3D打印異煙肼載藥微球支架及體外釋藥研究

譚 浩，周建平，許 燕，張旭婧

(新疆大學 機械工程學院，新疆 烏魯木齊 830047)

0 引言

骨組織工程是將成骨細胞種植在具有高生物相容性并且可降解的支架上，促進成骨細胞增殖分化為骨骼，同時支架材料逐漸被降解，達到治療骨缺損的目的[1-3]?，F(xiàn)階段針對疾病性骨缺損，在骨組織工程的基礎上，加入了對病灶處的藥物精準、持續(xù)釋放，既保證了骨骼的生長，也促進了疾病的治療。異煙肼是骨結(jié)核治療的親水性藥物，并常與組織工程骨支架結(jié)合使用，但該類藥物存在一定的毒副作用，過多藥物易使體內(nèi)臟器受損[4-6]，此類藥物的控釋對載藥骨支架應用尤為重要。

3D打印是目前新興的一種制造方法，利用3D打印技術(shù)結(jié)合不同患者病灶處的具體情況，能夠制備出在外形上與骨缺損地帶相匹配的骨支架，通過工藝調(diào)節(jié)將藥物與支架材料相結(jié)合打印，實現(xiàn)在病灶處藥物投放和緩釋，提高藥物利用率并大幅度提高治療效果。湖南大學喬小銀[7]通過3D打印的方法制備了負載阿霉素及順鉑雙藥物的抗癌緩釋支架，通過體外以及體內(nèi)實驗，成功抑制原位乳腺癌小鼠的乳腺腫瘤生長，實現(xiàn)了對病灶處的精準靶向治療。載藥微球是可以實現(xiàn)藥物緩釋的載體，其對藥物的包覆是控制藥物緩釋的重要途徑。將微球與骨組織工程支架結(jié)合，能夠進一步控制支架的藥物釋速度進而提高藥物利用率，減少藥物對人體的損傷。

羥基磷灰石(Hydroxy Apatite,HA)是打印骨支架常用的天然骨材料，結(jié)合具有良好的生物相容性絲素蛋白(Silk Fibroin，SF)制備支架，能夠增加支架的骨誘導性和傳導性，促進骨骼生長[8-10]。SF源于蠶絲脫膠而得的纖維狀蛋白質(zhì)，其二級構(gòu)象以無規(guī)線團、α-螺旋及β-折疊形式存在。二級結(jié)構(gòu)可在外界因素如溫度、濃度、pH值、應力、離子的影響下由無規(guī)線團不穩(wěn)定結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化為β-折疊穩(wěn)定結(jié)構(gòu)。在微球的制備中，聚乳酸-羥基乙酸、殼聚糖、SF是最常用的材料。聚乳酸-羥基乙酸是人工高分子聚合物，微球在使用過程中能夠較快降解，但同時會產(chǎn)生酸性環(huán)境。殼聚糖、SF同屬于天然高分子聚合物，而改變β-折疊結(jié)構(gòu)含量可以調(diào)整SF的親疏水特性，能夠進一步調(diào)整微球的載藥、緩釋以及力學性能，因此利用SF制備載藥微球，可以在保證微球的生物相容性的同時，進一步優(yōu)化支架的釋藥、力學性能。蘭州大學的喬永杰、甄平等[11]利用聚乳酸聚羥基乙酸微球搭載了異煙肼以及鏈霉素藥物制備了載藥支架，結(jié)果表明支架和藥物之間具有良好結(jié)合性，并具有良好的藥物釋放效果。燕山大學宋河儒等人[12]利用殼聚糖制備了核殼結(jié)構(gòu)微球，提高了微球的緩釋性能。太原理工大學吉立靜等人[13]通過自組裝的方法，成功制備了負載姜黃素的SF微球，并通過調(diào)整微球的大小和乙醇介質(zhì)的體積分數(shù)，實現(xiàn)了對微球釋藥速率控制?，F(xiàn)階段微球探究已較為完備，通過微球能夠很好地調(diào)節(jié)藥物的釋放速率，進一步完善藥物的控釋。

為了制備能夠控釋藥物，并具有高生物相容性的載藥微球骨支架，本文以異煙肼作為代表性藥物，利用擠出沉積式3D打印法，將SF微球與支架材料混合制備載藥骨支架。通過支架材料與藥物的量效關(guān)系，計算出不同載藥量下骨支架所需的總藥量，并通過微球的釋藥機理，探究出微球?qū)χЪ艿木忈?、降解、力學性能的影響，為制備可控釋載藥微球支架提供參考。

1 實驗方法

1.1 試劑和儀器

SF(粒徑350 nm，新天絲生物技術(shù)有限公司)；HA(純度96%，粒徑40 nm，南京愛普瑞納米材料有限公司)；異煙肼(上海源葉生物科技有限公司)；磷酸鹽緩沖液(pH=7.0～7.2，0.006 7 M(PO4)，HyClone公司);Span-80、溴化鋰、聚乙烯醇(Poly Vinyl Alcohol,PVA)、碳酸鈉(北京博奧拓達科技有限公司)；數(shù)顯恒溫磁力攪拌器(常州越新儀器制造有限公司)；紫外分光光度計(浙江力辰科技有限公司)；恒溫振蕩器(浙江納德科學儀器有限公司);微機控制電子萬能試驗機(WDW-20，方辰儀器設備公司)，自主研制3D打印機。

1.2 異煙肼標曲

精準稱量異煙肼藥物50 mg加入100 mL磷酸鹽緩沖液(Phosphate Buffer Saline，PBS)，配置為500 μg/mL的緩沖液，將其分別稀釋成0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、5 μg/mL、10 μg/mL、15 μg/mL、20 μg/mL的異煙肼標準液，利用紫外分光光度計，得到異煙肼藥物標準曲線，檢測得到異煙肼藥物標準試樣溶液的吸光度。經(jīng)實驗測得最大吸光值在262.5 nm處，回歸方程為y=0.343 97x-0.016 25，R2=0.994 9。

1.3 SF溶液制備

稱取一定質(zhì)量的蠶繭，以浴比為1∶50加入質(zhì)量分數(shù)0.5%的碳酸鈉溶液中，清洗烘干以浴比1∶4浸潤于9.3 mol/L的溴化鋰溶液中溶解，用去離子水在透析袋中透析4天，每7 h更換溶液，之后離心制備成SF溶液冷藏備用，通過干燥法測量得到SF溶液濃度為3%。

1.4 載藥微球制備及性能測試

采用乳化法制備異煙肼微球。將Span-80與液體石蠟共混作為油相，以400 r/min磁力攪拌20 min至充分混勻，將SF溶液與異煙肼按比例混合作為水相。將水相緩慢滴入油相中，油相與水相比例在6∶1～14∶1之間，400 r/min持續(xù)攪拌乳化30 min，得到穩(wěn)定均勻的油包水相(W/O)初乳液，將異丙醇滴入W/O初乳液中持續(xù)攪拌30 min。將混合乳液以3 000 r/min離心3次，每次10 min，再用異丙醇洗滌兩次，超純水洗滌一次。離心后收集沉淀物，真空冷凍干燥，獲得粉末狀異煙肼載藥微球。微球形貌電鏡圖如圖1所示，微球表面較為光滑，粒徑均勻且成球效果較好。通過吸光度檢測得知微球的載藥率為3.2%。

圖1 載藥微球電鏡圖Fig.1 Electron microscopy of drug-loaded microspheres

1.5 PVA/SF水凝膠制備

通過加熱法將PVA與蒸餾水按比例制備成15%濃度的PVA溶液，將SF溶液與PVA溶液按照1∶4質(zhì)量比混合制備成PVA-SF凝膠。有研究表明SF與PVA結(jié)合，可增強水凝膠材料的生物相容性及增加孔隙率，加快支架內(nèi)外物質(zhì)的交換速度，促進支架內(nèi)部藥物的釋放[14]。

1.6 載藥支架制備

1.6.1藥物含量計算

由于載藥骨支架的藥量通常需要根據(jù)打印支架的數(shù)量或浸泡載藥等方式進行后處理計算，而材料遺留以及藥物與支架結(jié)合方式不穩(wěn)定將造成較大誤差。為此本文采用質(zhì)量控制法，基于單位材料與單個支架的質(zhì)量比，得出實驗時應加入的藥物總質(zhì)量My,具體計算公式為

(1)

式中，Mo為單個支架質(zhì)量，Mu為1 g支架材料(HA+β-磷酸三鈣)與PVA混合冷凍干燥后的質(zhì)量，X0為單個支架中應載的藥物量，Ma為實驗時加入的材料(HA+β-磷酸三鈣)總質(zhì)量。

1.6.2 微球支架制備

按照式(1)和微球的載藥率計算出應加入的藥量和微球質(zhì)量，制備成總藥量均為18 mg的3組藥物粉末。分別為異煙肼純藥物粉末，總藥量的3%為微球的混合藥物粉末，總藥量的6%為微球的混合藥物粉末。

將HA與β-磷酸三鈣按照質(zhì)量比3∶2制備成固體打印芯材，分別與3組藥物粉末均勻混合加入PVA/SF水凝膠中，按照質(zhì)量比5∶8均勻攪拌，制作成3種不同微球含量的3D打印芯材。在3D打印機中利用G代碼控制機進行支架打印，制備成高1 cm，長、寬0.8 cm的載藥支架，最后通過冷凍干燥的方式對支架進行定形處理，3種支架如圖2所示。

圖2 3D打印載藥骨支架Fig.2 3D printed drug-loaded polymer scaffolds

1.7 載藥骨支架藥物釋放性能測試

將3組載藥支架放在PBS溶液中，在37 ℃恒溫振蕩器中累計釋藥84 d，分別在1 d、2 d、7 d、14 d、28 d、42 d、56 d、70 d、84 d更換并留存緩釋液，通過紫外分光光度計分別測出每階段的藥物濃度，累加后得出累計釋藥率Q,具體計算公式為

(2)

式中，t為測樣次數(shù),n為測樣總次數(shù),Ct為第t次測得的藥物濃度,Vt為第t次測樣所取的液體體積,X0為每個支架的載藥量。

1.8 載藥骨支架體外降解研究

對載藥支架采用模擬體液浸泡法對支架進行體外降解研究。將異煙肼載藥支架放入PBS緩沖液中，并在恒溫振蕩器中，37 ℃條件下培養(yǎng)84 d。根據(jù)人體體液更換規(guī)律，設置每14 d更換一次，設置每2周更換一次PBS溶液，并取出支架進行干燥稱重，持續(xù)觀察支架形貌[15]。

1.9 力學性能測試

將制備的載藥支架放在壓縮試樣機上進行壓力測試，設置速度為2 mm/min，通過傳感器得到壓力數(shù)據(jù)，并用Origin軟件繪制壓力/應變曲線。根據(jù)壓縮強度公式以及彈性模量公式分別計算3組支架的最大抗壓強度σmax及彈性模量E:

式中，F(xiàn)max為破壞時的最大載荷,A為樣本試驗接觸面面積,F為試驗力，L為試樣高度，ΔL為軸向變形，σ為正應力，ε為應變。

2 結(jié)果與討論

2.1 載藥骨支架藥物分析

2.1.1異煙肼微球支架釋藥量分析

在3種載藥支架中各取出3個緩釋樣品，計算得出3種載藥支架前一周的累計藥物釋放量如圖3所示。通過圖3可以得出，在1 d及1～3 d時間段內(nèi)，各組平行支架間藥物釋放量基本相同，藥量誤差在10～14 μg范圍內(nèi)，采用SPSS 2.0進行統(tǒng)計學分析，對數(shù)據(jù)進行組間多重比較，檢驗水準為α=0.05。經(jīng)SPSS軟件分析得出P>0.05，說明同種支架的差異性不顯著。由于前期為支架表面藥物釋放，支架形貌和結(jié)構(gòu)對藥物釋放的影響較大會造成較大誤差，因此通過3D打印方法控形，結(jié)合藥物計算，減少了同種支架藥物釋放的誤差，確保了支架藥量控制的準確性。2 d后，微球支架藥物釋放量開始小于純藥物支架。這是由于微球搭載藥物存在于微球表面以及微球內(nèi)部，當微球緩釋時會將表面藥物優(yōu)先釋放，隨著微球的降解微球內(nèi)部的傳質(zhì)通道逐漸增多、擴大，使微球內(nèi)部藥物緩慢釋放，因此加入微球的支架釋放速率更為緩慢[16]。

圖3 各時間階段內(nèi)支架累計釋藥量Fig.3 Cumulative amount of drug released from stents in each time phase

2.1.2 異煙肼微球支架釋藥率分析

通過3D打印的方法，保證了支架間形貌的一致，減小了因支架的形貌不同造成的緩釋誤差。圖4是根據(jù)式(2)計算出的3種支架的藥物累計緩釋率，圖4(a)為純藥物支架中取出的3個平行支架的累計藥物釋藥率，圖4(b)為含有3%藥物量微球的平行支架累計藥物釋藥率，圖4(c)為含有6%藥物量微球的平行支架累計藥物釋藥率。通過圖4可以看出，平行支架間的累積釋藥率趨勢基本相同。由于支架結(jié)構(gòu)相同，內(nèi)部的材料分布情況不同，支架降解、脹大后造成的傳質(zhì)通道不同，藥物釋放量在后期存在一定的差異，但平行組誤差都在1%～2%之間，誤差較小，經(jīng)統(tǒng)計學計算其中(a)、(b)、(c)三組數(shù)據(jù)均為P>0.05同組間差異性不顯著，保證了試驗的可重復性。因此通過3D打印的方法制備載藥支架可以穩(wěn)定控制支架中的藥物含量和支架的藥物釋放量，一定程度上減少了相同支架的藥物釋放誤差。

微球通過球壁的傳質(zhì)通道并利用內(nèi)外藥物濃度梯度減緩藥物釋放，因此可以通過改變微球含量達到減緩支架藥物釋放速率目的[16]。對3組支架的平行樣求均值后數(shù)據(jù)如圖4(d)所示。1～3 d左右3種支架的藥物釋放量基本相同，在3 d后搭載微球的支架釋放速率明顯慢于純藥物支架，并且微球的含量越多，緩釋速率越緩慢，6%微球支架相比于純藥物支架釋藥降低了2.27%，由于其釋藥趨勢基本相同，因此推斷微球支架可以延長載藥時間2.27%，經(jīng)統(tǒng)計學計算3組支架間的P<0.01，不同組間差異性極其顯著，可以說明微球?qū)χЪ茚屗幮阅茉斐闪烁拘愿淖儯哂薪y(tǒng)計學意義。支架的藥物釋放率和釋放模式是由藥物擴散以及支架的降解共同決定的[17]。異煙肼為親水性藥物，前期支架表面的藥物會大量釋放溶解。后期由于支架中PVA與HA的交聯(lián)致密，結(jié)晶程度高，對內(nèi)部藥物釋放起到一定的阻礙作用，阻擋了液體在支架內(nèi)的流動與交換，在支架降解、溶脹時傳質(zhì)通道擴大，藥物才能大量釋放到支架外；同時基于微球的釋藥機理，將支架部分藥物轉(zhuǎn)化為微球內(nèi)藥物同樣減緩了藥物的釋放[12]。微球以及支架本身的共同影響造成了微球支架釋藥慢的現(xiàn)象。

圖4 載藥支架累積釋藥率Fig.4 Scaffolds cumulative release rate

2.2 載藥骨支架體外降解分析

HA作為磷酸鈣鹽類自然礦化物，其降解主要是溶解、水解、沉淀和相變共同作用的結(jié)果[18]。體外緩釋主要是水解的方式，由于HA、PVA是難以降解的材料，因此水解作用中體降解速度大于面降解速度，滲水的速率大于水解的速率，使支架的表面降解速度大于內(nèi)部的降解速度[19-20]。由于支架材料攪拌過程中并不能保證材料均勻分布，因此在降解時會造成一定誤差，每次取樣從每組支架中取出3個作為平行樣，經(jīng)過統(tǒng)計學分析得平行樣間P>0.05，同組間差異性不顯著，保證了平行支架的可重復性；對不同實驗組間重量進行統(tǒng)計學分析得0.01

表1 載藥支架12周降解率Tab.1 Degradation rate of drug-loadedscaffolds at 12 weeks

圖5 載藥支架質(zhì)量變化曲線Fig.5 Curve of mass change of drug-loading scaffolds

2.3 載藥骨支架力學強度分析

如表2所示，純藥物支架的最大抗壓強度為7.572 MPa，而加入SF微球支架的最大抗壓強度分別只有7.244 MPa和7.182 MPa，結(jié)合圖6所示的應力-應變曲線圖，可以看出彈性模量也隨微球含量的增加降低，支架的力學性能出現(xiàn)了一定的降低。可能由于微球由SF構(gòu)成，力學強度低且分子空間體積較大，從而使支架內(nèi)部孔隙率增加，降低了支架的彈性模量，使支架在同等受力情況下應變擴大[21]。

表2 載藥支架壓縮性能Tab.2 Compression performance of drug-loaded scaffolds

圖6 載藥支架應力-應變曲線Fig.6 Stress-strain of drug-loaded scaffolds

3 結(jié)論

本文采用擠出沉積式3D打印技術(shù)，選取生物性能較好的HA、SF以及PVA作為支架主體材料，在控制總藥量的基礎上，制備了純異煙肼藥物支架、3%載藥微球支架和6%載藥微球支架。通過緩釋、降解和力學實驗可以得出，SF微球的加入可以減緩支架的釋藥速率，增加HA支架的降解速率，并在一定程度上降低支架的力學性能。因此，在使用微球的同時需要注意微球?qū)χЪ芰W性能的影響，使微球支架力學性能控制在許用范圍之內(nèi)。通過SF微球改變異煙肼載藥支架的釋藥速率，有利于降低異煙肼藥物的毒副作用，對載藥微球骨支架的制備以及應用具有一定的借鑒意義，使支架降解速度與骨生長速度相匹配，更好地促進骨骼生長，治療骨結(jié)核等骨缺損性疾病。下一步，需要對支架中的形貌以及降解后支架內(nèi)部微球形貌進行分析，深度揭示微球?qū)χЪ艿挠绊憴C理。