氨氧化亞硝化螺菌蔗糖合酶的性質(zhì)研究及應用

馮鑫，趙麗婷，顧正華，李由然，石貴陽，丁重陽*

1(糖化學與生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)3(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

尿苷二磷酸(uridine diphosphate，UDP)-葡萄糖在糖生物學研究中具有重要的地位，它是核苷酸依賴性糖基轉(zhuǎn)移酶(“Leloir” glycosyltransferases，GTs，EC 2.4)合成糖苷的重要糖供體。一直以來，人們認為這些GTs是具有“革命性”的糖基化催化劑，具有大規(guī)模高精度生產(chǎn)糖苷的潛力[1-2]。但是，核苷二磷酸糖供體(NDP-糖)的高成本是GTs工業(yè)應用的主要限制[3-4]，阻礙了寡糖、多糖的大規(guī)模合成[5]。此外，UDP-葡萄糖還可以為UDP-半乳糖、UDP-葡萄糖醛酸、UDP-木糖、UDP-阿拉伯糖等核苷酸糖的合成提供前體[6-8]。近2年研究還發(fā)現(xiàn)，UDP-葡萄糖還可以阻止肺癌轉(zhuǎn)移，對醫(yī)學研究具有重要意義[9]。

核苷二磷酸糖的合成有化學合成法、單酶法和多酶法[4, 10-11]。其中，由于蔗糖合酶(sucrose synthase，SuSy，EC 2.4.1.13)可以在幾乎不耗能的前提下，利用廉價的蔗糖一步反應生成昂貴的核苷二磷酸糖，這有希望成為最經(jīng)濟高效的核苷二磷酸糖合成途徑[11-12]。為了實現(xiàn)GTs應用價值的最大化，人們開展了對SuSy的相關研究。近年來，研究者們通過建立SuSy-GTs的級聯(lián)反應實現(xiàn)了糖苷的高效合成[13-14]，此外，采用酶固定化技術(shù)也可實現(xiàn)糖苷的高效合成[15-16]。還有學者通過大腸桿菌異源表達嗜酸桿菌中的SuSy基因，利用純化得到的SuSy，實現(xiàn)了UDP-葡萄糖的高效生產(chǎn)[17]。

SuSy的早期研究主要在植物體內(nèi)展開，其功能鑒定引起了大部分研究者的關注[18]，還有一些研究者對其進行了異源表達及性狀表征[19-20]。目前細菌來源的SuSy因其具有較高的熱穩(wěn)定特性逐漸被研究者所關注，越來越多的證據(jù)表明細菌來源的SuSy將會有更廣闊的應用前景[21]。本文通過對來自氨氧化亞硝化螺菌的蔗糖合酶(Nitrosospiramultiformis,NmSuSy)的研究，實現(xiàn)了UDP-葡萄糖的大量合成，為后續(xù)進一步實現(xiàn)UDP-葡萄糖的高效合成奠定了基礎，為將來利用SuSy實現(xiàn)UDP-葡萄糖的工業(yè)化生產(chǎn)提供了理論支持。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 菌種、質(zhì)粒和培養(yǎng)基

大腸桿菌BL21(DE3)、大腸桿菌質(zhì)粒pET-28a(+)由中國高校工業(yè)微生物資源和信息中心保藏；氨氧化亞硝化螺菌蔗糖合酶基因的表達質(zhì)粒pET-28a-NmSuSy由蘇州金維智科技有限公司合成。

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5.0，胰蛋白胨10.0，氯化鈉10.0，固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉20.0 g/L?？剐院Y選時添加終質(zhì)量濃度為100 mg/L的氨芐青霉素。

1.1.2 試劑與儀器

氨芐青霉素，Thermo Fisher Scientific公司；尿苷-5′-二磷酸二鈉鹽(uridine 5′-diphosphate disodium salt，5′-UDP-Na2)，上海源葉生物科技有限公司；其他主要試劑均購于北京索萊寶科技有限公司。

酶標儀，TECAN公司；AKTA AVANT蛋白純化儀，美國通用電氣有限公司；pH計，梅特勒-托利多儀器公司；Sonic VCX-750型超聲波細胞破碎儀，南京新辰生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與表達

NCBI數(shù)據(jù)庫中查詢得到氨氧化亞硝化螺菌蔗糖合酶基因序列(GeneID:41370990)，基于大腸桿菌偏好性完成密碼子優(yōu)化，由蘇州金維智科技有限公司合成得到表達質(zhì)粒pET-28a-NmSuSy。將質(zhì)粒pET-28a-NmSuSy轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DE3中，通過菌落PCR驗證、測序驗證得到重組菌BL21/pET-28a-NmSuSy。

1.2.2 蔗糖合酶的誘導表達和分離純化

將重組菌BL21 (DE3)/pET-28a-NmSuSy接種于含氨芐青霉素的LB平板，37 ℃培養(yǎng)12 h后接種至LB液體中過夜培養(yǎng)。然后按2%接種量進一步擴大培養(yǎng)(37 ℃)至OD600約為0.6后，加入終濃度為0.1 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷誘導蛋白表達(16 ℃，24 h)。最后將發(fā)酵液冷凍離心(4 ℃，12 000 r/min，10 min)棄上清液，收集沉淀，用20 mmol/L PB緩沖液(pH 7.4)重懸菌體。采用超聲波破碎法破碎細胞，冷凍離心后所得上清液即為粗蛋白液。

用1 mL鎳離子柱對粗蛋白液進行純化。用體積分數(shù)為85%的A液(20 mmol/L PB、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 7.4)和體積分數(shù)15%的B液(20 mmol/L PB、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 7.4)洗脫雜蛋白，最后以體積分數(shù)63%的A液和體積分數(shù)37%的B液洗脫目的蛋白，收集蛋白峰洗脫液，最后將粗蛋白液和純酶液進行SDS-PAGE分析。另將得到的上述NmSuSy洗脫液用超濾管交換濃縮到25 mmol/L 4-羥乙基哌嗪乙磺酸{2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid,HEPES}緩沖液(pH 7.4)中保存，便于后期酶學性質(zhì)的研究。

1.2.3 蔗糖合酶酶活力測定

采用BCA(bicinchoninic acid)法[22]測果糖生成量來計算酶活力，酶活力測定體系[23]：在含有100 mmol/L蔗糖、10 mmol/L UDP總體積為100 μL的50 mmol/L PB溶液(pH 6.5)中50 ℃孵育5 min。酶活力定義：1 min內(nèi)生成1 μmol果糖所需的酶量為1個酶活力單位(U)。

1.2.4 蔗糖合酶酶學性質(zhì)研究

(1)最適反應pH和pH穩(wěn)定性：將純酶分別在pH 5.0～10.0的緩沖液中測定酶活力，以酶活力的最高值為100%。繼續(xù)將純酶在pH 5.0～7.5的緩沖液中4 ℃保存，每隔一段時間測定剩余酶活力，探究酶的pH穩(wěn)定性。

(2)最適反應溫度和熱穩(wěn)定性：將純酶分別在30～80 ℃的條件下測定酶活力，以酶活力的最高值為100%。繼續(xù)將純酶在不同溫度下保存，每隔一段時間測定剩余酶活力，探究酶的熱穩(wěn)定性。

(3)金屬離子和抑制劑對酶活力的影響：向反應體系中添加不同的金屬離子和抑制劑，終濃度為0.1、0.5 、1.0 mmol/L，測定酶活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。

(4)有機試劑對酶活力的影響：向反應體系中加入不同有機試劑，終體積分數(shù)為1%、5%和10%，測定酶活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。

(5)表面活性劑對酶活力的影響：向反應體系中加入不同表面活性劑至終體積分數(shù)為0.1%、0.5%、1%，測定酶活力，以未經(jīng)處理的酶活力為100%。

(6)動力學常數(shù)測定：選擇不同濃度的UDP為底物(0.5～8 mmol/L)，在測酶活力的條件下測定重組酶活力。使用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)法[24]對NmSuSy的Km值以及kcat/Km值進行計算。

1.2.5 重組酶催化UDP-葡萄糖的高效合成

(1)底物抑制對蔗糖合酶初始反應速率的影響：用50 mmol/L PB緩沖液配制500 mmol/L蔗糖及不同濃度UDP的反應體系、400 mmol/L UDP及不同濃度蔗糖的反應體系，在pH 6.5、40 ℃條件下反應4 min，通過BCA法檢測果糖的生成。

(2)pH和溫度對蔗糖合酶反應的平衡常數(shù)的影響：用50 mmol/L PB緩沖液配制含有1 mol/L蔗糖、100 mmol/L UDP，pH分別調(diào)整為6.0、6.5、7.0、7.5。在酶終質(zhì)量濃度為100 mg/L、30 ℃下反應，還有2個pH 6.0的反應體系分別在35、40 ℃下反應。反應過程中通過手動添加4 mol/L鹽酸維持pH穩(wěn)定，通過BCA法檢測果糖的生成。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌的獲得與驗證

如圖1所示，PCR產(chǎn)物在2 394 bp左右有明顯條帶，這與NmSuSy基因大小相一致，測序結(jié)果與GenBank報告的基因完全一致，表明獲得了正確的NmSuSy基因序列。

M-DNA Marker；1～4-重組菌BL21/pET-28a-NmSuSy菌落PCR產(chǎn)物圖1 重組菌菌落PCR鑒定電泳結(jié)果Fig.1 Electrophoresis results of recombinant bacterial colony PCR identification

2.2 重組蔗糖合酶的誘導表達、酶活力檢測及純化

細胞破碎液上清液和純化后的酶液SDS-PAGE鑒定結(jié)果如圖2所示，重組蛋白在89 kDa左右出現(xiàn)明顯條帶，空載的破碎液上清液中，無法檢測到相應大小的蛋白條帶。粗酶液經(jīng)鎳離子柱親和層析純化后在SDS-PAGE中顯示出單一的清晰條帶。經(jīng)超濾管超濾濃縮后可得到質(zhì)量濃度為21.39 mg/mL的純酶液。純酶液按1.2.3的酶活力測定方法，測得比酶活力為14.4 U/mg。

M-標準蛋白 Marker；1-重組菌BL21/pET-28a-NmSuSy粗酶液；2-空載破碎后上清液；3-重組菌BL21/pET-28a-NmSuSy純酶液圖2 重組酶的SDS-PAGE圖Fig.2 SDS-PAGE results of recombination enzymes

2.3 酶學性質(zhì)分析

在探究酶學性質(zhì)時，均使用純化后的酶液，在每100 μL反應體系中加入1 μL純酶液(2.14 μg)進行測定。

2.3.1 最適反應pH和pH穩(wěn)定性

由于pH>7.5時蔗糖合酶催化的可逆反應向著UDP合成的方向進行[25]，因此本文重點研究了pH<7.5時，NmSuSy的催化活力變化情況。如圖3所示，重組酶最適反應pH為6.5，當pH<6.5時相對酶活力隨著pH的下降快速下降，當pH為5.5時相對酶活力僅有23%。pH穩(wěn)定性研究結(jié)果顯示，當pH為6.0～7.5時NmSuSy穩(wěn)定性較好，半衰期均在40 h以上。

a-NmSuSy的最適pH；b-NmSuSy的pH穩(wěn)定性圖3 pH對酶活力及其穩(wěn)定性的影響Fig.3 Effects of pH on activities and stabilities of recombination enzymes

2.3.2 最適反應溫度和溫度穩(wěn)定性

NmSuSy熱穩(wěn)定性及最適反應溫度如圖4所示。NmSuSy的最適反應溫度為55 ℃，且該酶不適合在60 ℃以上反應，60 ℃以上酶會迅速失活。溫度<35 ℃時，酶穩(wěn)定性很好，半衰期在35 h以上。據(jù)報道，絕大部分植物來源蔗糖合酶在高于30 ℃的溫度下，酶會快速失活[21]。相比之下，NmSuSy具有相對較好的熱穩(wěn)定性。

a-NmSuSy的最適溫度;b-NmSuSy的溫度穩(wěn)定性圖4 溫度對酶活力及其穩(wěn)定性的影響Fig.4 Effects of temperature on activities and stabilities of the enzyme

2.3.3 金屬離子和有機溶劑對酶活力的影響

金屬離子對不同蔗糖合酶的作用效果各不相同。如圖5所示，Mg2+、Mn2+、Fe2+均可提高NmSuSy酶活力而Cu2+對酶活力抑制作用明顯。此外，Ni2+、Co2+、Fe3+、Al3+、Na+、K+這些金屬離子在低濃度時會提高酶活力，高濃度時則會抑制酶活力。

如圖5所示，當測定酶活力體系中加入10%的甘油、丙酮、乙醇、甲醇時，酶活力降低了40%～50%，當加入體積分數(shù)10%的乙腈、異丙醇、正丙醇時，相對酶活力僅有10%左右。這說明NmSuSy對高濃度有機試劑耐受性不強。

a-金屬離子對酶活性的影響；b-有機溶劑對酶活性的影響圖5 金屬離子和有機試劑對酶活性的影響Fig.5 Effects of metal ions and organic reagents on activities of the enzyme

2.3.4 抑制劑和表面活性劑對酶活力的影響

在測定酶活力過程中EDTA、苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)、二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)均對NmSuSy有輕微抑制作用，如圖6所示，隨著濃度的升高，NmSuSy相對酶活力也逐漸降低，但抑制作用不是很顯著。

表面活性劑對酶活力的影響如圖6所示，當吐溫-20及吐溫-80的添加量(體積分數(shù))為0.1%、0.5%時，可促進NmSuSy的酶活力，當添加1%的吐溫-20和吐溫-80時NmSuSy活力卻受到輕微的抑制。但SDS和曲拉通對NmSuSy活力有顯著的抑制作用，當添加1%的SDS時，NmSuSy相對酶活力僅有13.74%。

a-抑制劑對酶活性的影響；b-表面活性劑對酶活性的影響圖6 抑制劑和表面活性劑對酶活性的影響Fig.6 Effects of inhibitors and surfactants on activities of the enzyme

2.3.5 重組蔗糖合酶的底物動力學研究

采用Linewaeaver-Burk雙倒數(shù)進行作圖，通過計算得到NmSuSy的米氏常數(shù)Km為6.6 mmol/L，反應最大速率Vmax為1 360 μmol/(L·min)，催化常數(shù)kcat為23.81 s-1，催化效率指數(shù)kcat/Km為3.61 L/(mmol·s)。部分其他蔗糖合酶動力學參數(shù)見表1，對比發(fā)現(xiàn)，NmSuSy等細菌來源的蔗糖合酶普遍比植物來源的蔗糖合酶對UDP的親和性低。雖然植物來源蔗糖合酶具有比NmSuSy更低的Km值，但低Km值往往會引起強烈的底物抑制作用，而為了高效合成UDP-葡萄糖，基于弱的底物抑制作用來選擇蔗糖合酶則更為關鍵。而細菌來源的蔗糖合酶具有較高Km值，表現(xiàn)出更高的底物抑制濃度[17]。

表1 不同來源蔗糖合酶動力學參數(shù)Table 1 Kinetic parameters of SuSy from different sources

2.4 UDP-葡萄糖的高效合成

2.4.1 UDP-葡萄糖高效合成的動力學限制研究

研究發(fā)現(xiàn)，NmSuSy催化UDP-葡萄糖合成的最大初始速率為32 μmol/(min·mg)(圖7)，比文獻中報道的植物來源蔗糖合酶[17]催化UDP-葡萄糖合成的最大初始速率[14 μmol/(min·mg)]提高了近2.28倍。NmSuSy在較高的UDP濃度下，仍保持較為理想的催化能力。此外，研究還發(fā)現(xiàn)蔗糖對可逆反應沒有底物抑制現(xiàn)象。因此，選擇細菌來源的蔗糖合酶來催化可逆反應，可在較高UDP濃度下合成UDP-葡萄糖，從而促進UDP的充分利用。

a-UDP濃度對初始反應速率的影響;b-蔗糖濃度對初始反應速率的影響圖7 UDP和蔗糖濃度對合成UDP-葡萄糖初始反應速率的影響Fig.7 The influence of the UDP concentration and sucrose concentration on the initial rates of UDP-glucose formation

2.4.2 UDP-葡萄糖高效合成的熱力學限制

有研究表明pH會影響酶促轉(zhuǎn)化的平衡常數(shù)[29]。GUTMANN等[17]研究進一步證實pH會影響UDP的質(zhì)子化程度進而影響反應平衡常數(shù)。因此在整個反應過程中控制反應體系pH保持恒定極其重要。當pH為5.5時，相對酶活力僅有23%，且NmSuSy在該條件下穩(wěn)定性差；pH>7.5時，可逆反應向著UDP合成的方向進行。因此本研究在pH 6.0～7.5展開pH對平衡常數(shù)影響的研究。如圖8-a所示，pH從7.5降低到6.0，反應達到平衡時的UDP轉(zhuǎn)化率從30.5%提高到了41.5%。此外，本文還探究了溫度對可逆反應的速率和平衡常數(shù)的影響，如圖8-b所示，溫度對可逆反應平衡常數(shù)沒有影響，溫度只能影響可逆反應到達平衡狀態(tài)的時間。溫度為40 ℃時，反應速度最快，在此溫度下，僅需1 h即可獲得35.8 mmol/L(20.2 g/L)的UDP-葡萄糖。由于溫度高于40 ℃時酶穩(wěn)定性差，因此并沒有進行研究。

a-pH對可逆反應平衡常數(shù)的影響；b-溫度對可逆反應平衡常數(shù)的影響圖8 pH和溫度對可逆反應平衡常數(shù)的影響Fig.8 The effect of pH and temperature on the equilibrium constant of the reversible reaction

3 結(jié)論與討論

本文研究了氨氧化亞硝化螺菌來源的蔗糖合酶在大腸桿菌中的異源表達、純化及酶學性質(zhì)分析。此外，還利用純化得到NmSuSy實現(xiàn)了UDP-葡萄糖的大量合成，為糖生物學的研究提供了更為經(jīng)濟的供體底物原料。在確定的最佳反應條件下(pH 6.0、40 ℃)，100 mg/L的NmSuSy催化反應1 h可生成35.8 mmol/L(20.2 g/L)的UDP-葡萄糖，反應6 h可達到平衡狀態(tài)，生成41.5 mmol/L(23.5 g/L)的UDP-葡萄糖。此研究成果為后續(xù)進一步實現(xiàn)UDP-葡萄糖的高效合成奠定了基礎，如通過流加底物來提高反應速率，提高UDP利用率；也可通過酶的固定化，提高酶的耐酸性、耐高溫性從而獲得更高的反應平衡常數(shù)和更快的反應速度。本研究也為蔗糖合酶走向工業(yè)化應用，提供了重要的理論支持。