抗核抗體及抗中性粒細胞胞漿抗體與膽道閉鎖嚴重程度和預(yù)后的相關(guān)性研究

李軻鑫 劉立偉 李敏 王昱 馬子坤 郭甜甜 孫麗瑩 朱志軍 賈繼東 趙新顏

膽道閉鎖(Biliary atresia，BA)是一種致命性的新生兒纖維炎性膽管破壞性疾病[1, 2]，它是新生兒膽汁淤積性肝病的最主要原因，是兒童肝硬化及肝源性死亡的首要原因[3]，同時也是兒童肝移植的最主要適應(yīng)證[4- 5]。其病因尚未明確，發(fā)病率為1/3 000～20 000，且在亞洲地區(qū)更為常見[3, 6-7]。及時行葛西手術(shù)(Kasai procedure，KP)可顯著改善BA預(yù)后延長患兒生存期[8- 9]，但仍有50%～80%的患兒最終需要行肝移植手術(shù)以挽救生命[1, 9, 10]。

近年來的研究表明，體液免疫尤其是自身免疫失調(diào)在BA中發(fā)揮了重要作用[11-17]，但關(guān)于BA患兒血漿中自身抗體的報道較少或結(jié)果不一致?？购丝贵w(Antinuclear antibodies，ANA)及抗中性粒細胞胞漿抗體(Antineutrophil cytoplasmic antibody，ANCA)作為臨床實踐中常見的自身抗體譜可見于多種自身免疫性肝病，但國內(nèi)尚未系統(tǒng)研究ANA和ANCA在BA中的表達情況及其臨床意義。本研究檢測BA患兒血漿中ANA和ANCA 的表達情況，并分析二者與肝移植術(shù)前實驗室檢查、嚴重程度、肝臟病理組織學(xué)表現(xiàn)及術(shù)后并發(fā)癥的相關(guān)性，旨在為自身抗體在BA中的預(yù)后價值提供實驗依據(jù)。

資料與方法

一、研究人群

選取2017年4月至2020年10月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院行肝移植手術(shù)的BA患兒。納入標準：(1)術(shù)中膽道造影確診BA；術(shù)后病肝病理學(xué)檢查符合BA；(2)外周血和肝組織樣本保存于樣本庫中可以獲取。排除標準：(1)病理診斷不符合BA的其他膽汁淤積性肝病(如進行性家族膽汁淤積性肝病、Alagille綜合征等)；(2)患兒或其母親患自身免疫性疾病者(如自身免疫性肝炎、潰瘍性結(jié)腸炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、干燥綜合征、血管炎等)；(3)二次肝移植者。本研究方案已通過首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院倫理委員會批準(批件號：2020-P2-226-01)。

二、研究方法

(一)收集患兒術(shù)前基礎(chǔ)資料 收集入組患兒的人口學(xué)及臨床資料，肝移植術(shù)前血常規(guī)、肝功能生化及凝血功能指標，計算Child-Pugh評分及兒童終末期肝病模型評分(Pediatric End-stage Liver Disease score，PELD)[18]。

(二)ANCA和ANA檢測 通過酶聯(lián)免疫吸附法檢測術(shù)前血漿中的抗核抗體譜IgG(歐蒙，中國，EA 1590-9601-8G)，包含以下抗原：dsDNA、組蛋白、核糖體P蛋白、nRNP、Sm、SS-A、SS-B、Scl-70、Jo-1和著絲點。血漿樣本進行1∶201稀釋，ANA比值=樣本吸光度值/校準品吸光度值，比值≥1.0為陽性，<1.0為陰性。

通過間接免疫熒光法定性檢測抗中性粒細胞胞漿抗體IgG(歐蒙，中國，F(xiàn)A 1201-1010-13)。血漿樣本進行1∶10稀釋，ANCA陽性定義為抗體滴度≥1∶10，并根據(jù)熒光特征分為胞漿型(cANCA)和核周型(pANCA)。

(三)病理組織染色及評分 將肝移植術(shù)中切除部分病肝組織固定、包埋，制備石蠟切片，行HE、Masson、網(wǎng)織、銅、鐵染色。根據(jù)標準化評分系統(tǒng)對BA患兒的匯管區(qū)炎癥、肝纖維化、細膽管膽栓及肝細胞淤膽進行病理組織學(xué)評分[19-20]。

(四)肝移植術(shù)后隨訪 通過醫(yī)院管理系統(tǒng)(HIS系統(tǒng))進行肝移植的術(shù)后隨訪：(1)術(shù)后第1周、第2周及第4周的ALT和總膽紅素(Total bilirubin，TBil)的動態(tài)變化；(2)術(shù)后巨細胞病毒(Cytomegalovirus，CMV)、EB病毒(Epstein Barr virus，EBV)感染，膽道和血管并發(fā)癥，排斥反應(yīng)，肝相關(guān)死亡等事件的發(fā)生情況。隨訪時間定義為肝移植手術(shù)至隨訪1年或死亡的時間。

三、統(tǒng)計學(xué)分析

所有數(shù)據(jù)均采用IBM SPSS Statistics Version 24.0軟件進行分析。正態(tài)分布的計量資料用均數(shù)±標準差表示，非正態(tài)分布則用中位數(shù)及四分位數(shù)表示，組間比較采用Mann-WhitneyU檢驗或Kruskal-Wallis檢驗；計數(shù)資料以頻數(shù)和百分比表示，組間比較采用χ2檢驗。相關(guān)性分析中，雙變量正態(tài)分布計算Pearson積矩相關(guān)系數(shù)，否則計算Spearman秩相關(guān)系數(shù)。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、BA患兒的人口學(xué)特征及臨床資料

根據(jù)入排標準，本研究共納入2017年4月至2020年10月于首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院行肝移植手術(shù)的BA患兒98例，包括未行葛西手術(shù)者30例，葛西術(shù)后行肝移植術(shù)者68例。入組患兒中，男性52例(53.0%)，女性46例(46.9%)，中位月齡為9.0月。ALT中位水平198.5(91.3, 434.5)U/L, AST中位水平332.4(139.7, 582.4)U/L，TBil中位水平137.9(38.9, 341.4)μmol/L，總膽汁酸(TBA)中位水平134.2(73.2, 244.2)μmol/L。肝移植術(shù)前Child-Pugh評分和PELD評分中位值分別為6.3(8.0, 10.0)和13.0(1.0, 23.8)。肝硬化(S4期)患兒所占比例較高，達71.4%(70/98)。見表1。

表1 三組BA患兒的人口學(xué)特征及臨床資料比較

續(xù)表1

二、肝移植術(shù)后隨訪結(jié)果

與術(shù)前相比，肝移植術(shù)后第1周、第2周、第4周ALT和TBil水平顯著下降(ALT：198.5 vs 150.5 vs 38.0 vs 28.5 U/L，P<0.001；TBil：137.9 vs 33.2 vs 17.7 vs 10.3 μmol/L,P<0.001)。術(shù)后非嗜肝性病毒感染率較高，其中CMV感染率為36.7%(36/98)，EBV感染率為61.2%(60/98)。出現(xiàn)膽道、血管并發(fā)癥，排斥反應(yīng)，肝相關(guān)死亡事件分別為4例(4.1%)、6例(6.1%)、6例(6.1%)、2例(2.0%)。

三、ANA半定量比值與術(shù)前嚴重程度、病理組織學(xué)評分及術(shù)后CMV感染的相關(guān)性

90例患兒檢測了血漿抗核抗體，3例(3.3%)ANA陽性，未行葛西手術(shù)者2例，葛西術(shù)后者1例。ANA半定量比值與術(shù)前嚴重程度的相關(guān)性分析顯示，ANA半定量比值與Child-Pugh評分和PELD評分均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.257(P=0.016，圖1A)和0.230(P=0.031，圖1B)，但相關(guān)程度較弱。而且在葛西術(shù)后的BA患兒中，ANA半定量比值隨葛西術(shù)后自體肝生存時間的延長而降低(P=0.011，R=-0.326，圖1C)。病理組織學(xué)評價中，ANA比值在BA肝硬化(S4期)患兒中顯著升高(P=0.016，表2)；存在膽汁淤積的患兒ANA比值更高，且隨著細膽管膽栓程度的加重而升高(P=0.040，表2)，肝細胞淤膽≥2分的患兒ANA半定量比值有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義；匯管區(qū)炎癥程度與ANA半定量比值無顯著差異。肝移植術(shù)后發(fā)生CMV感染的患兒ANA半定量比值較未發(fā)生者顯著升高(P=0.034，表2)。EBV感染者ANA比值有升高趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義。ANA半定量比值與術(shù)后排異反應(yīng)、ALT和TBil的動態(tài)變化及生存情況未見顯著相關(guān)性。

注：肝功能儲備分級(Child-Pugh評分，圖A)、兒童終末期肝病模型(PELD)評分(圖B)均與ANA比值呈正相關(guān)；在葛西術(shù)后的BA患兒中，ANA半定量比值隨葛西術(shù)后自體肝生存時間的延長而降低(圖C)。ANA：抗核抗體；KP：葛西手術(shù)；葛西術(shù)后自體肝生存時間：葛西手術(shù)距肝移植的時間(月)。

表2 ANA半定量比值與不同病理組織學(xué)評分及術(shù)后有無CMV感染的比較

四、ANCA陽性患兒Alb、CHE水平顯著降低

BA患兒中有10.2%(10/98)為ANCA陽性，其中1例為cANCA 1∶10陽性，9例為pANCA陽性，1∶10、1∶32、1∶100陽性各3例。

比較ANCA陽性與陰性患兒的術(shù)前實驗室檢查發(fā)現(xiàn)，ANCA陽性患兒術(shù)前的白蛋白(Alb)、膽堿酯酶(CHE)水平顯著低于ANCA陰性者(Alb: 30.4 vs 34.3 g/L,P=0.018; CHE: 2.6 vs 3.9 KU/L,P=0.009，表1)，提示ANCA陽性患兒的肝臟合成功能受損更為嚴重；術(shù)后第1、2、4周TBil逐漸下降，且同一時間段內(nèi)ANCA陽性者的TBil更低(34.2 vs 25.9，18.2 vs 15.2，11.0 vs 6.7 μmol/L，表1)，復(fù)常率更高。ANCA陽性患兒術(shù)前病理組織學(xué)評分、嚴重程度評分及術(shù)后非嗜肝性病毒感染、血管并發(fā)癥、膽管并發(fā)癥等均與ANCA陰性患兒間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。

討 論

本研究中BA患者肝移植術(shù)前ANA陽性率為3.3%，低于既往研究報道的葛西術(shù)前ANA陽性率11.3%[17]。其半定量比值與反映疾病嚴重程度的Child-Pugh評分和PELD評分呈正相關(guān)(盡管相關(guān)程度弱)。在我們的前期研究中發(fā)現(xiàn)，葛西手術(shù)可改善BA患兒的肝臟病理[21]，而本研究中葛西術(shù)后患兒的ANA比值低于未行葛西患兒(0.22 vs 0.26，P=0.087)，且ANA比值在有肝硬化的患兒中顯著升高，并隨著膽汁淤積程度的加重而升高，提示ANA比值與BA的病理特征具有一定相關(guān)性。

肝移植術(shù)前ANCA陽性率(10.2%)同樣低于先前報道的葛西術(shù)前ANCA陽性率(29.0%)[17]。肝功能生化指標中，已報道有3種IgM自身抗體水平與TBil和AST正相關(guān)[12]，而我們發(fā)現(xiàn)，ANCA陽性患兒肝移植術(shù)前的Alb、CHE水平更低，肝臟的合成功能更差；但術(shù)后第1、2、4周ANCA陽性者的TBil水平更低，復(fù)常率更高，其機制尚待進一步研究。

在術(shù)后并發(fā)癥方面，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)ANCA陽性與葛西術(shù)后膽管炎發(fā)生率呈正相關(guān)[17]，與CMV感染無關(guān)。而本研究中，肝移植后發(fā)生CMV感染的患兒ANA比值顯著升高，但與術(shù)后膽道、血管并發(fā)癥，排異反應(yīng)，肝相關(guān)死亡事件無顯著相關(guān)性。

既往研究表明，體液免疫在BA的發(fā)病過程中有至關(guān)重要的作用，且BA患兒中存在不同程度自身抗體陽性。輪狀病毒感染的BA小鼠模型若缺乏用于抗體產(chǎn)生和抗原呈遞的Ig-α(B細胞受體的組成部分)則不能引起B(yǎng)A，提示B細胞在介導(dǎo)BA的發(fā)病過程中起重要作用[14-15]。而且在BA患兒出生后的前幾個月內(nèi)，其肝臟中的B細胞淋巴細胞增殖持續(xù)存在，致病性IgG抗體明顯增加，而B細胞修飾療法可以改善BA小鼠的肝臟病理[11]。這提示B細胞是BA發(fā)病過程中必不可少的。以下發(fā)現(xiàn)更是提供了BA中存在自身抗體的直接證據(jù)：BA患兒中發(fā)現(xiàn)了沿肝外膽管上皮基底膜沉積的IgM或IgG[16]、血清中可檢測到自身免疫性肝病相關(guān)的自身抗體[17]以及動物模型中發(fā)現(xiàn)的抗α-烯醇酶(膽管上皮抗原)自身抗體[13]。

本研究發(fā)現(xiàn)，BA患兒血漿中的ANA及ANCA與疾病的嚴重程度和預(yù)后具有相關(guān)性，并首次發(fā)現(xiàn)ANA半定量比值與BA病理特征中肝硬化(S4期)和膽汁淤積程度相關(guān)。目前BA的確診依賴于術(shù)中膽管造影和肝活檢等侵入性診斷方法[11, 22]，自身抗體能否作為新的特異性標志物用于BA的無創(chuàng)診斷，尚有待展開進一步的研究。本研究為單中心回顧性研究，入組患兒處于疾病終末期，病情較重，不能完全代表疾病早期及BA的普遍情況。