組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶在大腸桿菌中的重組表達(dá)及酶學(xué)性質(zhì)研究

李金榮，辛瑜，石貴陽，顧正華，張梁

(糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國(guó)家工程實(shí)驗(yàn)室(江南大學(xué))，江蘇 無錫，214122)

組蛋白賴氨酸去甲基化酶(histone lysine demethylase，KDMs)主要分為兩類，其中組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1(histone lysine specific demethylase 1，Lsd1)是2004年第一個(gè)被鑒定出來的組蛋白脫甲基酶，是黃素腺嘌呤二核苷酸依賴性胺氧化酶超家族成員之一[1]。Lsd1的脫甲基反應(yīng)可被看作底物與黃素輔因子之間的氫化物轉(zhuǎn)移[2]，反應(yīng)過程中同時(shí)涉及到與分子氧的反應(yīng)[3-4]。另一類脫甲基酶則是含有Jumonji-C結(jié)構(gòu)域的組蛋白賴氨酸脫甲基酶(jumonji C,Jmjc)，于2006年首次被鑒定出來[5]，在Fe2+和O2的參與下直接氧化甲基，以脫甲醛的形式完成去甲基化[6-7]。

KDMs可以催化組蛋白H3K4[1, 8]、H3K9[9-10]的去甲基化反應(yīng)。此外，KDMs具備豐富的底物特異性[11]，可以作用于多種非組蛋白底物，例如腫瘤抑制因子p53[12]、DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1[13]。KDMs在多種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，已經(jīng)成為腫瘤治療藥物開發(fā)的重要靶蛋白，目前對(duì)于該酶的研究主要聚焦于多胺類抑制劑[14-15]以及可逆選擇性抑制劑[16]等。在該酶的研究過程中，也有利用大腸桿菌(Escherichiacoli)進(jìn)行原核表達(dá)的，LAURENT等[17]在E.coliRosetta(DE3)-pET15b表達(dá)了人源的目的蛋白并進(jìn)行了生化分析。

近年來，隨著食品行業(yè)的快速發(fā)展，相關(guān)的食品加工廢水的產(chǎn)生也在快速增長(zhǎng)，主要含有氮、磷等化合物。關(guān)于食品工業(yè)廢水的處理已經(jīng)成為相關(guān)領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題，目前大多采用生物法、物理法和化學(xué)法等[18-20]，其中N—CH3類化合物很難實(shí)現(xiàn)降解，能夠?qū)θ梭w的神經(jīng)系統(tǒng)以及肝腎造成嚴(yán)重?fù)p傷，同時(shí)對(duì)水生生物具有毒害作用。DASH等[21]從土壤中篩選出假單胞菌NCIM5235，能夠有效降解咖啡因，但是微生物降解底物單一，不能廣泛應(yīng)用。

本研究選擇斑馬魚和咖啡來源的賴氨酸脫甲基酶進(jìn)行研究，斑馬魚作為模式生物具有清晰的生物學(xué)背景，同時(shí)通過前期研究，植物中咖啡來源的脫甲基酶表現(xiàn)出與斑馬魚來源相似的底物特異性。本研究首先構(gòu)建菌株E.coliBL21(DE3)/pET28a-lsD1和E.coliBL21(DE3)/pET28a-jmjC，然后表達(dá)純化獲得KDMs。通過發(fā)酵條件優(yōu)化獲得體外可溶性KDMs，且首次對(duì)其進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)測(cè)定，為KDMs體外抑制劑的研發(fā)提供一定基礎(chǔ)，同時(shí)利用非組蛋白底物進(jìn)行動(dòng)力學(xué)研究，為后期催化含N—CH3類化合物降解的研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒與菌株

大腸桿菌JM109、大腸桿菌BL21(DE3)、質(zhì)粒載體pET28a均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 試劑、培養(yǎng)基與儀器

LB培養(yǎng)基(g/L):酵母提取物5，胰蛋白胨10，NaCl 10，121 ℃滅菌20 min。

試劑：TaqDNA聚合酶、質(zhì)粒小量提取試劑盒、DNA片段純化試劑盒、膠回收試劑盒，南京諾唯贊生物科技公司；PrimerSTARMax DNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶Hind Ⅲ、EcoR Ⅰ、SacⅠ，Takara公司；甲醛脫氫酶，SIGMA公司；α-KG、N-甲基-L-亮氨酸，上海麥克林生化科技公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

儀器：SCG蛋白純化系統(tǒng)，蘇州賽譜儀器有限公司；V-1200分光光度計(jì)，上海美普達(dá)儀器公司；S100D型PCR儀，美國(guó)BIO-RAD公司；Spark全自動(dòng)酶標(biāo)儀，TECAN公司；CF16RX-Ⅱ冷凍離心機(jī)，日本HITACHI公司；HYL-C組合式搖床，江蘇太倉市強(qiáng)樂實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 重組菌的構(gòu)建

由NCBI數(shù)據(jù)庫中查找得到斑馬魚來源的組蛋白賴氨酸脫甲基酶(Lsd1)的基因序列(GenBanK：NP_001229924.1)以及咖啡來源的組蛋白賴氨酸脫甲基酶(Jmjc)的基因序列(GenBanK：XP_027103441.1)，并對(duì)兩種來源的序列進(jìn)行大腸桿菌偏好性的密碼子優(yōu)化，由蘇州金唯智生物科技公司合成。以合成的目的酶基因序列為模板設(shè)計(jì)引物,lsD1:P1(5′-CCGGAATTCATGCTGAGCAATAAGAAAAGCG-3′)、P2(5′-CCCAAGCTTTTATT-GGATACTTGGGCTCG-3′)，jmjC:P3(5′-CGAGCTCATGAGCATGATGAAACG-3′)、P4(5′-CCCAAGCT-TTTAACGACCGTCCTCAAC-3′)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增。利用EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和SacⅠ、Hind Ⅲ分別對(duì)基因片段lsD1和jmjC進(jìn)行雙酶切，連接到質(zhì)粒pET28a上，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET28a-lsD1和pET28a-jmjC。,將兩個(gè)重組質(zhì)粒以及空載質(zhì)粒通過熱轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入到大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞BL21(DE3)內(nèi)，37 ℃、200 r/min后培養(yǎng)1 h，離心收集菌體，涂布至30 μg/mL卡那霉素的LB平板，在37 ℃培養(yǎng)箱中倒置培養(yǎng)12 h。從LB平板中隨機(jī)挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的轉(zhuǎn)化子送到生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序，最終獲得E.coliBL21(DE3)/pET28a-lsD1和E.coliBL21(DE3)/pET28a-jmjC重組菌株。

1.2.2 Lsd1和Jmjc的誘導(dǎo)表達(dá)

將2株重組菌BL21(DE3)/pET28a-lsD1和BL21(DE3)/pET28a-jmjC以及空質(zhì)粒對(duì)照菌平板活化?；罨杲尤胙b有15 mL LB培養(yǎng)基的50 mL錐形瓶中，在37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)12 h，以此作為種子液，以1%的接種量轉(zhuǎn)至裝有50 mL LB培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶中，于37 ℃，200 r/min的條件下培養(yǎng)至OD600為0.6～0.8，分別加入終濃度為0.1、0.25 mmol/L的異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactopyranoside, IPTG)，將添加2種不同濃度IPTG的培養(yǎng)基分別在37 ℃、200 r/min、7 h，25 ℃、200 r/min、12 h，16 ℃、200 r/min、24 h的條件下培養(yǎng)。4 ℃、12 000 r/min離心5 min收集菌體。用Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液(20 mmol/L、pH 8.0)洗滌并重懸菌體，用超聲儀破碎細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min離心10 min，收集上清液即為粗酶液。

1.2.3 目的蛋白純化以及分析

利用鎳柱親和層析對(duì)目的蛋白Lsd1和Jmjc進(jìn)行純化。先用A液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、20 mmol/L咪唑，pH 8.0)平衡蛋白系統(tǒng)，進(jìn)樣。目的蛋白Lsd1在體積分?jǐn)?shù)80% A液和體積分?jǐn)?shù)20% B液(20 mmol/L Na2HPO4、20 mmol/L NaH2PO4、500 mmol/L NaCl、500 mmol/L咪唑，pH 8.0)條件下被洗脫收集，目的蛋白Jmjc在體積分?jǐn)?shù)60% A液和體積分?jǐn)?shù)40% B液條件下被洗脫收集，之后用20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)透析去除高濃度的鹽，采用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定蛋白濃度，用SDS-PAGE分析檢測(cè)蛋白。

1.2.4 酶活力測(cè)定

2種KDMs組蛋白去甲基化酶反應(yīng)的一個(gè)主要副產(chǎn)物都是甲醛，甲醛脫氫酶在輔酶煙酰胺腺嘌呤二苷酸(nacotinamide adenine dinucleotide,NAD+)存在的條件下，將NAD+還原為NADH，同時(shí)將甲醛氧化為甲酸。NADH通過酶標(biāo)儀檢測(cè)并定量，激發(fā)波長(zhǎng)為330 nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460 nm[22-23]，從而間接測(cè)定活性。反應(yīng)總體積為400 μL，20 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH 7.0)為整個(gè)反應(yīng)的緩沖液，反應(yīng)體系如下，Lsd1：10 mg/mL NAD+、0.01 U/μL甲醛脫氫酶、10 mmol/L底物、0.1 mg/mL純酶(保存于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH 7.0)；Jmjc：10 mg/mL NAD+、0.01 U/μL甲醛脫氫酶、10 mmol/L底物、0.1 mg/mL純酶(保存于20 mmol/L Tris-HCl緩沖液中，pH 7.0)、l mmol/L Fe2+、1 mmol/L α-KG。

酶活力定義：在25 ℃，pH 7.0條件下，1 min內(nèi)催化底物產(chǎn)生1 μmol 甲醛(HCHO)所需要的酶量，定義為1個(gè)酶活力單位(IU)。

1.2.5 酶學(xué)性質(zhì)的研究

后續(xù)測(cè)定所用的酶液為鎳柱親和層析所收集的純酶液，測(cè)定中的底物均為N-甲基-L-亮氨酸。每個(gè)測(cè)定條件設(shè)置3個(gè)平行試驗(yàn)。

(1)目的蛋白Lsd1和Jmjc的最適反應(yīng)溫度和溫度穩(wěn)定性的測(cè)定：在pH 7.0，溫度10～55 ℃條件下反應(yīng)6 h，測(cè)定酶活力，以酶活力最高值為100%，確定最適反應(yīng)溫度。將2個(gè)重組酶在10～70 ℃條件下保存30 min，然后在最適反應(yīng)溫度、pH 7.0條件下反應(yīng)6 h，測(cè)定酶活力，探究相關(guān)的溫度穩(wěn)定性。

(2)目的蛋白Lsd1和Jmjc的最適反應(yīng)pH和pH穩(wěn)定性的測(cè)定：25 ℃條件下，分別在pH 4.0～10.0的緩沖液中反應(yīng)6 h，測(cè)定酶活力，以酶活力最高值為100%，確定最適反應(yīng)pH。25 ℃條件下，將2個(gè)目的蛋白在不同pH緩沖液中保存12 h，之后在最適pH，25 ℃條件下測(cè)定酶活力，確定pH穩(wěn)定性。

(3)金屬離子對(duì)目的蛋白Lsd1和Jmjc的影響：在反應(yīng)體系中添加Mn2+、Co2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+至終濃度分別為0.1、1.0、5.0 mmol/L，在最適反應(yīng)條件下測(cè)定酶活力，以沒有添加金屬離子的酶活力為100%。

(4)動(dòng)力學(xué)研究：選擇不同濃度N-甲基-L-亮氨酸，在最適溫度、最適pH條件下與純酶液反應(yīng)6 h。根據(jù)米氏方程，使用雙倒數(shù)法計(jì)算Lsd1和Jmjc的Km值以及kcat/Km值。

2 結(jié)果與分析

2.1 組蛋白賴氨酸脫甲基酶基因在E.coli中的重組表達(dá)

2.1.1 組蛋白賴氨酸脫甲基酶基因的克隆

lsD1和jmjC基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物如圖1-a和圖1-b所示，在2 500、1 800 bp分別有1條單一的擴(kuò)增片段，與目的片段lsD1(2 514 bp)和jmjC(1 728 bp)的大小一致。

2.1.2 重組菌構(gòu)建

將PCR擴(kuò)增的2個(gè)目的片段分別用限制性內(nèi)切酶EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ和SacⅠ、Hind Ⅲ雙酶切，與相同酶切后的載體pET28a相連接，通過42 ℃熱擊轉(zhuǎn)化感受態(tài)E.coliBL21(DE3)細(xì)胞。菌落PCR驗(yàn)證正確，并提取正確轉(zhuǎn)化子的質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切驗(yàn)證。結(jié)果如圖1-c和圖1-d所示，質(zhì)粒pET28a-lsD1經(jīng)EcoR Ⅰ、Hind Ⅲ 酶切后出現(xiàn)2個(gè)片段，與理論片段大小位置5 000、2 500 bp相符，經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證正確，表明重組菌株BL21(DE3)/pET28a-lsD1構(gòu)建成功。重組菌株BL21(DE3)/pET28a-jmjC通過同樣方法驗(yàn)證正確。

M-DNA markera- lsD1基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；b- jmjC基因PCR擴(kuò)增產(chǎn)物；c-重組質(zhì)粒PET28a-lsD1雙酶切驗(yàn)證；d-重組質(zhì)粒PET28a- jmjC雙酶切驗(yàn)證圖1 lsD1和jmjC基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物及雙酶切驗(yàn)證Fig.1 PCR amplification product of lsD1 and jmjC gene, double restriction digestion verification of recombinant vector PET28a-lsD1 and PET28a-jmjC

2.2 組蛋白賴氨酸脫甲基酶誘導(dǎo)表達(dá)、純化

發(fā)酵溫度過高或者誘導(dǎo)劑濃度過高在蛋白表達(dá)過程中會(huì)導(dǎo)致目的蛋白的快速、錯(cuò)誤折疊，形成包涵體，無法或少量獲得可溶性目的蛋白。因此，本文對(duì)發(fā)酵溫度以及誘導(dǎo)劑濃度進(jìn)行了優(yōu)化。根據(jù)SDS-PAGE分析，在37 ℃條件下，目的蛋白主要以包涵體的形式存在，可溶性蛋白量過低，包涵體復(fù)性對(duì)于酶活力損失嚴(yán)重；16 ℃條件下，目的蛋白表達(dá)量過低；25 ℃條件下，獲得了大量的可溶性目的蛋白。為進(jìn)一步減少包涵體的形成，進(jìn)行了誘導(dǎo)劑濃度優(yōu)化，0.10 mmol/L IPTG條件下形成的包涵體明顯少于0.25 mmol/L IPTG條件下。因此，本文選擇發(fā)酵溫度25 ℃，0.1 mmol/L IPTG，獲得了大量的可溶性目的蛋白。

為了得到高純度的目的蛋白，選用鎳柱親和層析。通過比較在目的蛋白N端、C端、N端和C端添加6×His標(biāo)簽3種情況的蛋白親和力，最終選擇在目的蛋白C端添加標(biāo)簽。Lsd1(110 kDa)在100 mmol/L咪唑的條件下被洗脫，Jmjc(65 kDa)在200 mmol/L咪唑的條件下被洗脫，結(jié)果如圖2所示。

M-蛋白markera-Lsd1純化產(chǎn)物；b-Jmjc純化產(chǎn)物圖2 重組菌BL21(DE3)/PET28a-lsD1和BL21(DE3)/PET28a-jmjC純化產(chǎn)物的SDS-PAGE分析Fig.2 SDS-PAGE analysis of the purified product of recombinant E.coli BL21(DE3)/pET28a-lsD1 and BL21(DE3)/PET28a-jmjC

2.3 重組組蛋白賴氨酸脫甲基酶酶學(xué)性質(zhì)研究

2.3.1 最適反應(yīng)溫度

將酶液分別放置在10、15、20、25、30、35、40、45、55 ℃下進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%。結(jié)果如圖3-a所示，Jmjc最適反應(yīng)溫度為20 ℃，Lsd1最適反應(yīng)溫度為35 ℃。Jmjc在溫度較低時(shí)酶活力依然較高，在達(dá)到35 ℃時(shí)酶活力快速下降。Lsd1在溫度較低時(shí)酶活力較低，隨著溫度升高酶活力逐漸提高，但是在達(dá)到45 ℃時(shí)酶活力快速下降。

2.3.2 溫度穩(wěn)定性

將酶液分別在10、20、30、40、50、60、70 ℃條件下保存30 min，然后分別在2個(gè)酶的最適反應(yīng)溫度下測(cè)定剩余酶活力，以最高酶活力為100%。結(jié)果如圖3-b所示，2個(gè)酶在10～40 ℃下比較穩(wěn)定，幾乎沒有酶活力損失，酶活力剩余90%以上，高于40 ℃時(shí)熱穩(wěn)定性較差，酶活力快速下降，與Jmjc相比，Lsd1具有更好的熱穩(wěn)定性。

2.3.3 最適pH值

2種酶分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，最適溫度條件下反應(yīng)，以最高酶活力為100%。結(jié)果如圖3-c所示，Lsd1最適pH值為7.0，在酸性和堿性條件下，酶活力都大量損失，剩余酶活力20%左右。Jmjc最適pH值為8.0，在酸性條件下酶活力很低，pH 4.0～6.0時(shí)酶活力剩余30%以下，對(duì)于堿性有一定的偏好性，pH 10.0以上酶活力損失較大，與Lsd1相比，Jmjc的酸堿耐受力更強(qiáng)。

2.3.4 pH穩(wěn)定性

將酶液分別在pH 4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，25 ℃條件下保存12 h，并在各自最適溫度、最適pH條件下反應(yīng)測(cè)定酶活力，以最高酶活力為100%。結(jié)果如圖3-d所示，Lsd1和Jmjc在pH 7.0、8.0、9.0剩余酶活力較高，在酸堿環(huán)境下耐受性比較差，所以2種酶適合在中性以及弱堿性環(huán)境下保存。

2.3.5 金屬離子對(duì)酶活力的影響

金屬離子對(duì)Lsd1和Jmjc的作用效果各不相同，結(jié)果如圖3-e和圖3-f所示，Mn2+對(duì)Lsd1有明顯的促進(jìn)作用，隨著濃度的升高Co2+也表現(xiàn)出一定的促進(jìn)作用，而Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+表現(xiàn)出了明顯的抑制作用；同樣Mn2+對(duì)Jmjc起著明顯的促進(jìn)作用，隨著濃度升高Co2+、Ca2+、Zn2+也較小幅度的提高了酶活力，但是隨著濃度的持續(xù)升高Co2+、Ca2+又表現(xiàn)出了抑制作用，而Mg2+、Ni2+則表現(xiàn)出明顯的抑制作用。

a-最適反應(yīng)溫度；b-溫度穩(wěn)定性；c-最適pH；d-pH穩(wěn)定性；e-金屬離子對(duì)Lsd1的影響；f-金屬離子對(duì)Jmjc的影響圖3 溫度、pH、金屬離子對(duì)酶活力的影響Fig.3 The influence of temperature, pH and metal ions on enzyme activity

2.3.6 動(dòng)力學(xué)研究

以N-甲基-L-亮氨酸為底物測(cè)定反應(yīng)動(dòng)力學(xué)特性，結(jié)果如圖4所示，測(cè)得Lsd1米氏方程為Y=1 321 480X+1 260 990，米氏常數(shù)Km為1.048 mmol/L，Vmax為7.9×10-7mmol/(L·min)，并計(jì)算得到kcat/Km分別為8.23×10-6L/(mol·s)；Jmjc米氏方程為Y=1 275 520X+829 909，米氏常數(shù)Km為1.537 mmol/L，Vmax為1.2×10-6mmol/(L·min)，并計(jì)算得到kcat/Km分別為1.06×10-5L/(mol·s)?？梢钥闯?個(gè)酶對(duì)于底物的親和力較優(yōu)，但是由于該類酶催化時(shí)間較長(zhǎng)導(dǎo)致催化效率過低。通過兩者比較，Jmjc的催化能力相對(duì)優(yōu)異。

圖4 Lsd1和Jmjc降解N-甲基-L-亮氨酸的動(dòng)力學(xué)曲線Fig.4 Kinetic curve of N-methyl-L-leucine degradation by Lsd1 and Jmjc

3 結(jié)論與討論

本文進(jìn)行了KDMs的原核表達(dá)以及酶學(xué)性質(zhì)的研究。通過異源表達(dá)以及鎳柱親和層析成功獲得純化的KDMs，對(duì)該酶進(jìn)行了酶學(xué)性質(zhì)表征，結(jié)果顯示Lsd1、Jmjc的最適反應(yīng)溫度分別為35、20 ℃，最適反應(yīng)pH分別為7.0、8.0，Lsd1的溫度穩(wěn)定性相對(duì)較高，Jmjc的酸堿耐受力更強(qiáng)；其中Mn2+對(duì)Lsd1和Jmjc的酶活力都有明顯的促進(jìn)作用，Co2+、Mg2+、Ca2+、Zn2+、Ni2+對(duì)兩者有不同程度的抑制作用；動(dòng)力學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，由于反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，Lsd1和Jmjc的催化效率較低，kcat/Km分別為8.23×10-6、1.06×10-5L/(mol·s)。

本研究首次利用非組蛋白底物對(duì)組蛋白賴氨酸脫甲基酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行表征，且根據(jù)前期的探索確定，KDMs可以用于含N—CH3化合物的降解。根據(jù)報(bào)道發(fā)現(xiàn)，部分微生物可以直接降解該類化合物，例如假單胞菌GSC 1182[24]可以在48 h后降解80%的咖啡因，但是微生物降解底物單一且菌株種類少，因此具備廣譜底物的生物酶法更具優(yōu)勢(shì)。與同樣可以降解該類物質(zhì)的Hpo酶[25]相比，該酶的最適反應(yīng)溫度與Jmjc相同為20 ℃，但是Hpo隨著溫度升高酶活力快速下降，30 ℃時(shí)酶活力就損失了20%，在應(yīng)用方面有很大的局限性，而Lsd1和Jmjc在15～35 ℃酶活力差異較小，45 ℃時(shí)酶活力才損失20%，可以用于溫度相對(duì)較高的降解條件。同時(shí)Hpo酶[25]的最適反應(yīng)pH為6.5，在pH值5.0～7.0，酶活性損失很小，但是堿性條件下酶活力大量損失，降解效率很低，而Lsd1和Jmjc在中性以及堿性的環(huán)境中酶活力損失很小，對(duì)于N—CH3污染物的中性以及堿性條件降解有很大的應(yīng)用意義。

同樣，兩種酶的溫度穩(wěn)定性明顯優(yōu)于已報(bào)道的N—CH3降解酶HspB[26]，HspB在高于30 ℃時(shí)酶活力損失85%以上，而Lsd1和Jmjc在50 ℃時(shí)酶活力僅損失30%左右，溫度耐受性更好，應(yīng)用范圍更寬泛。此外，與HspB酶[26]相比，2種酶的酸堿耐受性相對(duì)優(yōu)勢(shì)，酶更加穩(wěn)定。

但是與Hpo、HspB相比，KDMs的底物親和力較差，且反應(yīng)時(shí)間較長(zhǎng)，因?yàn)樵撁冈隗w內(nèi)維持代謝途徑平衡對(duì)于高催化效率的需求較低，后期可以嘗試通過酶的定向改造，提高酶的反應(yīng)速度以及進(jìn)一步擴(kuò)大底物譜， 更有效的降解化學(xué)方法難以解決的N—CH3污染物。