。

2 結果與分析

2.1 ZIF-8多孔納米載體材料的制備工藝

制備不同粒徑、形貌的ZIF-8，SEM如圖1所示。由圖1（a）分析可知，采用乙酸鋅作為金屬源制備的ZIF-8，顆粒表面比較粗糙近似球形，大小不均勻。由圖1（b）分析可知，采用硝酸鋅作為金屬源制備的材料呈十二面體形貌，尺寸均一且邊緣棱角明顯，說明物質的結晶較好。由圖1（c）分析可知，采用硝酸鋅作為金屬源，在40℃下攪拌4 h制備出的ZIF-8，粒徑均低于100 nm。通過改變不同的反應條件對比發(fā)現(xiàn)提高2-甲基咪唑與鋅離子的反應比例和提高反應溫度都可以使晶體粒徑變小，提高反應比例是在形成晶核后通過在晶核表面吸附過量的中性配體從而減緩晶核的增長，而提高反應溫度可以加快晶體的成核速度，相比之下提高溫度的效果更顯著，且避免了試劑的浪費。

圖1 不同粒徑、形貌的ZIF-8的SEM圖

分別以硝酸鋅、乙酸鋅作為金屬源與2-甲基咪唑采用1∶8配比室溫攪拌12 h制備的ZIF-8樣品XRD如圖2（a）所示，樣品測得多個彼此獨立且很窄的“尖峰”，這些特征衍射峰與文獻中衍射峰一致［15］，依 次 對 應 (001)、(002)、(112)、(022)、(013)、(222)晶面。由此證明硝酸鋅與乙酸鋅作為金屬源均能成功制備出ZIF-8。不同金屬源和物料比制備出的ZIF-8載體材料的衍射峰強度存在很大區(qū)別，其中硝酸鋅制備ZIF-8的衍射峰相對更強，說明其晶型好、結晶度高。由圖2（b）分析可知，硝酸鋅與 2-甲基咪唑分別采用 1∶4、1∶6、1∶8 配比制備出ZIF-8的XRD圖發(fā)現(xiàn)其在小角區(qū)的衍射峰，即（001）晶面的峰位隨物料比增大而向大角度偏移，且峰強度減弱，說明晶體尺寸減小。綜合考慮，后續(xù)反應條件選擇硝酸鹽（1∶4）室溫攪拌12 h制備的ZIF-8為藥物載體材料。

圖2 不同金屬源與2-甲基咪唑反應得到ZIF-8的XRD圖

2.2 載藥ZIF-8納米粒的表征

采用SEM觀測制備的ZIF-8、BA＠ZIF-8形貌，如圖3（a）、圖3（b）所示。晶體形貌皆呈規(guī)則性的菱形十二面晶體形態(tài)，與文獻［20-21］中的形貌相符，且粒徑大小較為均一。負載黃芩素后材料表面變粗糙，但整體形貌變化不大。

圖3 （a）ZIF-8與（b）BA＠ZIF-8的SEM圖

對比黃芩素標準品、ZIF-8和BA＠ZIF-8載藥系統(tǒng)的FTIR如圖4所示，分析可知，由于黃芩素含有豐富的羥基，導致在3411 cm-1處形成較大的特征吸收峰，與BA＠ZIF-8中3428 cm-1處的特征峰類似，而ZIF-8中并不存在O—H鍵伸縮振動。同時BA＠ZIF-8載藥系統(tǒng)中在1448～1629 cm-1處也同樣出現(xiàn)了黃芩素由于苯環(huán)骨架振動產(chǎn)生的吸收峰，ZIF-8中1578 cm-1處的峰歸屬于C＝N伸縮振動峰，在BA＠ZIF-8中藍移至1580 cm-1處，由此可以證明黃芩素確實與ZIF-8成功復合。

圖4 BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的FTIR圖

使用Zeta電位分析儀分別檢測了BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的去離子水分散膠體溶液，分析膠體微粒的電位情況，以此來判斷藥物負載是否成功。如圖5所示，BA材料的Zeta電位為-47.4 mV、ZIF-8的Zeta電位為22 mV，同時ZIF-8的負載藥物BA后的Zeta電位由于ZIF-8表面的負電性被BA的負載部分所中和導致其顯著降低至-21.4 mV，由此證明ZIF-8材料成功負載黃芩素。

圖5 BA、ZIF-8、BA＠ZIF-8的Zeta電位

2.3 藥物裝載與釋放

2.3.1 載藥率及包封率

為計算BA＠ZIF-8中黃芩素的包封率與載藥率，精準繪制黃芩素標準曲線：A=0.04864C-0.05921（r2=0.99955）。如圖6所示黃芩素溶液在5～17 μg/mL范圍內呈良好的線性關系。取10 mg BA＠ZIF-8，將其放置于容量瓶中并添加1 mol/L鹽酸搖勻使其分解后定容，在325 nm處檢測吸光度值代入標準曲線得到其載藥率為14.89%，包封率為74.45%。

圖6 黃芩素標準曲線

2.3.2 藥物的穩(wěn)定性

黃芩素的結構中含有3個酚羥基，其化學性質并不穩(wěn)定，在溶液中容易發(fā)生化學降解。含有羥基的黃酮易被氧化為醌類衍生物，相關文獻［14］對黃芩素降解產(chǎn)物進行了結構鑒定，主要有黃芩素的化學合成前體木蝴蝶素、6，7位鄰醌衍生物、苯甲酸苯酯類衍生物等。為了探究BA＠ZIF-8中黃芩素穩(wěn)定性是否提高，測定了游離黃芩素在不同pH條件下的穩(wěn)定性。如圖7所示，溶解在無水乙醇溶液中黃芩素在1 h后有少量分解，這是由于輕微氧化的原因，在偏酸性環(huán)境下(pH 5.4、pH 6.8)黃芩素相對穩(wěn)定降解較少，在12 h后剩余約86.16%、84.53%的黃芩素，穩(wěn)定性較好。在弱堿性條件下(pH 7.2)黃芩素穩(wěn)定性差［22］，可以看到黃芩素在前1 h內快速降解，剩余37.87%，6 h后剩余黃芩素的降解趨于平緩，剩余33.47%。

圖7 不同pH條件下和無水乙醇中黃芩素隨時間的變化曲線

2.3.3 BA＠ZIF-8在不同pH條件下的藥物釋放

由于胃腸道周圍環(huán)境呈弱酸性，而ZIF-8是一種具有酸響應性的框架材料，在酸性條件下，ZIF-8結構會崩塌并釋放出包載的藥物。為了探究在酸性環(huán)境下BA＠ZIF-8中黃芩素的釋放行為，對BA＠ZIF-8的酸響應釋放行為進行測試。將BA＠ZIF-8分散在pH 5.4、pH 6.8、pH 7.2的PBS溶液中，每隔一段時間取出少量溶液離心保留沉淀，加入1 mol/L鹽酸分解ZIF-8，對于載體中剩余黃芩素含量持續(xù)觀測96 h，繪成曲線如圖8所示，證明BA＠ZIF-8包載的黃芩素的釋放行為具有明顯的pH響應性。在pH 5.4、pH 6.8和pH 7.2環(huán)境下黃芩素在前4 h釋放速率較快，釋放量分別為57.01%、38.97%、28.10%，4 h后釋放速率逐漸變小，96 h后在pH 5.4和pH 6.8環(huán)境下的釋放量達到87.81%、85.53%，而pH 7.2環(huán)境下累計釋放量為74.39%，表明酸性條件下更有利于藥物BA的釋放。出現(xiàn)這種情況是因為較多的黃芩素大部分堆積在ZIF-8接近外表面的孔道中，進入內部中心孔道的量相對較少?？梢夿A＠ZIF-8具有酸響應釋放的功能，能夠有針對性的釋放所包載的黃芩素。

圖8 BA＠ZIF-8在不同pH條件下黃芩素隨時間變化的釋放曲線

3 結論

本實驗通過常溫攪拌法設計合成了一種負載黃芩素的ZIF納米材料BA＠ZIF-8。首先制備出結晶度高、形貌好的三維納米載體材料，進一步合成BA＠ZIF-8復合納米粒，通過對BA＠ZIF-8納米粒的多種表征確定，黃芩素不是簡單吸附在材料表面而是被封裝在ZIF-8框架材料的孔道中，其表面形貌與未負載藥物的ZIF-8一致，為十二面體結構，適宜的黃芩素添加量并不影響ZIF-8的晶型。藥物釋放實驗得到的結果充分的證明了BA＠ZIF-8具有較高的包封率和載藥率，其在酸環(huán)境中也具有響應行為。在酸性條件下BA＠ZIF-8會緩慢釋放其包載的黃芩素，96 h后在pH 5.4、pH 6.8和pH 7.2環(huán)境下黃芩素的累積釋放量分別達到87.81%、85.53%、74.39%。采用ZIF-8作為黃芩素載體在藥物負載的同時具有一定的選擇性，能有針對性地作用于身體的某一特定部位，有利于實現(xiàn)裝載黃芩素的pH響應性釋放。