羊痘病毒宿主范圍基因063缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

柳璇 ，高娜，王玉婷，張成，李有文*

（1塔里木大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾 843300）（2新疆生產(chǎn)建設(shè)兵團(tuán)塔里木動(dòng)物疫病診斷與防控工程實(shí)驗(yàn)室，新疆 阿拉爾 843300）

羊痘是由羊痘病毒感染山羊、綿羊和牛等反芻動(dòng)物引起的一種烈性傳染病。病畜以發(fā)熱、全身起痘為典型特征［1］，羊群感染后有極高的死亡率，對(duì)養(yǎng)羊業(yè)及國際貿(mào)易造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。羊痘病毒屬的三個(gè)成員均表現(xiàn)嚴(yán)格的宿主范圍限制，通常只感染相應(yīng)的本病動(dòng)物，但近年來羊痘病毒跨物種感染的現(xiàn)象時(shí)有報(bào)道，甚至有羊痘病毒感染人的報(bào)道［2］，說明羊痘病毒的組織嗜性在發(fā)生改變，存在跨物種感染或傳播的風(fēng)險(xiǎn)。目前對(duì)于痘病毒的研究主要集中在痘苗病毒上，而有關(guān)宿主范圍因子（Hrf）的研究才剛起步［3］，對(duì)羊痘病毒Hrf的了解也是由痘苗病毒Hrf的同系物推測(cè)得到，并無實(shí)驗(yàn)室研究結(jié)果。

痘病毒在長期進(jìn)化過程中，已衍化出一組特有的針對(duì)靶細(xì)胞抗病毒信號(hào)途徑起作用的蛋白，這些蛋白稱之為Hrf，編碼這些Hrf的基因稱為Hrg［3］。痘病毒Hrf與宿主細(xì)胞抗病毒之間的互作動(dòng)態(tài)決定其能否發(fā)生感染，即Hrf通過調(diào)節(jié)靶細(xì)胞的酶活性，抑制細(xì)胞凋亡，對(duì)抗干擾素作用等，為病毒的增值提供適宜的微環(huán)境。目前對(duì)于痘病毒Hrf調(diào)控干擾素的機(jī)制較為清楚，但對(duì)宿主細(xì)胞其他信號(hào)通路的調(diào)控還需深入研究［4］。有研究發(fā)現(xiàn)，已知的多種痘病毒的Hrf不僅影響病毒的毒力，而且決定了感染宿主的范圍［5］。到目前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)15個(gè)基因具有痘病毒宿主范圍功能，根據(jù)功能特征將其分成12個(gè)基因家族，但沒有一個(gè)Hrg同時(shí)存在于所有痘病毒中［6］。

羊痘病毒063基因是痘苗病毒Hrf C7L的同系物［5］，因此推斷063基因可能是羊痘病毒的Hrf，但還需進(jìn)一步證實(shí)。羊痘病毒063基因位于病毒基因組的核心區(qū)域，一般認(rèn)為核心區(qū)域基因的功能主要與病毒生長繁殖必需的功能蛋白表達(dá)有關(guān)，而兩側(cè)翼區(qū)的基因則主要表達(dá)與病毒毒力和宿主范圍有關(guān)的蛋白［7］，因此位于核心區(qū)的063基因成為Hrg以及其所起的作用就成為很多學(xué)者關(guān)注的問題。為了研究063基因Hrf的功能及生物特性，構(gòu)建063基因缺失的重組羊痘病毒非常關(guān)鍵。本研究構(gòu)建了Hrf 063基因缺失的表達(dá)載體，通過同源重組得到了063基因缺失的重組羊痘病毒，雖未得到純化的重組病毒，但初步了解了羊痘病毒063基因的生物學(xué)特性，為進(jìn)一步研究羊痘病毒Hrf奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 毒株、菌株和細(xì)胞

PEGFP-SP質(zhì)粒、克隆載體PEASY-T1 Cloning-Vector、大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞、羔羊睪丸原代細(xì)胞和課題組前期收藏的山羊痘病毒SS株、TS株以及疫苗株均保藏于塔里木大學(xué)畜牧科技重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

1.1.2 主要藥品及試劑

2×EasyTaq PCR SuperMix、Trans 2K DNA Marker，購自大連寶生物科技有限公司；PEASY-T1 Cloning Vector載體，購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；BamHI、XhoI限制性內(nèi)切酶、Golden View/loading buffer，購自Thermo公司；DNA純化回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒，購自北京天根生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司。

1.1.3 主要使用儀器

SW-CJ-2FD超凈工作臺(tái)（上海博訊實(shí)業(yè)有限公司），小型臺(tái)式微量離心機(jī)（eppendorf），梯度PCR儀（Bio-Rad生命科學(xué)有限公司），DYY-7C型瓊脂糖水平電泳儀（北京市六一儀器廠），GEL DOC XR+凝膠成像系統(tǒng)（Bio-Rad生命科學(xué)有限公司），ZXGPB2160隔水恒溫式培養(yǎng)箱（上海智城分析儀器制造有限公司），ZWYR-200D臺(tái)式恒溫?fù)u床（上海智城分析儀器制造有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank中已公布的山羊痘病毒Pellor株（GeneID：5228351)中063基因60 bp的側(cè)翼序列及GFP序列，運(yùn)用Primer Premie 6.0軟件設(shè)計(jì)overlap PCR特異引物，并將其送至武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司進(jìn)行合成，引物序列如表1所示。

表1 特異引物

1.2.2 GFPΔ063基因擴(kuò)增、鑒定與回收

PCR擴(kuò)增反應(yīng)體系：濃度為10 μmol/L的上下游引物各2.4 μL，2×EasyTaq PCR SuperMix 50 μL，模板（PEGFP-SP質(zhì)粒）6 μL，ddH2O 39.2 μL，總反應(yīng)體系100 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s；50 ℃30 s；72 ℃ 90 s；35個(gè)總循環(huán)；72 ℃ 10 min；12℃自動(dòng)保存。反應(yīng)結(jié)束后將PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定回收，用實(shí)驗(yàn)室購買的DNA純化回收試劑盒（按照說明書進(jìn)行操作）回收所需要的目的基因片段。

1.2.3 基因缺失表達(dá)載體的構(gòu)建

將回收的GFPΔ063基因與PEASY-T1 CloningVector載體按照下列體系進(jìn)行連接反應(yīng)：GFPΔ0634 μL，載體（PEASY-T1 Cloning Vector）0.5 μL，ddH2O 0.5 μL，反應(yīng)總體系5 μL，在梯度PCR儀中25℃控溫連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化于大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞，涂布于AMP抗性的培養(yǎng)基上過夜培養(yǎng)，挑取單菌落進(jìn)行菌液PCR初步鑒定，對(duì)陽性菌落搖菌培養(yǎng)提取質(zhì)粒（按照質(zhì)粒小提試劑盒說明書操作）。

1.2.4 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將提取的PEASY-Δ063-GFP重組質(zhì)粒分別使用限制性內(nèi)切酶BamHI、XhoI 37℃水浴酶切3～4 h。酶切體系：質(zhì)粒5 μL，Thermo Scientific10×Buffer Tango 1 μL，BamHI、XhoI各 0.5 μL，ddH2O 3 μL，總反應(yīng)體系10 μL，反應(yīng)結(jié)束后用1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，經(jīng)酶切鑒定正確的質(zhì)粒送去武漢天一輝遠(yuǎn)生物有限公司測(cè)序。

1.2.5 病毒重組

復(fù)蘇一支凍存的羔羊睪丸原代細(xì)胞，生長良好后傳代于12孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)至單層細(xì)胞長至80%～90%時(shí)，吸取培養(yǎng)液，用PBS洗3次。接種山羊痘病毒10 μL（IgTCID50=10-4.375/0.1 mL），37 ℃吸附1 h，吸棄病毒液，加入含2%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h。用脂質(zhì)體Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染PEASY-Δ063-GFP重組質(zhì)粒，參考米麗開姆·托合提尼亞孜［8］的方法，并于轉(zhuǎn)染后24 h、36 h、48 h分別置于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況，并挑取熒光斑點(diǎn)。

1.2.6 重組病毒的純化篩選

將以上重組的063基因缺失帶熒光的SS株、TS株和疫苗株重組病毒分別進(jìn)行10-1～10-10的倍比稀釋，分別接種至培養(yǎng)密度90%的羔羊睪丸原代細(xì)胞，添加含有2%FBS和100 ug/mL雙抗的DMEM培養(yǎng)基，在37℃、5% 的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3 d，并適時(shí)觀察，待最強(qiáng)熒光斑點(diǎn)出現(xiàn)，吸取上清液，加入用2%FBS的DMEM培養(yǎng)基配制的低熔點(diǎn)瓊脂糖固定，在倒置熒光顯微鏡下挑取帶有熒光的斑點(diǎn)，特別是高稀釋倍數(shù)孔中的熒光斑點(diǎn)，反復(fù)凍融后，將帶熒光培養(yǎng)物進(jìn)行倍比稀釋，再接種羔羊睪丸原代細(xì)胞，挑取熒光，如此重復(fù)至重組病毒純化。

2 結(jié)果

2.1 GFPΔ063基因PCR擴(kuò)增鑒定

GFPΔ063基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳儀鑒定得到大小為900 bp條帶，與預(yù)測(cè)結(jié)果一致（如圖1所示）。

圖1 羊痘病毒GFPΔ063基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果

2.2 重組質(zhì)粒的雙酶切鑒定

將GFPΔ063基因與載體的連接產(chǎn)物經(jīng)菌液PCR鑒定陽性的PEASY-Δ063-GFP重組質(zhì)粒做BamHI、XhoI雙酶切鑒定，電泳結(jié)果顯示有4000 bp與900 bp大小的兩個(gè)條帶（如圖2所示），與理論相符，測(cè)序結(jié)果表明載體構(gòu)建正確。

圖2 羊痘病毒PEASY-Δ063-GFP重組質(zhì)粒雙酶切鑒定結(jié)果

2.3 病毒重組、重組病毒純化篩選

1）將培養(yǎng)好的羔羊睪丸原代細(xì)胞在12孔細(xì)胞板中傳代，培養(yǎng)至單層細(xì)胞密度為80%～90%，細(xì)胞呈梭形貼壁生長時(shí)（如圖3所示），接種山羊痘病毒，培養(yǎng)48 h后，細(xì)胞形態(tài)拉長、間隙變大，病毒在細(xì)胞中生長良好（如圖4所示）。

圖3 羔羊睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

圖4 接種山羊痘病毒的羔羊睪丸原代細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果

2）將PEASY-Δ063-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到羊痘病毒感染的羔羊睪丸原代細(xì)胞中，5～6 h后換液，分別在12 h、24 h、48 h觀察重組結(jié)果。發(fā)現(xiàn)只有PEASY-Δ063-GFP重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入羊痘病毒感染的羔羊睪丸原代細(xì)胞得到了熒光場(chǎng)帶有熒光斑點(diǎn)的SS株、TS株、疫苗株063基因缺失的重組病毒（如圖5所示）。挑取倒置顯微鏡下帶有熒光的重組病毒斑點(diǎn)，倍比稀釋后接種細(xì)胞傳代純化重組病毒。結(jié)果傳代病毒沒有表達(dá)熒光，表明重組病毒傳代無法形成子代病毒，最終未能得到純化的重組病毒。

圖5 SS株、TS株、疫苗株063基因缺失的重組病毒結(jié)果

3 討論

本研究根據(jù)已在GenBank上發(fā)表的山羊痘病毒株（登錄號(hào)為NC004003.1）中063基因序列及其兩側(cè)的側(cè)翼序列（約60 bp）與GFP基因上下游特異引物組成overlap PCR的引物，擴(kuò)增GFP基因，將其插入克隆載體中作為構(gòu)建重組病毒表達(dá)載體的報(bào)告基因。這種構(gòu)建方法是直接用報(bào)告基因GFP替換掉了063基因，以063基因本身的啟動(dòng)子作為重組病毒報(bào)告系統(tǒng)的啟動(dòng)子，一方面簡化構(gòu)建過程，不需要專門擴(kuò)增克隆報(bào)告基因的啟動(dòng)子；另一方面GFP作為報(bào)告基因，其表達(dá)的熒光容易觀察，只要在熒光顯微鏡下觀察到綠色熒光就可以證明重組成功。

一般認(rèn)為在構(gòu)建重組表達(dá)載體時(shí)，同源臂越長重組效率越高，但同源臂越長，構(gòu)建過程也會(huì)越復(fù)雜。楊勇飛等［9］研究ANK基因時(shí)選用約300 bp的同源臂，用Overlap PCR的方法經(jīng)過3步擴(kuò)增才得到報(bào)告系統(tǒng)。本研究中用了約60 bp的同源臂，利用Overlap PCR的方法1步就得到了報(bào)告基因系統(tǒng)，較大的簡化了步驟。重組結(jié)果顯示，本次構(gòu)建的重組病毒表達(dá)載體轉(zhuǎn)染羊痘病毒感染的羔羊睪丸原代細(xì)胞后，得到大量帶有綠色熒光的細(xì)胞，且熒光強(qiáng)度較高，說明表達(dá)載體與病毒基因組發(fā)生了重組，并使報(bào)告基因得到了表達(dá)，此結(jié)果甚至比楊勇飛等［9］選用同源臂為300 bp表達(dá)載體重組的效率還要高，說明對(duì)構(gòu)建同源重組病毒來講，同源臂的長度達(dá)到60 bp就可以構(gòu)建成功。同源重組中同源臂的長度不是影響重組效率的絕對(duì)因素，可能同源臂的相似性、目的基因的特性起著更為重要的作用，在重組病毒時(shí)需要全面分析。

另外，重組病毒的穩(wěn)定性對(duì)于得到一株重組病毒非常重要。在本研究中，063基因的重組表達(dá)載體雖然轉(zhuǎn)染后得到了高效表達(dá)的GFP，且在3個(gè)羊痘病毒株上得到了相同的結(jié)果，但當(dāng)挑取熒光斑點(diǎn)進(jìn)行傳代純化時(shí)卻無法得到表達(dá)的熒光和純化的063基因缺失的重組病毒。經(jīng)分析認(rèn)為可能與063基因本身的生物學(xué)特性有關(guān)系，該基因位于病毒基因組核心區(qū)，若被破壞或缺失可能會(huì)導(dǎo)致病毒不能正常生長繁殖，或者基因組中編碼結(jié)構(gòu)蛋白的區(qū)域被敲除，使病毒缺失了增殖所必需的衣殼或囊膜，從而直接導(dǎo)致病毒不能正常出膜［10］，不能形成子代病毒；也可能與決定病毒的細(xì)胞嗜性方面有關(guān)。前人通過粘液瘤病毒C7L同源序列的M062R、M063R和M064R的敲除試驗(yàn)表明，M063R的缺失影響病毒在兔源細(xì)胞系的復(fù)制，而M062R缺失影響其在BG-MK、RK13、RL-5和人源細(xì)胞中的復(fù)制［11-12］。經(jīng)重組病毒研究證實(shí)，重組M062RDE VACV（C7L和K1L缺失性）可以拯救M062RDE VACV在鼠3T3、Hela和A431細(xì)胞中的復(fù)制，但無法實(shí)現(xiàn)M063R和M064R的復(fù)制，表明這三者在決定病毒的細(xì)胞嗜性方面存在差異［13］，這種嗜性不僅受病毒自身編碼的Hrf決定，也與病原和宿主間的相互作用有關(guān)［5］。本研究中063基因缺失的重組病毒，可能因063 Hrg缺失而影響了病毒增值的功能，降低了病毒對(duì)細(xì)胞的嗜性，導(dǎo)致重組病毒不能正常形成子代病毒。幾乎所有的痘病毒都能結(jié)合并入侵哺乳動(dòng)物細(xì)胞，其入胞后下游的一系列胞內(nèi)事件決定了病毒復(fù)制的限制性［14-15］。

相比較張雪萍［16］和米麗開姆·托合提尼亞孜［8］使用同樣的方法分別得到了ANK141.2基因和KLP2基因缺失并純化的重組羊痘病毒，二者均為病毒側(cè)翼區(qū)的非必需基因，能在傳代純化中正常增值形成子代病毒。位于核心區(qū)063基因可能因其是Hrg，該基因缺失將導(dǎo)致重組病毒無法正常傳代純化，形成子代病毒，但在重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)染被羊痘病毒感染的細(xì)胞后能夠產(chǎn)生大量帶熒光的細(xì)胞，可能是重組表達(dá)載體中的報(bào)告基因在細(xì)胞中與羊痘病毒基因組發(fā)生了重組，并且該重組的基因片段也在病毒自身酶調(diào)節(jié)和細(xì)胞的表達(dá)系統(tǒng)中進(jìn)行了轉(zhuǎn)錄和翻譯并表達(dá)出了GFP，但在病毒包裝出膜的過程中，重組的基因能否被順利包裝形成成熟的病毒粒子，在形成的病毒粒子中能否正常發(fā)揮生物功能都無法確定，也可能是重組病毒在子代復(fù)制重組時(shí)和之前感染細(xì)胞的病毒發(fā)生了重組形成返祖結(jié)果［17］，出現(xiàn)了與本研究一樣的結(jié)果。表明，構(gòu)建重組病毒時(shí)，初次轉(zhuǎn)染就能觀察到病毒重組的現(xiàn)象并不困難，但是能夠得到傳代并純化的重組病毒才更為重要。

4 結(jié)論

本研究成功構(gòu)建了Hrg 063缺失的表達(dá)載體PEASY-Δ063-GFP，表達(dá)載體經(jīng)轉(zhuǎn)染篩選得到了063基因缺失的山羊病毒SS株、TS株和疫苗株3個(gè)毒株重組病毒，但重組病毒卻不能正常傳代，無法得到純化的重組病毒。063基因缺失表達(dá)載體的構(gòu)建為063基因生物學(xué)功能的研究奠定了基礎(chǔ)。