不同產(chǎn)地枸杞品質(zhì)差異研究

李曼祎，沈天辰，劉春鳳，鄭飛云，鈕成拓，李崎，王金晶*

1(江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(生物工程學(xué)院)，江蘇 無錫，214122) 2(江南大學(xué) 釀酒科學(xué)與技術(shù)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無錫，214122)

枸杞由于其藥食同源的特性被廣泛應(yīng)用于保健食品加工，其富含的甜菜堿，枸杞色素及枸杞多糖具有重要的生物學(xué)功能[1]，如抑制癌細(xì)胞的增殖[2]、提高人體的免疫力、減少肝臟損傷[3]等。中國是枸杞的主要生產(chǎn)國和消費(fèi)國，寧夏、內(nèi)蒙古西部、新疆、青海為枸杞主要產(chǎn)區(qū)。2009—2018年，枸杞的年產(chǎn)量從128 200 t增加到451 000 t。由于不同產(chǎn)區(qū)之間土壤特性、氣候條件和耕作方法不同，果實(shí)質(zhì)量、重量、糖含量和活性物質(zhì)存在差異，從而導(dǎo)致產(chǎn)地之間的風(fēng)味差異[4]。雖然大面積的種植區(qū)提高了枸杞產(chǎn)量，但也造成市面上枸杞質(zhì)量不一，魚龍混雜的現(xiàn)狀。由于糧食市場的全球化，人們對農(nóng)產(chǎn)品的溯源越來越關(guān)注[5]，部分國家制定了確保產(chǎn)品地理標(biāo)志質(zhì)量的政策。自2006年以來，中國已實(shí)施了有關(guān)農(nóng)產(chǎn)品原產(chǎn)地的管理法，以改善原產(chǎn)地條件并確保原產(chǎn)地的質(zhì)量安全。因此，開發(fā)一種快速鑒別產(chǎn)地的方法檢測枸杞的地理來源，對于規(guī)范市場和控制質(zhì)量均具有重要意義。色譜-離子遷移譜法(headspace-gas chromatography-ion mobility spectroscopy，HS-GC-IMS)是一種快速分離和鑒定風(fēng)味化合物的新方法，無需預(yù)處理即可以較低的檢測限進(jìn)行快速分析，在食品質(zhì)量鑒別，溯源及風(fēng)味分析中起著重要的作用[6-7]，如區(qū)分松茸不同部位的風(fēng)味差異，椰子油等級及鑒定伊比利亞火腿真?zhèn)蔚萚8-10]。

如今消費(fèi)者對產(chǎn)地溯源愈加重視，因此本研究通過對不同產(chǎn)區(qū)枸杞化學(xué)成分的測定，結(jié)合氣相離子色譜及偏最小二乘法判別(partial least squares discrimination analysis，PLS-DA)對4個(gè)主要產(chǎn)區(qū)枸杞進(jìn)行區(qū)分，旨在分析地理環(huán)境對枸杞品質(zhì)的影響，確定不同產(chǎn)區(qū)枸杞中含量差異較大的揮發(fā)性風(fēng)味化合物，為枸杞產(chǎn)品的產(chǎn)地鑒定提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 材料及試劑

5%苯酚溶液、硫酸、無水乙醇、檸檬酸、氫氧化鈉、硝酸鋁、亞硝酸鈉等，國藥試劑。

2020年7月，從寧夏回族自治區(qū)中衛(wèi)縣區(qū)域(n=7)、新疆維吾爾自治區(qū)精河縣區(qū)域(n=5)、青海省柴達(dá)木盆地區(qū)域(n=7)和內(nèi)蒙古西部烏拉特前旗區(qū)域(n=5)的4個(gè)主要產(chǎn)區(qū)范圍內(nèi)收集枸杞樣品，有關(guān)收集地區(qū)的地理位置相關(guān)信息匯總至表1。

表1 中國枸杞產(chǎn)區(qū)地理位置Table 1 Location information of wolfberry region in China

1.2 儀器與設(shè)備

PL2002電子天平、AL204分析天平、FE20精密數(shù)顯pH計(jì)，梅特勒托利多儀器有限公司；UV2300紫外-可見光分光光度計(jì)，上海天美公司；Kjeltec8400全自動凱式定氮儀，美國FOSS公司；FlavourSpec 1H1-00053型頂空氣相-離子遷移譜儀，德國G.A.S.公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分測定

水分含量參照GB 5009.3—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品水分的測定》采用直接干燥法進(jìn)行測定；蛋白質(zhì)含量參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中蛋白質(zhì)的測定》采用凱式定氮法進(jìn)行測定；總糖含量參照GB/T 0782—2006《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中總糖的測定》采用滴定法進(jìn)行測定；枸杞多糖、黃酮、類胡蘿卜素含量均參照吳有鋒等[11]經(jīng)超聲提取后采用分光光度法進(jìn)行測定。

1.3.2 GC-IMS測定條件

根據(jù)FANG等[12]的方法稍作修改。樣品預(yù)處理：所有樣品(水分含量相似)用超純水洗滌3次后以料水筆1∶3(g∶mL)浸泡2 h，勻漿，取2 mL枸杞汁放入20 mL頂空瓶中待測。GC條件：柱溫起始溫度50 ℃，保持2 min，以3 ℃/min加熱至125 ℃，保持2 min后以15 ℃/min加熱至160 ℃；載氣為純度≥99.999%氮?dú)?。自動頂空進(jìn)樣器的條件：溫育溫度80 ℃，溫育時(shí)間15 min。在不分流進(jìn)樣模式下于85 ℃注入1 000 μL等分試樣；噴霧方式∶頂空噴霧；加熱方式∶搖動加熱；搖動速度∶600 r/min；IMS的檢測條件：漂移管的長度98 mm，溫度為45 ℃；漂移氣體為高純N2，純度≥99.999%。流速：150 mL/min，線性電壓管:500 V/cm；輻射源:β射線(tri，3H)；電離模式:正離子。

1.3.3 數(shù)據(jù)分析

使用LAV及 Reporter、Gallery Plot插件進(jìn)行樣品分析，通過GC×IMS內(nèi)置NIST數(shù)據(jù)庫和IMS數(shù)據(jù)庫對枸杞樣品中揮發(fā)性化合物進(jìn)行定性。采用PLS-DA(Simca-p軟件)對風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行建模，以確定不同區(qū)域中的特定標(biāo)記。采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行方差分析，P<0.05表示物質(zhì)濃度存在顯著差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分分析

各產(chǎn)地隨機(jī)挑選5份枸杞樣品進(jìn)行化學(xué)成分的測定，各樣品具體理化指標(biāo)及活性物質(zhì)含量見表2，為便于比較不同產(chǎn)區(qū)間的成分差異，對各產(chǎn)區(qū)樣品進(jìn)行顯著性差異分析，結(jié)果匯總于表3。由表3可知，不同地區(qū)樣品中水分、枸杞多糖、黃酮、總糖、蛋白質(zhì)、類胡蘿卜素含量水平均在產(chǎn)區(qū)之間表現(xiàn)出一定差異(P<0.05)。就水分而言，寧夏及內(nèi)蒙古枸杞較為干燥，水分含量在10%～12%，兩產(chǎn)區(qū)之間無顯著差異。新疆枸杞由于顆粒較大導(dǎo)致曬制結(jié)束后殘留水分較多，水分含量達(dá)到(14.83±0.97)%。四產(chǎn)地枸杞樣品的蛋白質(zhì)含量均處于較高水平，在10%～15%波動，與之前研究報(bào)道的結(jié)果相似，也側(cè)面說明枸杞是一種高蛋白質(zhì)的藥食兩用資源。糖是枸杞風(fēng)味重要的組成成分，糖分的積累受不同生態(tài)因子及蔗糖代謝相關(guān)酶的影響[13]，同時(shí)糖分也調(diào)控其生長成熟中眾多物質(zhì)的代謝，大部分果實(shí)中揮發(fā)性香氣物質(zhì)是果實(shí)碳水化合物次生代謝的重要產(chǎn)物[14]，各產(chǎn)區(qū)總糖含量由高至低為：青海>新疆>寧夏>內(nèi)蒙古。有研究表明蘋果果實(shí)從幼果期開始適度干旱脅迫可以提高果實(shí)蔗糖及果糖含量[15]，柴達(dá)木盆地年均降水量為20～80 mm，約為內(nèi)蒙古西部的20%～50%，青海產(chǎn)區(qū)與內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)相比，海拔較高，晝夜溫差增大，中度干旱的環(huán)境促進(jìn)了該產(chǎn)區(qū)枸杞糖分的積累。但過高的含糖量會影響枸杞晾曬制干過程，使枸杞變得潮濕黏軟，不易貯藏[16]。經(jīng)上述理化指標(biāo)綜合比較，內(nèi)蒙與寧夏的枸杞更易貯藏及運(yùn)輸。

表2 中國不同產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分分析(n=3，mean±SD)Table 2 Chemical constituents of wolfberry from different region of China(n=3，mean±SD)

表3 中國不同產(chǎn)地枸杞化學(xué)成分統(tǒng)計(jì)分析Table 3 Analysis of chemical constituents of wolfberry from different region of China

黃酮廣泛存在于自然界植物及漿果中，其作為枸杞的次生代謝物在保健功效中具有重要作用，可抗腫瘤、抗氧化、降低血脂等[17]，除枸杞外銀杏葉片、大豆、葡萄及菊科植物中均含有大量黃酮類化合物。寧夏產(chǎn)區(qū)枸杞黃酮含量最高，達(dá)到(0.44±0.03)%，同一產(chǎn)區(qū)間并無顯著差異。有研究表明土壤中氮及磷元素的缺乏會增強(qiáng)MYBb、bHLH轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)，提高CHS、CHI基因表達(dá)量進(jìn)而促進(jìn)作物體內(nèi)黃酮合成[18-19]，寧夏土質(zhì)中氮、磷及有機(jī)質(zhì)含量較低，相比較其他產(chǎn)區(qū)其土壤條件更利于枸杞中黃酮的積累。枸杞多糖是枸杞中主要的功能性物質(zhì)，可以減輕高脂帶來的內(nèi)臟損傷。研究結(jié)果表明，不同產(chǎn)區(qū)間枸杞多糖含量差異較大，青海產(chǎn)區(qū)枸杞的多糖含量最高，其次為寧夏產(chǎn)區(qū)，兩產(chǎn)區(qū)緯度相近但海拔差距明顯，海拔升高則溫度降低，光照強(qiáng)度及時(shí)間增加，晝夜溫差增大，利于枸杞中多糖的富集，與崔治家等[20]研究結(jié)果相符。而內(nèi)蒙古相比寧夏產(chǎn)區(qū)，海拔相似但緯度差異較大，寧夏產(chǎn)區(qū)年均溫度更高，利于多糖的積累。由此可以看出枸杞多糖含量與地理位置及氣候環(huán)境密切相關(guān)，日照時(shí)間的增加及氣溫的升高均有利于枸杞品質(zhì)的提升。類胡蘿卜素為存在光合植物中的天然色素，具有保護(hù)眼部、預(yù)防心腦血管疾病等重要保健功能，辣椒、柑橘及桃果實(shí)均含有大量類胡蘿卜素。同一產(chǎn)區(qū)內(nèi)類胡蘿卜素含量波動較大，新疆產(chǎn)區(qū)的類胡蘿卜素含量最高，為(227.85±22.91) g/L，內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)樣品最低，為(187.55±26.37)g/L。綜上可以看出中國主要產(chǎn)區(qū)的枸杞品質(zhì)存在一定差異，寧夏及青海產(chǎn)區(qū)地理環(huán)境對黃酮及多糖的積累有一定優(yōu)勢，產(chǎn)區(qū)的生態(tài)條件包括溫度、光照、降水對道地性藥材枸杞的功能性物質(zhì)成分及總糖含量影響較大，選取枸杞栽培區(qū)時(shí)應(yīng)綜合考慮各環(huán)境因子對枸杞品質(zhì)的影響。

2.2 不同產(chǎn)地枸杞揮發(fā)性物質(zhì)的差異

果實(shí)風(fēng)味極大程度上受到產(chǎn)區(qū)環(huán)境影響，不同緯度地區(qū)植物的化學(xué)成分不同[21]，在光照時(shí)間、晝夜溫差、降水量以及氣溫的綜合作用下形成產(chǎn)區(qū)間的風(fēng)味差異。利用HS-GC-IMS鑒定不同產(chǎn)區(qū)中枸杞的揮發(fā)性物質(zhì)，圖1(以內(nèi)蒙古枸杞樣品為例)中光譜代表枸杞樣品的總揮發(fā)性化合物，可以看出大多數(shù)信號峰值位于1.0～1.5 s的漂移時(shí)間和400～1 400 s的保留時(shí)間內(nèi)。IMS檢測依賴于由β電離產(chǎn)生的空氣簇離子與分析物之間的快速離子反應(yīng)。因此，HS-GC-IMS分析對痕量物質(zhì)的檢測更加敏感，除可以準(zhǔn)確鑒定揮發(fā)性化合物外還可以建立樣品完整的指紋圖譜[22]。如圖1所示，縱坐標(biāo)代表氣相色譜的保留時(shí)間，橫坐標(biāo)代表離子遷移時(shí)間。RIP峰(反應(yīng)離子峰，橫坐標(biāo)1.0處紅色豎線)兩側(cè)的每個(gè)點(diǎn)代表一種揮發(fā)性有機(jī)化合物。點(diǎn)的顏色深淺與該種化合物濃度有關(guān)，顏色越深則濃度越高。在4個(gè)產(chǎn)地枸杞樣品中共檢測到72個(gè)峰，通過IMS數(shù)據(jù)庫鑒定出36種揮發(fā)性化合物。由于濃度不同，一些揮發(fā)性化合物會在遷移過程中產(chǎn)生不同的產(chǎn)物離子，即同一種化合物的單體和二聚體[10]。不同產(chǎn)物離子的保留時(shí)間相同，但漂移時(shí)間不同，例如圖1中由黃色方框標(biāo)出的己醛(a、a′)、(E)-2-己烯醛(b、b′)、1-戊醇(c、c′)、1-己醇(d、d′)、糠醛(e、e′)均可觀察到2個(gè)信號峰。

圖1 枸杞氣相離子遷移譜Fig.1 GC-IMS topographic plots of wolfberry

為更直觀地比較不同產(chǎn)地枸杞風(fēng)味成分之間的差異，選擇內(nèi)蒙古枸杞風(fēng)味指紋圖譜作為參比，并以差異比較模式從其他樣品的光譜中扣除該參比。如果揮發(fā)性化合物濃度一致，則扣除后的背景為白色，紅色表示物質(zhì)的濃度高于參比值，藍(lán)色表示物質(zhì)的濃度低于參比值。如圖2所示，不同產(chǎn)地枸杞的揮發(fā)性化合物種類相似，但含量略有不同。大多數(shù)化合物的差異信號集中在400～500 s和1 000～1 200 s的保留時(shí)間內(nèi)(由紅色方框圈出)。與參比相比較，其他三產(chǎn)區(qū)樣品的大部分信號在扣除后均為藍(lán)色，這表明內(nèi)蒙古獨(dú)特的地理環(huán)境對某些化合物的積累起了正向作用，這些物質(zhì)可能成為產(chǎn)地鑒定的關(guān)鍵物質(zhì)。

圖2 枸杞樣品的GC-IMS差異圖譜Fig.2 The differences fingerprint of volatile compounds in wolfberry

2.3 不同地區(qū)枸杞揮發(fā)性物質(zhì)的指紋圖譜

前期利用GC-IMS分析共鑒定出36種揮發(fā)性化合物，具體信息見表4，包括化合物名稱、CAS號、分子式、分子質(zhì)量、漂移時(shí)間、保留指數(shù)和保留時(shí)間。圖3 為使用內(nèi)置Gallery Plot插件生成不同產(chǎn)地枸杞的揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds，VOCs)指紋圖譜，橫坐標(biāo)為每種揮發(fā)性化合物的名稱，用以表征每個(gè)枸杞來源的完整VOCs信息，其中每行代表1個(gè)樣品采集的差異物質(zhì)信號峰，每列代表不同枸杞樣品中相同VOCs的信號峰。其中右側(cè)化合物為產(chǎn)生地域性差異較大的16種化合物(紫色框內(nèi))，由圖3可以直觀觀察到來自不同地區(qū)的枸杞樣品中揮發(fā)性化合物的差異，并建立與每個(gè)產(chǎn)區(qū)相對應(yīng)的特征指紋圖譜。

圖3 枸杞樣品揮發(fā)性香氣化合物指紋圖譜Fig.3 The fingerprint of volatile compounds of wolfberry

表4 特征峰對應(yīng)化合物Table 4 Volatile compounds of wolfberry identified by GC-IMS

鑒定出的風(fēng)味化合物可大致分為酮類、醛類、酯類、醇類、酸類及萜烯類。由于HS-GC-IMS對醛酮類物質(zhì)檢測更加敏感，相比GC-MS方法能夠檢測到更多的醛酮類物質(zhì)[23]。大部分醛酮類物質(zhì)被描述為具有青草及木質(zhì)香氣，有研究表明高海拔低氣溫更利于果實(shí)中醛酮類的積累[24]，青海在四產(chǎn)區(qū)中海拔最高，平均海拔為2 800 m，2-甲基丁醛、糠醛、己醛在該產(chǎn)區(qū)中濃度明顯增加，而在海拔較低的新疆和內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)枸杞中則表現(xiàn)出明顯的降低或缺失(紅色及黃色方框內(nèi))。目前枸杞中醛類風(fēng)味物質(zhì)合成機(jī)理尚未明確，但與枸杞同屬茄科的番茄果實(shí)中2-甲基丁醛合成積累與支鏈氨基酸合成途徑密切相關(guān)[25]，青海柴達(dá)木枸杞17種氨基酸含量均處于較高水平[26]，相比其他產(chǎn)區(qū)，前體物質(zhì)異亮氨酸及亮氨酸含量的增加促進(jìn)了該產(chǎn)區(qū)枸杞2-甲基丁醛的合成。青海產(chǎn)區(qū)醛類物質(zhì)含量的增加使該產(chǎn)區(qū)枸杞可可、咖啡及青草氣味更明顯。酯類是成熟果實(shí)中重要的風(fēng)味化合物，包含直鏈酯類及支鏈酯類2種，主要來源于脂肪酸和氨基酸途徑，其含量受果實(shí)成熟程度及采摘后貯藏溫度影響較大。在四產(chǎn)區(qū)的枸杞樣品中共檢測到3種酯類，分別為異丁酸甲酯、丙酸乙酯、2-甲基丁酸乙酯，表現(xiàn)為菠蘿香味及果香。其中丙酸乙酯含量在產(chǎn)區(qū)間有較大差別，丙酸乙酯為果香型化合物，在成熟草莓及杏果實(shí)中均可被檢測到。鑒定出的12種醇類物質(zhì)中有8種在產(chǎn)區(qū)間差別較大，大部分醇類物質(zhì)表現(xiàn)為青草香及甜香，但由于其氣味閾值較高，對果實(shí)整體風(fēng)味貢獻(xiàn)相比醛類較低[27]，黃瓜及甜瓜中醇類化合物種類及含量較多。由圖4可知，內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)枸杞中1-戊醇、3-甲基-1-丁醇、己醇(綠色方框內(nèi))的含量顯著增加，C5醇類的形成可能與有脂氧合酶(lipoxygenase，LOX)參加的氧化反應(yīng)有關(guān)[28]，LOX廣泛存在于谷物及蔬菜水果中，如水稻、黃瓜、桃果實(shí)等，其在己醛類及醇類風(fēng)味化合物的合成代謝中具有重要作用。番茄果實(shí)中C5風(fēng)味化合物的形成也被認(rèn)為與LOX有關(guān)。內(nèi)蒙古地處內(nèi)陸的地理環(huán)境及土壤氣候更利于醇類的形成與積累，其中正丙醇為內(nèi)蒙古產(chǎn)區(qū)枸杞的特有揮發(fā)性化合物可用于該產(chǎn)區(qū)枸杞的鑒定。萜烯類物質(zhì)雖然含量低，但由于其閾值較低，也是水果中重要的助香化合物[29]。不同產(chǎn)地同一品種果實(shí)的萜烯類組成含量相似，本次研究中α-蒎烯的含量在四產(chǎn)地枸杞中也并無顯著區(qū)別，α-蒎烯作為代表性的單萜類化合物作為植物精油的主要成分，是枸杞果實(shí)香氣的重要來源。

2.4 不同地區(qū)枸杞PLS-DA模型分析

通過PLS-DA將風(fēng)味數(shù)據(jù)進(jìn)行降維處理，相比于PCA，PLS-DA在高維數(shù)據(jù)的可視化、判別分析與代謝變化有關(guān)的潛在代謝物方面更具優(yōu)勢[30]。其中R2和Q2分別代表該模型的解釋性和預(yù)測性，R2和Q2值越接近于1則擬合越好。由圖4-a可知，枸杞樣品被大致分為四類，主成分1和主成分2的貢獻(xiàn)率分別為71.4%和8.45%，累積貢獻(xiàn)率達(dá)到79.85%，能夠反應(yīng)不同產(chǎn)地枸杞差異性揮發(fā)性物質(zhì)的總體狀態(tài)。模型擬合度較好，其中R2Y=0.847 4，Q2=0.715 1。此外，該模型經(jīng)過交叉驗(yàn)證的200次置換測試，并未出現(xiàn)過擬合現(xiàn)象。使用變量投影重要性(variable importance in projection，VIP)分析來進(jìn)一步確定可以有效區(qū)分產(chǎn)地的標(biāo)記物質(zhì)，其中VIP值是選擇潛在分類標(biāo)記物的主要參數(shù)，代表特定標(biāo)記與不同產(chǎn)地枸杞樣品的相關(guān)性。通常認(rèn)為潛在標(biāo)記的VIP得分應(yīng)>1，>1.5則更佳[30]。圖4-b列出了16種化合物的VIP值，其中有5種物質(zhì)VIP值>1且在不同產(chǎn)地中表現(xiàn)出顯著的濃度差異，分別為糠醛D(>1.5)，1-辛烯-3-醇，葉醇，2-甲基丁醛及異戊醛，可以認(rèn)為是區(qū)分不同產(chǎn)地的關(guān)鍵性風(fēng)味物質(zhì)。

a-主成分分析；b-VIP值圖4 四個(gè)產(chǎn)地枸杞差異揮發(fā)性物質(zhì)PLS-DA分析Fig.4 PLS-DA analysis of different volatile substances in wolfberry from four producing areas

3 結(jié)論

枸杞是中國最具地域性的漿果之一，本研究通過HS-GC-IMS分析了來自4個(gè)產(chǎn)地的枸杞中風(fēng)味物質(zhì)的差異，發(fā)現(xiàn)地理環(huán)境對其中的風(fēng)味化合物的形成具有重要影響。不同產(chǎn)區(qū)枸杞中共鑒定出36種風(fēng)味化合物，醛類及醇類化合物占比較大，16種物質(zhì)濃度表現(xiàn)出顯著差異。且正丙醇為內(nèi)蒙古地區(qū)枸杞中的特有物質(zhì)，可作為地域性標(biāo)記。通過VIP分析篩選出5種標(biāo)記物質(zhì)可用于區(qū)別枸杞產(chǎn)地，分別為糠醛(>1.5)、1-辛烯-3-醇、葉醇、2-甲基丁醛及異戊醛，通過標(biāo)記性物質(zhì)的含量差異分析，可以為鑒定其產(chǎn)品產(chǎn)地提供參考。但由于本次試驗(yàn)樣本量有限，若進(jìn)一步擴(kuò)充樣本量則可以建立更優(yōu)的模型用于枸杞的產(chǎn)地分類，且IMS數(shù)據(jù)庫還不夠完善，仍有部分物質(zhì)無法鑒別，需通過其他技術(shù)進(jìn)一步進(jìn)行定性分析。