嬰幼兒配方奶粉中丁酸、己酸、辛酸、癸酸的測定方法驗證

崔承遠

北大荒完達山乳業(yè)股份有限公司，黑龍江哈爾濱 150078

0 引言

丁酸是一種短鏈飽和脂肪酸，其最大功能是供應能量，而聚集在脂細胞內形成脂肪的很少，具有參與基因調控調節(jié)免疫應答和炎癥反應，抑制腫瘤生長，促進細胞分化和凋亡的作用。己酸（俗稱羊油酸）、辛酸（俗稱羊脂酸）、癸酸（俗稱羊蠟酸）三種飽和脂肪酸具有相似的生物活性。辛酸和癸酸都具有抗病毒的生物活性。癸酸與甘油三酯生成的癸酸單酰甘油酯具有抗艾滋病毒的功能[1～3]。

奶粉中天然含有丁酸、己酸、辛酸和癸酸，雖然不屬于嬰幼兒配方奶粉中常規(guī)考核及檢測項目，但其對于嬰幼兒成長同樣起到了一定的積極作用，因此，對丁酸、己酸、辛酸和癸酸的檢測以及針對檢測方法進行方法驗證[4～7]具有必要性。

1 試劑與方法

1.1 試劑

乙酰氯（C2H3ClO）：色譜純；甲醇（CH3OH）：色譜純；甲苯（C7H8）：色譜純；無水碳酸鈉（Na2CO3）：分析純。

1.2 溶液配制

1.2.1 乙酰氯-甲醇溶液（10.00%）

向100.0 mL容量瓶內加入約40.0 mL甲醇，并將盛裝有甲醇的容量瓶置于冷水中，再吸取乙酰氯10.0 mL，并逐滴緩慢加入到容量瓶內，待溶液恢復至室溫后取出容量瓶，以甲醇定容至刻度線，混勻，此為濃度10.00%的乙酰氯-甲醇溶液。

1.2.2 碳酸鈉溶液（60 g/L）

稱取無水碳酸鈉60 g于1 000.0 mL容量瓶內，加入約600.0 mL超純水，超聲震蕩至無水碳酸鈉完全溶解，再以超純水定容至刻度線，混勻，此為濃度60 g/L的碳酸鈉溶液。

1.3 儀器設備及參數

1.3.1 儀器設備

氣相色譜儀（配置有FID氫火焰離子檢測器）；分析天平：感量0.1 mg；離心機：轉速≥5 000 r/min；38.0 mL帶有聚四氟乙烯內墊的螺紋帽試管；恒溫磁力攪拌器；渦旋振蕩器。

1.3.2 儀器參數

毛細管色譜柱：DB-23型，柱長30 m，內徑0.25 mm，膜厚0.25 μm；進樣口溫度：250 ℃；檢測器溫度：260 ℃；載氣：高純氮氣，純度99.999%，流速1.0 mL/min；分流比：20∶1；輔助氣體：氫氣45.0 mL/min，空氣450.0 mL/min；進樣體積：1 μL/min；

1.3.3 程序升溫

丁酸、己酸、辛酸和癸酸程序升溫見表1。

表1 丁酸、己酸、辛酸和癸酸程序升溫

1.4 分析步驟

1.4.1 試樣處理

稱取嬰幼兒配方奶粉試樣0.5 g（精確至0.001 g）于38.0 mL螺口玻璃管中，加入5.0 mL甲苯和6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，充氮氣后，旋緊螺紋蓋。振蕩混合后于（80±1）℃水浴中放置2 h，期間每隔20 min取出振搖1 次，水浴后取出冷卻至室溫。

將甲酯化衍生反應后的樣液轉移至50.0 mL離心管內，分別用3.0 mL碳酸鈉溶液清洗玻璃管3 次。將螺紋管內溶液全部轉移至50.0 mL離心管中，混勻。以5 000 r/min的轉速離心5 min。取出上清液作為脂肪酸測試樣液，氣相色譜儀分析測定。

1.4.2 標準溶液測試

（1）丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標準物質儲備液

分別稱取丁酸甘油三酯標準物質、己酸甘油三酯標準物質、辛酸甘油三酯標準物質和癸酸甘油三酯標準物質各100 mg于同1 支100.0 mL容量瓶中，以甲苯定容至刻度線，此為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標準物質中間液。

（2）丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標準物質工作液

吸取上述四種組分標準物質儲備液5.0 mL于38.0 mL螺口玻璃管內，加入6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，后續(xù)操作按照1.4.1中的操作步驟進行。甲酯化衍生結束后，從上清液中吸取4.0 mL于10.0 mL容量瓶內，以甲苯定容至刻度線，即為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標準物質工作液。

1.4.3 試樣溶液的測定

相同條件下，將樣品溶液和標準物質工作液分別引入氣相色譜儀進行測定。試樣中各脂肪酸含量按公式（1）進行計算。

式中：Xi為試樣中各脂肪酸的含量，單位為克每百克（g/100 g）；Ai為試樣測定液中各脂肪酸甲酯的峰面積；msi為在標準測定液的制備中吸取的脂肪酸甘油三酯標準工作液中所含有的標準品的質量，單位為毫克（mg）；FTG-FAi為各脂肪酸甘油三酯轉化為脂肪酸的換算系數；ASi為標準測定液中各脂肪酸的峰面積；m為試樣的稱樣質量，單位為毫克（mg）；100為將含量轉換為每100 g試樣中含量的系數。計算結果保留3 位有效數字。

2 結果與分析

2.1 標準物質溶液測定

分別稱取丁酸甘油三酯標準物質105.90 mg、己酸甘油三酯83.80 mg、辛酸甘油三酯82.11 mg、癸酸甘油三酯82.10 mg于同一只100.0 mL容量瓶內，以甲苯定容至刻度線，此為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標準物質儲備液。

吸取上述四種組分混合標準物質儲備液5.0 mL于38.0 mL螺口玻璃管內，加入6.0 mL 10.00%的乙酰氯-甲醇溶液，后續(xù)操作按照1.4.1中的操作步驟進行。甲酯化衍生結束后，從上清液中吸取4.0 mL于10.0 mL容量瓶內，以甲苯定容至刻度線，即為丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯、癸酸甘油三酯混合標準物質工作液。

丁酸甘油三酯、己酸甘油三酯、辛酸甘油三酯和癸酸甘油三酯標準物質儲備液、工作液濃度詳見表2。

表2 丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合標準物質儲備液、工作液濃度

將丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合標準物質工作液連續(xù)運行6 次，得到6 次運行圖譜及各組分響應值（峰面積），并分別計算每個組分響應值（峰面積）的標準偏差，如表3所示。

表3 丁酸、己酸、辛酸和癸酸混合標準物質工作液各組分響應值（峰面積）及RSD

2.2 方法檢出限與定量限

采用空白標準偏差法，選擇嬰幼兒配方奶粉樣品作為試驗對象，稱取40 份，每份0.5 g，按照1.4.1中的操作步驟對試樣進行前處理。對處理結束后的試樣樣液分別進行50.0 倍稀釋、50.0 倍稀釋、100.0倍稀釋和50.0 倍稀釋。其中50.0 倍稀釋樣液用于丁酸方法檢出限的測定、50.0 倍稀釋樣液用于己酸方法檢出限的測定、100 倍稀釋樣液用于辛酸方法檢出限的測定、50.0 倍稀釋樣液用于癸酸方法檢出限的測定。

將上述樣液分別通過氣相色譜儀進行檢測分析，得出4 種組分的樣品圖片及相關參數，進而計算出4 種組分的方法檢出限及定量限，如表4～7所示。

2.3 精密度

選擇嬰幼兒配方奶粉樣品作為試驗對象，進行10組平行試驗[8]，按照上述1.4.1中的描述進行試樣前處理和測定，得出10 組試驗結果，如表8～11所示。

表8 辛酸正確度試驗加標體積、加標質量及甲苯補充體積

2.4 正確度

結合上述精密度試驗中所得到的嬰幼兒配方奶粉試樣中4 種組分的含量數值，并以此作為本底，分別進行4 種組分的加標回收率試驗（即正確度試驗）[9]。加標原則分為低、中、高3 個濃度水平，其中低濃度水平為以本底數值的0.8 倍進行標準物質添加、中濃度水平為以本底數值的1.0 倍進行標準物質添加、高濃度水平為以本底數值的1.2 倍進行標準物質添加，每個濃度水平分別進行6 組平行試驗。各組加標回收率試驗標準物質溶液添加體積及甲苯補充體積詳見表6～27。

表6 丁酸正確度試驗加標體積、加標質量及甲苯補充體積

丁酸、己酸、辛酸、癸酸低濃度加標回收率（正確度）實驗結果如表10所示。

表10 丁酸、己酸、辛酸、癸酸低濃度加標回收率（正確度）結果

丁酸、己酸、辛酸、癸酸中濃度加標回收率（正確度）實驗結果如表11所示。

表11 丁酸、己酸、辛酸、癸酸中濃度加標回收率（正確度）結果

丁酸、己酸、辛酸、癸酸高濃度加標回收率（正確度）實驗結果如表12所示。

表 4 丁酸、己酸、辛酸、癸酸方法檢出限與定量限結果 單位：mg/100 g

表5 丁酸、己酸、辛酸、癸酸精密度試驗結果

表7 己酸正確度試驗加標體積、加標質量及甲苯補充體積

表12 丁酸、己酸、辛酸、癸酸高濃度加標回收率（正確度）結果

3 結論

經方法檢出限、精密度和正確度方法特性參數的驗證，得出丁酸方法檢出限為0.608 mg/100 g，方法定量限為1.820 mg/100 g；己酸方法檢出限為0.276 mg/100 g，方法定量限為0.827 mg/100 g；辛酸方法檢出限為0.323 mg/100 g，方法定量限為0.969 mg/100 g；癸酸方法檢出限為0.801 mg/100 g，方法定量限為2.400 mg/100 g。對比《GB 5009.168—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中各組分定量限數值，丁酸3.300 mg/100 g、己酸3.300 mg/100 g、辛酸3.300 mg/100 g、癸酸3.300 mg/100 g。本次試驗4 種組分方法定量限數值均低于標準中所給數值，符合要求。丁酸方法精密度為1.95%，己酸方法精密度為1.87%，辛酸方法精密度為1.67%，癸酸方法精密度為1.58%，均滿足《GB 5009.168—2016 食品安全國家標準 食品中脂肪酸的測定》中對于精密度不大于10.00%的要求；丁酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標回收率在95.70%～105.00%范圍內，己酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標回收率在95.90%～104.00%范圍內，辛酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標回收率在95.50%～104.00%范圍內，癸酸3水平6平行共計18 組正確度試驗加標回收率在95.10%～104.00%范圍內，均滿足《GB/T 27417—2017 合格評定 化學分析方法確認和驗證指南附錄A》的要求[10]。

表9 癸酸正確度試驗加標體積、加標質量及甲苯補充體積