基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對(duì)接研究丹芎活血片治療骨性關(guān)節(jié)炎的機(jī)制

郭晉言 梁銘林 黃煜智 曾豪杰 陳倩文 楊 春▲ 杜以寬

1.廣東醫(yī)科大學(xué)干細(xì)胞與再生組織工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523808；2.廣東省東莞市人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣東東莞 523059

骨性關(guān)節(jié)炎（osteoarthritis，OA）是由于關(guān)節(jié)先天性異常、關(guān)節(jié)畸形等因素引起關(guān)節(jié)軟骨退化損傷[1]，主要通過(guò)口服藥物與手術(shù)緩解癥狀[2]，但治療的相關(guān)不良反應(yīng)多[3]。既往研究[4]證實(shí)，中藥在治療OA、改善生存質(zhì)量、明顯延長(zhǎng)無(wú)病生存期等方面發(fā)揮積極作用。骨關(guān)節(jié)炎屬中醫(yī)學(xué) “痹證” 或 “瘺證” 范疇[5]，正氣不足是其發(fā)病內(nèi)因，濕、熱、寒、風(fēng)是其發(fā)病外因[6]，治療以補(bǔ)肝腎、盈氣血為主。

丹芎活血片是蔡立民教授根據(jù)多年臨床辨證經(jīng)驗(yàn)提出的成方，其采用活血化瘀、固正扶陽(yáng)的方法，正切中病機(jī)，研究顯示其抗凝效果確切，能通過(guò)促進(jìn)局部的血液循環(huán)改善關(guān)節(jié)功能，顯著提高患者生存質(zhì)量，但具體作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究[7]，而采用單一的機(jī)制研究不能體現(xiàn)丹芎活血片治療OA 的整體性與多向性。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)將藥物作用靶點(diǎn)和疾病靶點(diǎn)結(jié)合，建立疾病、靶點(diǎn)、藥物及通路之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從而全面系統(tǒng)地分析藥物的作用機(jī)制[8]。因此本研究對(duì)丹芎活血片進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究，旨在為后續(xù)基礎(chǔ)與臨床研究提供分子機(jī)制基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 篩選丹芎活血片的成分與靶標(biāo)

檢索TCMID 數(shù)據(jù)庫(kù)（http://tcmspw.com/tcmsp.php）和SymMap 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://www.symmap.org/），收集既往文獻(xiàn)中當(dāng)歸[9]6 個(gè)成分、丹參[10]6 個(gè)成分、川芎[11]6 個(gè)成分、蘇木[12]4 個(gè)成分、土鱉蟲(chóng)[13]5 個(gè)成分、血竭[14]6個(gè)成分、澤蘭[15]5 個(gè)成分、路路通[16]5 個(gè)成分、粉防己[17]1 個(gè)成分、桑枝[18]6 個(gè)成分。以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，類(lèi)藥性（drug-likeness，DL）≥0.18 為條件，得到成分并查詢(xún)對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)。

1.2 篩選OA 的靶點(diǎn)

在Gene Cards（https://www.genecards.org/）、OMIM（https://omim.org/）、DisGeNET（https://www.disgenet.org/）等數(shù)據(jù)庫(kù)檢索 “Osteoarthritis”，獲得疾病靶點(diǎn)。

1.3 “中藥-成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

用Venny 對(duì)藥物與疾病靶點(diǎn)取交集獲得共同靶點(diǎn)，并在Cytoscape 3.7.2 構(gòu)建 “中藥-成分-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)。采用Cytoscape 分析網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

在STRING（https://string-db.org/）構(gòu)建蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)，獲得核心網(wǎng)絡(luò)模塊。

1.5 基因本體與京都基因與基因組百科全書(shū)途徑富集分析

借助DAVID 數(shù)據(jù)庫(kù)（https://DAVID.ncifcrf.gov/）進(jìn)行基因本體（gene ontology，GO）、京都基因與基因組百科全書(shū)途徑富集（Kyoto encyclopedia of genes and genomes pathway enrichment，KEGG）分析，用于預(yù)測(cè)藥物治療OA 的生物過(guò)程。

1.6 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將成分、靶點(diǎn)和信號(hào)通路導(dǎo)入微生信網(wǎng)站（http://www.bioinformatics.com.cn）構(gòu)建網(wǎng)絡(luò)圖，篩選排名前5位的成分進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

1.7 有效成分-靶點(diǎn)分子對(duì)接

利用LEDOCK 分子對(duì)接軟件，將有效成分與核心靶點(diǎn)進(jìn)行分子對(duì)接驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 活性成分獲取

篩選得到丹芎活血片的活性化合物50 個(gè)（表1），對(duì)應(yīng)的靶點(diǎn)1128 個(gè)。

表1 丹芎活血片的成分信息表

2.2 疾病靶點(diǎn)

篩選得到丹芎活血片的疾病靶點(diǎn)774 個(gè)。用Venny 取藥病靶點(diǎn)交集，得到50 個(gè)共同靶點(diǎn)，見(jiàn)圖1。

圖1 藥物與OA 靶點(diǎn)交集的韋恩圖

2.3 “藥物-化合物-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)圖

該網(wǎng)絡(luò)圖度值排名前5 的有效成分為槲皮素，山柰酚，姜黃素，阿魏酸，藁本內(nèi)酯（圖2），這可能是治療OA 的活性成分。

圖2 “藥物-化合物-靶點(diǎn)” 網(wǎng)絡(luò)

2.4 PPI 結(jié)果

在閾值≥0.7 中，Cytoscape 3.7.2 篩選出STAT3、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、JUN 有密切聯(lián)系；在0.9 的高度閾值中，篩選顯示STAT3、VEGFA、IL-6、TNF、JUN、MMP9 是核心成分（圖3），以此作為分子對(duì)接的靶點(diǎn)。

圖3 PPI 網(wǎng)絡(luò)圖

2.5 GO 和KEGG

本研究中，GO 結(jié)果顯示，分子功能富集于聚合酶Ⅱ啟動(dòng)子轉(zhuǎn)錄陽(yáng)性、細(xì)胞質(zhì)、蛋白質(zhì)結(jié)合等（P<0.05）（圖4，封四）。KEGG 結(jié)果顯示，在癌癥、乙型肝炎、核因 子κB （nuclear factor κB，NF -κB）、PI3K -Akt 和JAK-STAT 信號(hào)通路中富集（圖5）。

圖4 GO分析圖（見(jiàn)內(nèi)文第5頁(yè)）

圖5 KEGG 分析圖

2.6 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖

將成分、靶點(diǎn)、前10 條通路使用Cytoscape 3.7.2構(gòu)建 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖。前5 個(gè)成分為阿魏酸、芥子酸、異阿魏酸、姜黃素、山柰酚（圖6），以此作為分子對(duì)接的成分。

圖6 “成分-靶點(diǎn)-通路” 網(wǎng)絡(luò)圖

2.7 分子對(duì)接

以6 個(gè)核心靶點(diǎn)與5 個(gè)有效成分進(jìn)行分子對(duì)接（圖7），結(jié)果顯示，STAT3、VEGFA、IL-6、TNF、JUN、MMP9 的結(jié)合能均小于-5 kJ/mol，說(shuō)明有較好的結(jié)合活性。

圖7 藥物和靶點(diǎn)的分子對(duì)接過(guò)程圖

3 討論

本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)分析，得到的槲皮素、山柰酚、姜黃素、阿魏酸已有文獻(xiàn)證明對(duì)OA 有療效，并通過(guò)PPI獲得STAT3、MMP、IL-6、TNF、JUN。其中IL-6 嚴(yán)重破壞關(guān)節(jié)軟骨組織平衡，而TNF-α 可以阻斷軟骨膠原的合成，導(dǎo)致軟骨基質(zhì)降解和破壞[19]。槲皮素可降低IL-6、IL-1β 和TNF-α 的分泌水平，并在蛋白水平下

調(diào)Nlrp3、caspase-1、proIL-1β 和IL-1β 的表達(dá)[20]，表現(xiàn)其抗氧化性和抗炎活性，從而治療OA[21]。山柰酚可抑制bFGF-FGFR3-RSK2 信號(hào)抑制類(lèi)風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞的增殖和遷移，抑制活性T 細(xì)胞介質(zhì)的炎癥細(xì)胞因子（如IL-17、IL-21 和TNF-α）的釋放[22]，而Tanideh 等[23]在利用山柰酚治療前交叉韌帶橫切術(shù)（anterior cruciate ligament transection，ACLT）誘導(dǎo)的大鼠的實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn)大鼠體內(nèi)的MMP-13、MMP-3、TNF-α、IL-1 明顯降低。姜黃素同樣可以充當(dāng)抗炎藥，抑制軟骨細(xì)胞中NF-κB 介導(dǎo)的IL-1β/TNF-α 分解代謝信號(hào)通路[24]，由此可見(jiàn)，丹芎活血片中的活性成分能從多方面抑制關(guān)節(jié)病變的過(guò)程，從而發(fā)揮治療OA 的作用。

KEGG 結(jié)果顯示，調(diào)節(jié)PI3K/AKT 信號(hào)通路可以治療OA。OA 患者中miR-146a-5P 表達(dá)增加，促進(jìn)軟骨細(xì)胞凋亡和炎癥反應(yīng)[25]。在OA 大鼠模型中，山柰酚抑制了miR-146a 和Decorin 在軟骨組織中的表達(dá)，從而激活PI3K/Akt/mTOR 信號(hào)通路，與KEGG 的結(jié)果一致[26]。NF-κB 信號(hào)通路也與治療OA 相關(guān)，槲皮素通過(guò)抑制TNF-α 和NF-κB 之間的正反饋調(diào)節(jié)，從而起到治療OA 的作用[27]。為了客觀展示藥物治療OA的分子機(jī)制，本研究結(jié)合了藥物與疾病的映射靶點(diǎn)和信號(hào)通路的結(jié)果，繪制了科學(xué)假說(shuō)圖（圖8，封四），為全面深入地了解作用機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

本研究借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)，預(yù)測(cè)槲皮素、山柰酚、姜黃素、阿魏酸通過(guò)靶向PI3K/Akt、NF-κB 信號(hào)通路中的TNF、NF-κB、AKT 等分子起作用，從分子水平方向揭示了丹芎活血片治療OA 的潛在作用機(jī)制，為后期藥物研發(fā)及疾病治療提供一定理論依據(jù)。