豬流行性腹瀉與豬傳染性胃腸炎二重液相芯片檢測方法的建立

曹丙蕾，張 群，劉 敏，王 群，尹偉力

（1.濟南海關(guān)技術(shù)中心，山東 濟南 250014；2.青島海關(guān)技術(shù)中心，山東 青島 266114）

豬流行性腹瀉和豬傳染性胃腸炎是由冠狀病毒引起的急性、高傳染性腹瀉病，它們會導致豬嘔吐、水樣腹瀉和脫水，臨床表現(xiàn)較為相似，在發(fā)病機制、病理變化及流行病學上難以鑒別診斷[1]。液相芯片技術(shù)就是一種新型快速高通量的檢測技術(shù)，將PCR的多重性和液相芯片檢測的快速性有效地結(jié)合起來，在疾病檢測、病原微生物鑒定、激素水平測定、藥物研發(fā)、細胞因子檢測等各領(lǐng)域得到了快速發(fā)展與應用[4-6]。本研究采用液相懸浮芯片技術(shù)建立了PEDV和TGEV的二重鑒別診斷技術(shù)，快速有效地對2種病原進行鑒別診斷，為臨床樣本檢測提供高效靈敏的檢測平臺。

1 材料與方法

1.1 毒株

豬流行性腹瀉病毒（PEDV）、豬傳染性胃腸炎病毒（TGEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）等核酸樣本由本實驗室保存，PEDV和TGEV等體積病毒液混合制備PEDV和TGEV混合樣本。參考磁珠法病毒核酸提取試劑盒說明對病毒樣本進行核酸提取。

1.2 試劑與耗材

磁性熒光編碼微球（帶有anti-TAG標簽）、鞘流液（美國Luminex公司生產(chǎn)），TMAC（四甲基氯化銨）、Tris、SDS、鏈霉親和素－藻紅蛋白（SA-PE）（美國Sigma公司生產(chǎn)），磁珠法病毒RNA提取試劑盒（西安天隆公司生產(chǎn)），一步法RTPCR試劑盒、一步法熒光RT-PCR試劑盒、DL2000 marker等試劑（Ta kara公司生產(chǎn)）。

主要設(shè)備包括：Bio-Plex 200懸浮芯片系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司生產(chǎn)），核酸提取儀（天根科技公司生產(chǎn)），基因擴增儀（杭州博日公司生產(chǎn)），熒光定量PCR儀（美國Bio-Rad公司生產(chǎn)）等。

1.3 方法

1.3.1 引物的設(shè)計與合成

根據(jù)GenBank上公布的PEDV和TGEV基因序列，通過DNA Lasergene軟件分析基因序列，找出最保守的基因序列，利用軟件設(shè)計特異性引物，在上游引物5’端添加特異性標簽序列（TAG）（與Luminex公司提供x-TAG磁性微球上的anti-TAG序列反向互補），Spacer C9作為引物與TAG的連接臂，下游引物5’端用生物素標記。引物由上海生工生物工程有限公司制備。

1.3.2 二重RT-PCR反應體系的建立

以PEDV、TGEV和PEDV與TGEV的混合核酸樣本為模板，按照一步法RT-PCR試劑盒說明配置50μL反應體系進行擴增，通過退火溫度及循環(huán)條件的優(yōu)化，建立二重RT-PCR擴增方法。反應條件為：50℃30 min；94℃預變性2 min；94℃30 s，55℃30 s，72℃30 s，35個循環(huán)；72℃5 min，4℃保存，反應結(jié)束后，將PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果[2]，并將PCR產(chǎn)物送往上海生工生物工程有限公司進行測序，剩余的PCR產(chǎn)物立即用于液相芯片檢測[3]。

1.3.3 液相芯片檢測體系的建立

（1）雜交。選取帶有anti-TAG標簽的28號和12號磁性微球各50μL分別在渦旋儀上以最高轉(zhuǎn)速12 000×g懸浮微球，然后在超聲清洗儀上超聲清洗微球20 s。用1.5×TMAC雜交緩沖液將2種微球分別稀釋至終濃度125個/μL制備混合微球工作液，渦旋混勻后向每個反應孔中加入20μL微球工作液。背景對照孔內(nèi)加入5μL TE（pH8.0）緩沖液，PCR產(chǎn)物2μL加入到反應孔中，TE緩沖液補足至25μL，然后每孔加入含有8 ng/μL SAPE的1×TMAC緩沖液75μL，充分混勻，置于基因擴增儀上95℃5 min，37℃30 min下進行雜交反應。

將板轉(zhuǎn)移到磁力板上，洗去未結(jié)合的PCR產(chǎn)物，然后每孔加入70μL TE溶液，搖勻重懸微球，置于Bio-Plex 200上檢測分析，以去除本底熒光值BFI后的中位熒光值（MFI）作為樣品的中位熒光值，以樣品與陰性對照的中位熒光值之比作為Cut-off值，當MFI≥200，且Cut-off值≥3時，認為結(jié)果有效，結(jié)果判為陽性，否則為陰性。

（2）雜交條件的優(yōu)化。首先，將雜交溫度分別設(shè)置為30℃、37℃、42℃、45℃和50℃。按上述步驟進行雜交檢測，通過MFI值確定最佳雜交溫度。確定雜交溫度后，將雜交時間分別設(shè)置為25 min、30 min、35 min、40 min和45 min。雜交檢測同上，判斷依據(jù)同上。

1.3.4 特異性檢測

分別對混合樣本、PEDV、TGEV、PRRSV等核酸樣本進行RT-PCR擴增，將擴增產(chǎn)物與偶聯(lián)的熒光編碼微球進行雜交檢測，檢測所建立的二重液相芯片方法的特異性。

1.3.5 重復性檢測

對PEDV與TGEV的混合核酸樣本進行3次重復檢測，判定二重液相芯片檢測體系的重復穩(wěn)定性。

1.3.6 臨床樣本的檢測及比對

采用建立的二重液相芯片檢測方法對36份臨床樣本進行檢測，同時進行熒光定量RT-PCR檢測，結(jié)果進行比較分析，以驗證檢測方法的有效性和適用性。

2 結(jié)果

2.1 二重RT-PCR擴增結(jié)果

擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳分析（見圖1）顯示PEDV擴增條帶大小為137 bp，TGEV擴增條帶大小為207 bp，混合樣本擴增出137 bp和207 bp的2種目的條帶，與預期擴增片段大小一致，測序結(jié)果表明與在GenBank上公布的序列同源性為100%。該二重RT-PCR特異性好，對其他無關(guān)核酸樣本無特異擴增，引物及各模板之間無非特異性擴增，靈敏度較好。

2.2 液相芯片檢測體系的建立

2.2.1 雜交溫度的優(yōu)化

有效熒光編碼微球數(shù)量超過100個，偶聯(lián)熒光編碼微球真實有效。熒光編碼微球空白對照MFI值均＜500，測試可判斷結(jié)果。

不同雜交溫度優(yōu)化檢測結(jié)果表明在37℃雜交反應時MFI值最高，反應良好，符合判定標準，故最佳雜交溫度設(shè)為37℃。

2.2.2 雜交時間的優(yōu)化

不同雜交反應時間優(yōu)化檢測表明，在雜交進行到25 min和30 min時得到的MFI值相近，普遍高于20 min、35 min和40 min的反應值，考慮到實驗簡便性，最佳雜交時間應選為30 min。

綜上分析，在液相芯片檢測中，雜交條件定為37℃30min，整個反應用時約4 h，可最終判定檢測結(jié)果。

2.3 特異性檢測

特異性檢測結(jié)果顯示混合樣本中的TGEV和PEDV的MFI值均＞200，QC比值明顯大于3，TGEV單個樣本檢測和PEDV單個樣本檢測的MFI值也均＞200，QC比值明顯＞3，而其他無關(guān)病毒核酸MFI值＜200，QC比值明顯＜3，試驗結(jié)果有效。該檢測方法對含有PEDV與TGEV的混合樣本具有較好的特異性，且能根據(jù)熒光編碼微球的不同進行PEDV與TGEV鑒別診斷，而且對于TGEV和PEDV的單個樣本的檢測也具有較好的特異性，對其他無關(guān)病毒核酸無交叉反應。

2.4 重復性檢測

對PEDV和TGEV二重PCR產(chǎn)物重復進行3次的液相芯片檢測，均獲得較好的結(jié)果，各批次間差異不明顯，表明該檢測體系穩(wěn)定，重復性良好。

2.5 臨床樣本檢測

從檢測結(jié)果可知，液相芯片檢測法陽性檢測結(jié)果與熒光定量RT-PCR法檢測結(jié)果一致，而熒光定量RT-PCR檢測存在可疑結(jié)果，經(jīng)測序驗證后排除，判定為陰性，故2種方法的檢測結(jié)果符合率為100%。與熒光定量方法相比，液相芯片檢測減少了檢測步驟，檢出率較高，準確性較高。

3 討論

目前市場上使用的液相芯片的xTAG微球與anti-TAG微球根據(jù)結(jié)核分枝桿菌的序列設(shè)計，不含有堿基G，x-TAG與anti-TAG互補，雜交溫度相同。用帶有TAG序列的探針對擴增產(chǎn)物進行目標特異性引物延伸，得到帶有TAG序列的單鏈片段，從而解決雜交溫度均勻性問題。

在總結(jié)前人研究成果的基礎(chǔ)上，在引物合成中引入TAG序列，在PCR擴增中通過引物配對延伸使TAG序列與擴增產(chǎn)物相連，大大提高了與anti-TAG微球的偶聯(lián)效率。

建立的PEDV和TGEV二重液相芯片檢測方法可以快速準確區(qū)分診斷PEDV和TGEV混合感染樣本，具有較好的特異性.因此，更準確地判斷2種癥狀非常相似的病毒病，為有效控制動物疫病疫情提供技術(shù)支持，具有廣闊的應用前景。