產(chǎn)胞外多糖的蘇云金芽孢桿菌的篩選及發(fā)酵工藝優(yōu)化

楊靜，高澤鑫，朱莉，詹曉北*

1(糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122) 2(無(wú)錫格萊克斯生物科技有限公司，江蘇 無(wú)錫，214125)

多糖是組成細(xì)胞的重要成分之一，是除核酸、蛋白質(zhì)等生物大分子以外組成生命體的主要高分子有機(jī)化合物[1-2]。就生產(chǎn)成本而言，對(duì)多糖的研究主要來(lái)源于藻類(lèi)微生物，且微生物胞外多糖因其天然來(lái)源、穩(wěn)定性好、可降解性好、毒性低等特點(diǎn)而受到業(yè)界的青睞[3-5]。微生物的胞外多糖是菌株在生長(zhǎng)代謝調(diào)控過(guò)程中為適應(yīng)培養(yǎng)環(huán)境而產(chǎn)生的一種糖類(lèi)聚合物，其在細(xì)胞內(nèi)是由糖基單體通過(guò)多種代謝途徑，最終在轉(zhuǎn)移酶的作用下形成了膠囊型多糖(莢膜多糖)和松散型多糖(黏液多糖)[6]。

近年來(lái)隨著糖生物學(xué)的發(fā)展，微生物胞外多糖因其在產(chǎn)物結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)成本，生產(chǎn)周期以及獨(dú)特性能等方面所體現(xiàn)的優(yōu)勢(shì)而得到廣泛的研究與開(kāi)發(fā)[7]。不同的胞外多糖具有不同的空間結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)，這些結(jié)構(gòu)的多樣性對(duì)胞外多糖的發(fā)展應(yīng)用起到至關(guān)重要的作用。目前僅有少數(shù)的細(xì)菌胞外多糖進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)，如由土壤桿菌(Agrobacteriumsp.)產(chǎn)生熱凝膠，鞘氨醇單胞菌(Sphingomonassp.)產(chǎn)生威蘭膠以及野油菜黃單胞桿菌(XanthomonasCampestris)產(chǎn)生黃原膠[8]。據(jù)報(bào)道，微生物胞外多糖在不同的行業(yè)都有廣泛的應(yīng)用[9]，包括食品、制藥和化工，可以作為增稠劑、穩(wěn)定劑、乳化劑、黏合劑、成膜劑、膠凝劑和懸浮劑等。ZHONG等[10]、OERLEMANS等[11]研究表明，細(xì)菌來(lái)源的胞外多糖可以調(diào)節(jié)人體胃腸道微生物菌群，調(diào)節(jié)與宿主的相互作用，降低體內(nèi)膽固醇水平，進(jìn)而改善人體的免疫力。RAMAMOORTHY等[12]研究表明，海洋細(xì)菌蘇云金芽孢桿菌RSK CAS4胞外多糖具有良好的抗氧化性能以及潛在的抗癌性能。

當(dāng)前廣泛利用液態(tài)發(fā)酵法生產(chǎn)微生物胞外多糖以提高胞外多糖的產(chǎn)量，張紅艷等[13]研究發(fā)現(xiàn)胞外多糖的產(chǎn)量隨介質(zhì)成分的不同而變化，包括碳、氮、無(wú)機(jī)鹽離子和培養(yǎng)環(huán)境因素。該研究從發(fā)酵食品納豆中篩選出1株胞外多糖產(chǎn)量相對(duì)較高的菌株，發(fā)現(xiàn)該多糖溶液具有納豆激酶的活性，高澤鑫等[14]闡明納豆激酶可以溶解血栓，減緩血栓的形成，是一種天然產(chǎn)物，具有副作用小，安全性高的特點(diǎn)，因此有望成為抗血栓藥物的成分。由此借助優(yōu)化培養(yǎng)基的組成和發(fā)酵培養(yǎng)條件以進(jìn)一步提高胞外多糖的產(chǎn)量，為以后進(jìn)一步探索該多糖的活性研究做準(zhǔn)備。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)菌株

蘇云金芽孢桿菌BT-IX17保藏于江南大學(xué)糖生物制造與生物反應(yīng)器研究室。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑

葡萄糖、酵母提取物、胰蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4，均為分析純國(guó)藥集團(tuán)；黃豆餅粉，北京索萊寶科技有限公司；玉米漿，(上海)阿拉丁試劑有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及測(cè)定指標(biāo)

固體培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，NaCl 10.0，瓊脂粉20，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

活化培養(yǎng)基(g/L)：干酪素5.0，葡萄糖1.0，酵母提取物1.0，K2HPO41.0，KH2PO40.5，MgSO40.1，瓊脂粉20，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，115 ℃滅菌30 min。

種子培養(yǎng)基(搖瓶)(g/L)：葡萄糖10.0，酵母提取物8.0，玉米漿4.0，NaCl 3.0，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121 ℃滅菌30 min。

基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基(搖瓶)(g/L)：葡萄糖15.0，黃豆餅粉8.0，酵母提取物5.0，NaCl 3.0，調(diào)節(jié)pH 7.0～7.2，121 ℃ 滅菌30 min。

測(cè)定胞外多糖的方法如公式(1)所示，其中總糖含量采用苯酚-硫酸法[15]。

胞外雜多糖含量=發(fā)酵液中的總糖含量-培養(yǎng)基中殘?zhí)呛?/p>

(1)

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 目的菌株篩選及確定

菌株活化培養(yǎng)：將從納豆中篩選而來(lái)的菌株BT-IX17在活化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24 h，之后用接種環(huán)將菌株轉(zhuǎn)接到斜面固體培養(yǎng)基上，于恒溫細(xì)菌培養(yǎng)箱37 ℃倒置培養(yǎng)約24 h，最后置于4 ℃保存?zhèn)溆?。接著從保存的斜面上挑?環(huán)菌苔，轉(zhuǎn)接到固體培養(yǎng)基上。通過(guò)形態(tài)學(xué)分析，生理生化鑒定以及16S rDNA測(cè)序確定目的菌株類(lèi)型。

1.2.2 發(fā)酵培養(yǎng)基成分的優(yōu)化

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的成分和濃度為初始水平，選擇不同碳源(麥芽糖，蔗糖，果糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖)，氮源(黃豆餅粉，玉米漿，酵母粉，大豆蛋白胨，魚(yú)粉蛋白胨)和無(wú)機(jī)鹽離子(KH2PO4，K2HPO4，MgSO4，CaCO3，CaCl2，F(xiàn)eCl3，MnCl2，NaCl，Na2HPO4，NaH2PO4)，并確定最佳碳源質(zhì)量濃度(10.0、15.0、20.0、25.0 g/L)，氮源復(fù)配比(1∶1、2∶1、3∶1、3∶2、1∶2)(g∶g)和無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)。起始pH定為7.0，使用500 mL的檔口瓶裝100 mL的培養(yǎng)基，接種量為3%，在30 ℃，200 r/min下培養(yǎng)3 d。

1.2.3 發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化

采用上述優(yōu)化好的最佳培養(yǎng)基成分進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)化，測(cè)定不同接種量(2%、4%、6%、8%、10%)，pH(6.5、7.0、7.5、8.0)，裝液量(50、80、100、120 mL)及溫度(25、28、30、34、37 ℃)對(duì)菌株BT-IX17胞外多糖產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響。

1.2.4 Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化胞外多糖產(chǎn)量

依據(jù)上述1.2.2和1.2.3的單因素試驗(yàn)結(jié)果，利用Plackett-Burman設(shè)計(jì)(N=9)方案[16]，對(duì)培養(yǎng)基組分和發(fā)酵培養(yǎng)條件9種不同因素的重要性給予考察分析，以EPS產(chǎn)量(g/L)為響應(yīng)值，各因素水平別分設(shè)高低2個(gè)水平。

1.2.5 采用Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化

使用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)試驗(yàn)，采用響應(yīng)面法在3因素3水平上對(duì)EPS產(chǎn)量進(jìn)行優(yōu)化，設(shè)置EPS產(chǎn)量(g/L)為響應(yīng)值。

1.2.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

上述實(shí)驗(yàn)每組重復(fù)3次，以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”形式表示結(jié)果。在單因素試驗(yàn)中，使用Origin 9.0軟件作圖。Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)均采用Design-Expert 8.0.6軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理分析。

1.2.7 7 L發(fā)酵罐驗(yàn)證試驗(yàn)

根據(jù)上述優(yōu)化的最佳培養(yǎng)基成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行7 L發(fā)酵罐放大驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，依據(jù)Box-Benhnken實(shí)驗(yàn)中3個(gè)顯著因素，將初始葡萄糖質(zhì)量濃度調(diào)整為30.0 g/L，黃豆餅粉質(zhì)量濃度調(diào)整為15.0 g/L，調(diào)控轉(zhuǎn)速，其他參數(shù)設(shè)置同搖瓶?jī)?yōu)化結(jié)果，監(jiān)測(cè)發(fā)酵過(guò)程中各參數(shù)的變化。

1.2.8 EPS活性的初步探索納豆激酶活性研究

該菌株EPS經(jīng)提取發(fā)現(xiàn)具有納豆激酶活性，測(cè)定方法纖維蛋白降解法參考高澤鑫[17]的方法。

2 結(jié)果與分析

2.1 目的菌株的確定

經(jīng)過(guò)篩選對(duì)比和分離純化，獲得目的菌株。通過(guò)菌落的形態(tài)學(xué)分析(圖1)，菌株呈乳白色，不透明，邊緣呈不規(guī)則鋸齒狀，革蘭氏陽(yáng)性菌，有芽孢和伴孢晶體[18-19]。依據(jù)伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)[20]和常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：接觸酶實(shí)驗(yàn)、硝酸鹽還原實(shí)驗(yàn)、酪蛋白分解實(shí)驗(yàn)、水解明膠實(shí)驗(yàn)、V-P實(shí)驗(yàn)、溶血實(shí)驗(yàn)均呈陽(yáng)性；動(dòng)力性實(shí)驗(yàn)、甘露醇產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)、根狀生長(zhǎng)實(shí)驗(yàn)、耐鹽實(shí)驗(yàn)、檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)均呈陰性。

a-菌落形態(tài)；b-堿性復(fù)紅染色伴孢晶體；c-檸檬酸鹽利用實(shí)驗(yàn)圖1 菌株BT-IX17的生理生化鑒定Fig.1 The physiological and biochemical identification of strain BT-IX17

由上海生工公司進(jìn)行16S rDNA測(cè)序，并在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)上對(duì)比序列并結(jié)合生理生化實(shí)驗(yàn)，確定該菌株為蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)，并將其命名為BT-IX17菌株。利用MEGA 7.0.26軟件繪制菌株的分支系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[21](圖2)。

圖2 采用Neighbor-Joining構(gòu)建菌株BT-IX17的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)Fig.2 Using Neighbor-Joining to construct a phylogenetic tree of strain BT-IX17

2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 不同碳源及碳源濃度對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響

以基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中葡萄糖為對(duì)照，分別稱(chēng)取20.0 g/L的麥芽糖、蔗糖、果糖、半乳糖、阿拉伯糖、鼠李糖作為碳源，分析考察碳源種類(lèi)對(duì)菌株BT-IX17生長(zhǎng)及所產(chǎn)EPS產(chǎn)量的影響。由圖3-a可知，麥芽糖作為碳源時(shí)，EPS的產(chǎn)量最高為1.62 g/L，但麥芽糖這種原料經(jīng)濟(jì)成本較高。而以葡萄糖為碳源時(shí)，菌株生物量[22]是最高的。以蔗糖為碳源時(shí)，菌株的代謝利用率很低，生長(zhǎng)很慢。從菌株的生物量來(lái)看，菌株BT-IX17對(duì)果糖，半乳糖，阿拉伯糖，鼠李糖這幾種碳源的利用率明顯偏低，這可能是菌體內(nèi)沒(méi)有相應(yīng)的酶來(lái)轉(zhuǎn)化利用這些碳源，所以EPS產(chǎn)量和生物量都很低，綜合以上考慮，故而選擇葡萄糖為最佳碳源，此時(shí)EPS產(chǎn)量為1.26 g/L。

在確定葡萄糖為最佳碳源之后，對(duì)其濃度進(jìn)一步優(yōu)化。由圖3-b可知，隨著葡萄糖濃度的增加，EPS產(chǎn)量以及生物量都呈遞增趨勢(shì)。當(dāng)葡萄糖質(zhì)量濃度為25.0 g/L時(shí)，增加趨勢(shì)有所減緩且與20.0 g/L時(shí)的結(jié)果相差不大，有可能是葡萄糖濃度過(guò)高，菌體細(xì)胞滲透壓過(guò)大[23]，致使菌體的生長(zhǎng)減緩，故而選取質(zhì)量濃度為20.0 g/L的葡萄糖作為最佳碳源濃度。

a-碳源種類(lèi)；b-葡萄糖質(zhì)量濃度圖3 碳源及其質(zhì)量濃度對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響Fig.3 The effect of carbon source and its mass concentration on the yield and growth of strain EPS

2.2.2 不同氮源及氮源濃度對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響

以質(zhì)量濃度為20.0 g/L葡萄糖為碳源，依次稱(chēng)取質(zhì)量濃度為10.0 g/L的黃豆餅粉、玉米漿、酵母粉、大豆蛋白胨、魚(yú)粉蛋白胨作為氮源，分析考察氮源種類(lèi)對(duì)菌株BT-IX17生長(zhǎng)及所產(chǎn)EPS產(chǎn)量的影響。由圖4-a可知，以玉米漿作為氮源時(shí)，菌株EPS的產(chǎn)量最高而生物量卻不高，可能是玉米漿中的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)豐富，有利于EPS的產(chǎn)生，但是以黃豆餅粉作為氮源時(shí)，菌株生物量最高而EPS產(chǎn)量?jī)H次于以玉米漿為氮源，綜合考慮，故選取黃豆餅粉和玉米漿2種氮源作為最佳氮源。

在確定使用2種氮源作為培養(yǎng)基組分之后，對(duì)2種氮源的復(fù)配比例進(jìn)一步優(yōu)化。由圖4-b可知，選取黃豆餅粉與玉米漿復(fù)配比例3∶1(g∶g)，即黃豆餅粉9.0 g/L，玉米漿3.0 g/L作為最佳氮源質(zhì)量濃度。

a-氮源種類(lèi)；b-復(fù)合氮源比例圖4 氮源及其質(zhì)量復(fù)合配比對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響Fig.4 The effects of nitrogen source and its mass compound proportion on the yield and growth of strain EPS

2.2.3 不同無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響

將質(zhì)量濃度為20.0 g/L的葡萄糖作為碳源，9.0 g/L黃豆餅粉和3.0 g/L玉米漿作為復(fù)合氮源，基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中的NaCl作為對(duì)照，分別稱(chēng)取質(zhì)量濃度為0.50 g/L的KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、CaCO3、CaCl2、NaCl、Na2HPO4、NaH2PO4；0.05 g/L的FeCl3、MnCl2，分析考察無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)菌株BT-IX17生長(zhǎng)及所產(chǎn)EPS產(chǎn)量的影響。由圖5可知，NaH2PO4為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，EPS的產(chǎn)量最高；選取CaCl2為無(wú)機(jī)鹽時(shí)，菌體的生物量最高；選取MnCl2作為培養(yǎng)基中微量元素的補(bǔ)充，有利于菌體生長(zhǎng)代謝中相關(guān)酶的合成。綜合以上考慮，選取K2HPO4、NaH2PO4、MgSO4和MnCl2作為最佳無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)，由于液體發(fā)酵過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生一些酸類(lèi)物質(zhì)使發(fā)酵液偏酸，進(jìn)而影響菌體生長(zhǎng)，所以K2HPO4-NaH2PO4可作為緩沖對(duì)在培養(yǎng)基中維持發(fā)酵液pH的穩(wěn)定。

圖5 不同無(wú)機(jī)鹽種類(lèi)對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響Fig.5 The effects of different kinds of inorganic salts on the yield of exopolysaccharides and the growth of strain

2.2.4 不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響

在上述確定好的培養(yǎng)基成分基礎(chǔ)上，對(duì)發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，綜合考慮EPS產(chǎn)量和菌株生物量。由圖6可知，選取初始pH為7.5，溫度為34 ℃，裝液量80 mL，接種量為6%。

a-初始pH；b-發(fā)酵培養(yǎng)溫度；c-裝液量；d-接種量圖6 不同發(fā)酵培養(yǎng)條件對(duì)菌株EPS產(chǎn)量及生長(zhǎng)的影響Fig.6 The effects of different fermentation and culture conditions on the yield of exopolysaccharides and the growth of strain

2.3 利用Plackett-Burman實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化胞外多糖產(chǎn)量

綜合考慮以上各單因素結(jié)果，選取葡萄糖、黃豆餅粉、玉米漿、NaH2PO4、MgSO4、初始pH、發(fā)酵培養(yǎng)溫度、裝液量以及接種量為自變量，以EPS含量為響應(yīng)值。每種實(shí)驗(yàn)條件重復(fù)3次取平均值，從中選出顯著因素。借助Design-Expert 8.0.6試驗(yàn)設(shè)計(jì)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 1 The results of PB design experiment

如表2所示，經(jīng)PB設(shè)計(jì)分析，葡萄糖(A)、黃豆餅粉(B)和裝液量(G)是影響EPS產(chǎn)量的主要因素，其重要性排序?yàn)锳>B>G，而玉米漿、NaH2PO4、MgSO4、初始pH、接種量和溫度對(duì)EPS產(chǎn)量影響不顯著。對(duì)結(jié)果進(jìn)行擬合得到回歸方程：EPS含量=1.89+0.31A+0.21B-0.087G，R2=0.929 6，即該模型顯著。

表2 PB設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果回歸分析Table 2 Regression analysis of PB design experiment results

2.4 采用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)優(yōu)化胞外多糖產(chǎn)量

綜合考慮以上PB實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選取葡萄糖(A)、黃豆餅粉(B)和裝液量(C)為主要因素，采用3因素3水平Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法。結(jié)果見(jiàn)表3，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4，分析考察各單因素之間的交互作用對(duì)菌株EPS產(chǎn)量的影響。該模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.989 3，P<0.000 1，表明該模型極顯著。由失擬值可知該模型沒(méi)有失擬。經(jīng)過(guò)擬合，該方程式為：EPS含量=2.76+0.49A+0.11B-0.08C-0.01AB-0.03AC-0.06BC-0.46A2-0.54B2-0.39C2。

表3 Box-Behnken響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Table 3 Design and results of the Box-Behnken experiment

表4 EPS含量的方差分析表Table 4 ANOVA for the yield of exopolysaccharides

由響應(yīng)面分析，圖7表示當(dāng)其中1種因素為0水平時(shí)，另外2個(gè)因素的交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量的影響，可得BC>AC>AB。最終優(yōu)化所得結(jié)果為葡萄糖22.63 g/L，黃豆餅粉9.33 g/L，裝液量70.33 mL，當(dāng)下EPS產(chǎn)量達(dá)到最大為2.90 g/L。為實(shí)際操作方便，對(duì)上述優(yōu)化結(jié)果處理后優(yōu)化實(shí)驗(yàn)得最佳發(fā)酵工藝為：葡萄糖22.6 g/L，黃豆餅粉9.3 g/L，玉米漿2.0 g/L，K2HPO40.5 g/L，NaH2PO41.5 g/L，MgSO41.5 g/L，MnCl20.05 g/L，初始pH 7.5，裝液量70 mL，溫度34 ℃，接種量6%。以此條件重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)，得EPS產(chǎn)量為(2.94±0.11)g/L。同預(yù)測(cè)值相差不大，表明模型可靠，與優(yōu)化前工藝相比，EPS的產(chǎn)量提高133.33%。

a-葡萄糖和黃豆餅粉之間交互作用3D圖；b-黃豆餅粉和裝液量之間交互作用3D圖；c-黃豆餅粉和裝液量之間交互作用3D圖圖7 各因素的交互作用對(duì)EPS產(chǎn)量影響的響應(yīng)曲面Fig.7 The response surface of the interaction of various factors on the yield of exopolysaccharides

2.5 采用7 L發(fā)酵罐放大驗(yàn)證

將上述搖瓶?jī)?yōu)化的參數(shù)運(yùn)用到7 L發(fā)酵罐中(pH自然)，菌株的生長(zhǎng)狀況整體上分成3個(gè)階段(圖8)，在0～16 h時(shí)處于菌株的適應(yīng)期，此時(shí)菌體生長(zhǎng)緩慢，無(wú)EPS產(chǎn)生，葡萄糖消耗也較少，此時(shí)轉(zhuǎn)速為200 r/min，因?yàn)槌跗谵D(zhuǎn)速過(guò)快，攪拌槳會(huì)損傷菌體。在16～50 h時(shí)菌體處于急劇增長(zhǎng)模式，葡萄糖含量也消耗結(jié)束，并開(kāi)始了葡萄糖的勻速流加，此時(shí)EPS開(kāi)始大量合成。在50～72 h時(shí)，菌體生長(zhǎng)趨于穩(wěn)定，56 h時(shí)菌株的生物量達(dá)到最大且葡萄糖含量也將近消耗完畢。由于此時(shí)發(fā)酵液呈黏稠流體狀態(tài)，于是將攪拌轉(zhuǎn)速升高至300 r/min，以保證發(fā)酵罐內(nèi)的傳質(zhì)傳氧穩(wěn)定?？梢钥闯觯珽PS產(chǎn)量跟菌株生物量呈正相關(guān)，與搖瓶水平相比，EPS產(chǎn)量提高了123.1%。

a-OD值；b-胞外多糖含量圖8 7 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)結(jié)果Fig.8 The results of 7 L fermenter

2.6 EPS活性的初步探索

通過(guò)收集取樣，該EPS經(jīng)過(guò)初步純化，具有一定的納豆激酶活性，如圖9所示，多糖溶液濃度跟納豆激酶活性高低呈劑量效應(yīng)。龐遠(yuǎn)祥等[24]通過(guò)優(yōu)化納豆激酶產(chǎn)生的培養(yǎng)條件使活性提高至204.52 U/mL，與初始相比提高了1.22倍。該文EPS的納豆激酶活性相對(duì)較低，但明顯可以看出，隨著EPS濃度的提高，納豆激酶活性也在提高，這為進(jìn)一步探索EPS活性奠定基礎(chǔ)。

圖9 EPS的納豆激酶活性測(cè)定Fig.9 The nattokinase activity of EPS

3 結(jié)論

該文通過(guò)在納豆中篩選出1株產(chǎn)EPS較高的菌株BT-IX17，然后進(jìn)一步確定該目標(biāo)菌株為蘇云金芽孢桿菌。為提高菌株的EPS產(chǎn)量，對(duì)液態(tài)發(fā)酵下的培養(yǎng)基成分和發(fā)酵培養(yǎng)條件進(jìn)行單因素優(yōu)化，使用PB設(shè)計(jì)分析得到影響EPS產(chǎn)量的顯著因素，最后Box-Behnken優(yōu)化設(shè)計(jì)的3因素3水平分析得到最佳發(fā)酵工藝。該優(yōu)化方案與初期相比，EPS產(chǎn)量提高了133.33%。在7 L發(fā)酵罐放大水平，與搖瓶相比，EPS產(chǎn)量提高了123.1%。但是可以看出在發(fā)酵后期pH下降至4.00，葡萄糖消耗迅速，這2個(gè)主要問(wèn)題，這種培養(yǎng)情況對(duì)于菌體和EPS的積累都是有影響的，接下來(lái)可以對(duì)上罐過(guò)程中的pH進(jìn)行調(diào)控，優(yōu)化補(bǔ)料方式來(lái)進(jìn)一步提高EPS產(chǎn)量。目前經(jīng)測(cè)定，該新型EPS具有一定納豆激酶活性，有望成為未來(lái)治療血栓的合成藥物來(lái)源。由此該研究關(guān)于EPS產(chǎn)量的優(yōu)化為將來(lái)進(jìn)一步探索EPS活性應(yīng)用提供更多便利和可能性。

4 討論

當(dāng)前對(duì)于微生物EPS的研究因其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性而處于廣泛探索階段，如CAGRI-MEHMETOGLU等[25]研究BacillussubtilisATCC 6633菌株經(jīng)優(yōu)化培養(yǎng)基中乳糖和復(fù)合乳清粉等添加物后所產(chǎn)新型EPS含量為約0.77 g/L。ASGHER等[26]通過(guò)誘變和響應(yīng)面法對(duì)BacilluslicheniformisMS3菌株進(jìn)行產(chǎn)量?jī)?yōu)化，所產(chǎn)EPS提高到15.6 g/L，且發(fā)現(xiàn)該EPS具有良好的乳化活性。SUSAN等[27]研究BacilluslicheniformisSVD1的EPS經(jīng)白介素和腫瘤壞死因子測(cè)定而具有免疫調(diào)節(jié)功能。這些微生物來(lái)源的天然EPS的發(fā)現(xiàn)將為發(fā)現(xiàn)具有工業(yè)應(yīng)用潛力的新型生物大分子鋪平道路，也將激勵(lì)微生物多糖領(lǐng)域的生物技術(shù)開(kāi)發(fā)。