GZAS20200701 分離毒株gp85 基因克隆與序列分析

馬燕 溫貴蘭* 陳廣 張喜懿 張小波 鞏雪竹 韋秒粘 王興明

（1，貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院 550025；2，貴州省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心 550025）

禽白血病（Avian leukosis，AL）是由禽白血病/肉瘤病毒群的禽白血病病毒（Avian leukosis virus，ALV）引起的雞良性或惡性腫瘤性疾病，自然條件下以淋巴白血病最為常見，其他如成紅細(xì)胞白血病、成髓細(xì)胞白血病、髓細(xì)胞瘤等出現(xiàn)的頻率很低。ALV 按照其囊膜糖蛋白抗原差異和病毒干擾試驗(yàn)等被分為A～K 等11 個(gè)亞群[1]。其中A～D 亞群的病毒屬于外源性病毒，E 亞群為內(nèi)源性病毒，不具有感染性，而J 亞群的致病性和感染力較強(qiáng)。ALV 有垂直傳播和水平傳播兩種傳播方式，可使雞群感染，發(fā)生免疫抑制，使雞的生長速度受到影響，亦或發(fā)生死亡。蛋雞患感染后其產(chǎn)蛋性能受到嚴(yán)重影響，同時(shí)會(huì)繼發(fā)感染其他的病毒病和細(xì)菌病，給養(yǎng)殖業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失[2]。20 世紀(jì)90 年代初，英國學(xué)者初次從肉雞體內(nèi)分離到一種新型的禽白血病病毒J 亞群，J 亞群對(duì)雞群有很高的致病性，相對(duì)于其他亞群，其傳染性最強(qiáng)，世界各地均有本病存在[3]。在20世紀(jì)90 年代末，我國第一次在肉雞中發(fā)現(xiàn)了ALV-J，而后隨著人類生活水平的提高和需求擴(kuò)大，病毒的宿主范圍也因此逐漸擴(kuò)大，在一些商品化蛋雞和地方品種雞中都有分離到該病毒，在野鳥體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)過該病毒[4]。ALV-J 基因組主要含有g(shù)ag、pol 和env 3 個(gè)基因，其中g(shù)ag 和pol 基因都十分保守，而包括gp85 在內(nèi)的env 基因則有很大的變異，很大原因是受env基因編碼的表面囊膜蛋白gp85 干擾，gp85 是識(shí)別靶細(xì)胞膜上的特異性病毒受體，是禽白血病病毒抗原的主要成分，有高度可變性，其抗原性能決定病毒的亞群特異性[5]。高腳雞是貴州省的特色地方品種，1982 年以“高腳雞”命名載入《貴州省畜禽品種志》，2006 年載入《中國畜禽資源名錄》，高腳雞由于生態(tài)分布范圍窄，生態(tài)環(huán)境脆弱，生長遲緩，產(chǎn)蛋量和繁殖率低，沒有引起養(yǎng)殖戶的高度重視，目前正面臨消失。本研究通過PCR 技術(shù)、同源性分析和系統(tǒng)進(jìn)化樹分析等方法對(duì)高腳雞的ALV-J-gp85 基因序列進(jìn)行分析，為高腳雞養(yǎng)殖場提供一定的防控和凈化禽白血病的技術(shù)支撐和數(shù)據(jù)參考，使高腳雞得到更好的保存與發(fā)展。

1 材料

1.1 試驗(yàn)樣品

貴州省某養(yǎng)殖場26 只送檢高腳雞的血清樣品。

1.2 主要試劑

RNA 提取試劑盒，購自世紀(jì)元亨公司；2×Es Taq DNA 聚合酶，購自康為世紀(jì)有限公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒、DL 2000 DNA Marker，均購自寶生物工程(大連) 有限公司。

1.3 引物設(shè)計(jì)

參考文獻(xiàn)合成ALV-A、ALV-B 和ALV-J[6]三重PCR 引物，根據(jù)GenBank 公布的ALV-J 原型毒株HPRS103 基因序列（GenBank 登錄號(hào)：Z36973)，采用Primer Premier 5.0 軟件設(shè)計(jì)了一對(duì)J 亞型禽白血病病毒gp85 特異性檢測(cè)引物。引物序列如表1 所示。

表1 引物序列信息

2 方法

2.1 ALV p27 抗原ELISA 檢測(cè)

使用北京維德維康生物技術(shù)有限公司的禽白血病病毒抗原檢測(cè)試劑盒（ALV Antigen Test Kit）對(duì)采集的26 份高腳雞血樣進(jìn)行檢測(cè)。計(jì)算公式如下：

2.2 RNA 提取與反轉(zhuǎn)錄

根據(jù)說明書在無菌、干凈的條件下提取樣品中的病毒總RNA，然后置于-70℃進(jìn)行保存，備用。以提取的總RNA 為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，反轉(zhuǎn)錄體系如表2。

表2 反轉(zhuǎn)錄體系

42℃孵育40min，85℃孵育5min，然后置于-70℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 ALV-A/B/J 亞型RT-PCR 擴(kuò)增

反應(yīng)體系：ddH2O 6μl，2×Taq MasterMix 10μl，cDNA 2.0μl，上游引物1.0μl，下游引物1.0μl，共計(jì)20.0μl。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃變性1min，57℃退火30s，72℃延伸2min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸10min，然后將PCR 產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，觀察并記錄結(jié)果。

2.4 ALV-J-gp85 基因擴(kuò)增克隆

2.4.1 ALV-J-gp85 基因PT-PCR 擴(kuò)增

將2.1 中確定的ALV-J 陽性樣品用ALV-J-gp85 引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，反應(yīng)體系：2×Taq MasterMix 25μl，ddH2O 17μl，cDNA 4.0μl，上游引物2μl，下游引物2μl，總體系50μl。反應(yīng)條件：95℃5min；95℃30s，62℃退火30s，72℃1min，共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)；72℃終延伸10min。反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

2.4.2 ALV-J-gp85 基因的克隆及測(cè)序

將2.4.1 中ALV-J-gp85 RT-PCR 反應(yīng)的產(chǎn)物經(jīng)電泳后得到的條帶進(jìn)行割膠后參照生工膠回收純化試劑盒說明書進(jìn)行膠回收。并將其連接到pMD-19T 載體上，連接體系（10.0μl）：目的片段5μl、Solution I 4.5μl、pMD-19T 0.5μl，加完體系后瞬時(shí)離心混勻，放入金屬恒溫儀16℃連接過夜。把連接好的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入DH5α 感受態(tài)細(xì)胞后挑取單個(gè)菌落置于含氨芐抗性的液體LB 培養(yǎng)基過夜培養(yǎng)，用ALV-J-gp85 引物進(jìn)行菌液PCR 擴(kuò)增。菌液PCR 反應(yīng)體系和程序同2.4.1，反應(yīng)結(jié)束后將PCR 產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測(cè)，然后將陽性重組質(zhì)粒送到生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。

2.5 ALV-J-gp85 基因序列分析

在GenBank 下載14 株ALV 各亞型毒株作為參考序列，將測(cè)序所得的ALV-J-gp85 基因序列利用DNAStar 軟件中的MegAlign 與下載的ALV 各亞型毒株的gp85 基因通過同源性和系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行比對(duì)分析，參考序列信息見表3。

表3 ALV 參考毒株信息

3 結(jié)果與分析

3.1 ALV p27 抗原ELISA 檢測(cè)結(jié)果

由公式計(jì)算出樣品平均OD450nm 值≥0.3927 時(shí)判為陽性，由此判定出26 份血清ALV p27 均為陰性，陽性率0（0/26）。其中有一份高腳雞血清OD450nm 值為0.39，選擇這份血清進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)。

3.2 RT-PCR 擴(kuò)增結(jié)果

根據(jù)RT-PCR 反應(yīng)體系與條件，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，ALV 通用引物在422bp 處出現(xiàn)特異性條帶，與預(yù)期相符合，見圖1。然后再將樣品用ALV-J-gp85 引物進(jìn)行RT-PCR 擴(kuò)增，PCR 產(chǎn)物經(jīng)過1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，樣品在931bp 左右出現(xiàn)條帶，與預(yù)期相符，見圖2。對(duì)該ALV-J-gp85 基因進(jìn)行克隆和測(cè)序，并命名為GZAS20200701。

圖1 高腳雞ALV RT-PCR 檢測(cè)結(jié)果

3.3 同源性分析

利用生物學(xué)軟件Megalign 對(duì)該序列與從GenBanK 下載的14 株ALV 毒株進(jìn)行同源性比對(duì)分析，結(jié)果如圖3 所示。其中同源性最高的為ALV-J 中的LYJ195 株，達(dá)99.5%（命名為：GZAS20200701），而與ALV-B 中的GD08 株同源性最低，為48.5%。序列與A、C、D、E、K 亞型的同源性在48.8%～50.8%之間，同源性較低。

圖3 ALV 毒株同源性分析結(jié)果

3.4 系統(tǒng)進(jìn)化樹分析

根據(jù)GenBank 發(fā)布的序列，下載其中14 株ALV 毒株與序列（命名為：GZAS20200701）構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行比對(duì)分析，結(jié)果如圖4 所示。該序列與ALV J 亞型中的LYJ15 株屬于同一分支，與LYJ195 株又同屬于另一個(gè)分支，說明該序列與LYJ15和LYJ195 毒株親緣關(guān)系較近，處于同一個(gè)分支。而與其他亞型的ALV 親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，處在2 個(gè)大的分支中關(guān)系最遠(yuǎn)的分支。

圖4 ALV 毒株遺傳進(jìn)化樹分析

4 討論與結(jié)論

我國幅員遼闊，地方雞品種豐富，高腳雞作為貴州地方品種，由于其獨(dú)有的風(fēng)味、質(zhì)量優(yōu)異、價(jià)格合理等原因深受廣大消費(fèi)者青睞，有廣闊的市場發(fā)展前景。但ALV 對(duì)養(yǎng)雞業(yè)的威脅仍然存在，且J 亞型的ALV 感染更為廣泛，我們應(yīng)做好高腳雞凈化工作，以防ALV-J 傳播范圍擴(kuò)大。未來應(yīng)加強(qiáng)對(duì)高腳雞的監(jiān)測(cè)，將樣本范圍和樣本量進(jìn)行擴(kuò)大，全面了解高腳雞感染禽白血病的狀況，做好禽白血病凈化的日常工作，將高腳雞地方品種優(yōu)越性發(fā)揮出來，使高腳雞得到更好的發(fā)展。

試驗(yàn)對(duì)26 份高腳雞血清進(jìn)行ALV p27 抗原ELISA 檢測(cè)，ELISA 中并未檢測(cè)出陽性，但檢測(cè)結(jié)果中有一份非常接近陽性，將其提取RNA 進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后用ALV-A/B/J 引物進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增出422bp 的條帶，與ALV-J 目的大小相符。說明該ALV p27抗原ELISA 檢測(cè)試劑盒與PCR 相比特異敏感性稍低。用ALV-J-gp85 引物對(duì)該樣品擴(kuò)增出大小為931bp 左右的產(chǎn)物，將其克隆并命名為GZAS20200701。將GZAS20200701 與Gen-Bank 發(fā)布的 ALV -gp85 基因序列進(jìn)行比對(duì)分析，GZAS20200701 與ALV-J 亞型的同源性為99.5%，說明本試驗(yàn)從送檢的高腳雞血清樣本中擴(kuò)增到的GZAS20200701 株屬于ALV-J。

20 世紀(jì)80 年代末期，自英國分離發(fā)現(xiàn)J 亞群禽白血病以來，該病毒在世界各地均有存在[7]。我國第一次發(fā)現(xiàn)ALV-J 是在20 世紀(jì)90 年代末，研究人員從肉雞體內(nèi)分離得到，此后在山東、寧夏等多個(gè)省發(fā)現(xiàn)此病。隨著ALV 宿主范圍逐漸變大，不止在一些商品化蛋雞和地方品種雞中發(fā)現(xiàn)該病毒，在一些野鳥體內(nèi)也發(fā)現(xiàn)了該病毒。gp85 基因在ALV-J 感染宿主細(xì)胞黏附和誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性抗體中起重要作用，gp85 作為病毒囊膜蛋白表面的主要成分，gp85 含有的病毒-受體簇決定了病毒亞群的特異性及宿主范圍，整個(gè)gp85 基因也是高度可變的。因?yàn)椴《緂p85 基因決定了病毒亞群的特異性，并編碼ALV 與受體決定因子結(jié)合形成決定簇，決定禽白血病病毒的宿主范圍，因此，通過檢測(cè)gp85 基因可以確定雞群是否感染ALV-J。Wang（2006）等 發(fā) 現(xiàn)，ALV-J gp85 基因在抗體選擇性壓力下會(huì)發(fā)生變化。ALV 是反轉(zhuǎn)錄病毒，env 基因的變異同時(shí)會(huì)導(dǎo)致ALV-J 毒株發(fā)生變異，而決定亞群特異性的gp85 序列由于存在高變區(qū)，很容易發(fā)生變異。2015年Dong 等發(fā)現(xiàn)鷓鴣小腿雞中存在ALV-J 感染，同時(shí)發(fā)現(xiàn)骨髓細(xì)胞瘤、骨髓瘤和纖維肉瘤[8]。2017 年Li 等發(fā)現(xiàn)，ALV-J 在感染個(gè)體之間會(huì)發(fā)生變化[9]。2019 年王元紅等在對(duì)一株J 亞型ALV gp85 基因序列進(jìn)行分析，同時(shí)也預(yù)示ALV 的變異一直處于緩慢的演化[10]。目前，禽白血病病毒J 亞群依然對(duì)我國及世界各地養(yǎng)禽業(yè)造成重大威脅。本試驗(yàn)為在分子水平方向深入研究ALV-J-gp85 基因奠定了一定的理論基礎(chǔ)，同時(shí)也提供一定的數(shù)據(jù)參考。