抗阻訓練改善骨骼肌衰老的關(guān)鍵基因與信號通路鑒定

夏 志 ，趙 艷 ，丁孝民 ，尚畫雨 ，蘇全生 ，王前進 *

人類機體從40歲開始衰老，隨著年齡增長逐漸加?。╕amada，2018）。衰老與骨骼肌萎縮、衰弱和功能障礙等表型密切相關(guān)，衰老性肌萎縮（age-related sarcopenia）可累及高達33.6%的老齡人群（Dalle et al.，2017）。骨骼肌衰老的病原學因素較為復雜。隨著衰老進程的發(fā)展，許多常見的生理過程如凋亡、氧化應激、蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、炎癥、激素失調(diào)及線粒體功能障礙等逐漸與骨骼肌的退行性變化發(fā)生潛在關(guān)聯(lián)（Yoo et al.，2018）。研究表明，機體衰老的轉(zhuǎn)錄組標記可用于評估衰老性肌萎縮與癌性惡病質(zhì)的臨床干預效果（Ebhardt et al.，2017）。這一方法已被用于探討熱量限制對小鼠骨骼肌的有益促進（Lee et al.，1999）。

目前，臨床對衰老性肌萎縮的治療仍無公認標準與指引。如ACSM與AMA倡導的“Exercise is medicine”理念所言，運動帶來的健康收益極為顯著。現(xiàn)實中，運動亦常作為二級預防手段用于多種慢病干預（Stoutenberg et al.，2018）。有研究甚至將運動稱作“Polypill”，視為對抗與機體衰老相關(guān)的9個細胞與分子標志（基因組不穩(wěn)定性、端粒消減、表觀遺傳性改變、蛋白質(zhì)穩(wěn)態(tài)失衡、營養(yǎng)素感應失調(diào)、線粒體功能紊亂、細胞衰老、干細胞耗竭及細胞間信息交換的改變）的關(guān)鍵手段（Rebelo-Marques et al.，2018），抗阻運動被認為在防治衰老性骨骼肌萎縮的發(fā)生與發(fā)展方面具有重要作用。自Rosenberg于1989年定義衰老性肌萎縮至今，學界就抗阻運動對肌肉質(zhì)量、力量與功能等衰老骨骼肌表型的影響開展了大量有益探討，抗阻訓練對衰老骨骼肌的健康收益業(yè)已得到公認。數(shù)據(jù)顯示，抗阻訓練可使衰老骨骼肌體積增長高達21%，肌力增幅可達90%（Borde et al.，2015）。但是除骨骼肌表型之外，抗阻運動究竟能否改變健康老年人基因表達譜的衰老性變化，迄今仍未定論。有研究提示，運動可使衰老心肌組織轉(zhuǎn)錄組譜呈現(xiàn)年輕化特征（Bronikowski et al.，2003），逆轉(zhuǎn)肌球蛋白重鏈mRNA豐度的一些退行性改變（Raue et al.，2012）。此類研究多集中探索抗阻運動對單一靶蛋白或信號轉(zhuǎn)導通路的影響，究竟是何種關(guān)鍵基因通過何種信號轉(zhuǎn)導通路在抗阻運動改善衰老骨骼肌表型過程中發(fā)揮關(guān)鍵作用，亦不清楚。可見，在探討衰老骨骼肌表型變化的基礎上，進一步豐富包括全基因組轉(zhuǎn)錄組在內(nèi)的數(shù)據(jù)，厘清基因表達譜響應抗阻運動刺激發(fā)生的適應性變化，有助于更加系統(tǒng)地闡明抗阻運動改善骨骼肌衰老的分子機制，為骨骼肌衰老的臨床防治提供更多研發(fā)靶點。需要指出的是，采用基因芯片進行的獨立研究往往存在甄別閾值低、樣本量受限和主觀偏倚明顯等問題，導致篩選出的差異基因數(shù)量龐大，假陽性風險與錯誤發(fā)現(xiàn)率相應升高，亟待采用更科學、嚴謹?shù)难芯糠妒綄η叭说募扔袛?shù)據(jù)進行整合與深入挖掘，從而使研究結(jié)果與結(jié)論更穩(wěn)健。

鑒于此，本研究擬采用生物信息學研究范式，對前人研究中的基因表達譜數(shù)據(jù)進行系統(tǒng)挖掘。首先，比較衰老機體與青年的骨骼肌基因表達譜差異，對初始數(shù)據(jù)進行質(zhì)量控制。其次，分析衰老骨骼肌響應長期抗阻訓練干預發(fā)生的適應性基因表達譜變化。最后，通過生物信息學分析工具篩選出發(fā)揮重要作用的關(guān)鍵基因（hub genes）與信號轉(zhuǎn)導通路，以明確長期抗阻訓練對衰老骨骼肌基因表達譜和生物代謝過程的影響及重要作用靶點。

1 材料和方法

1.1 微陣列基因表達數(shù)據(jù)

DNA微陣列是一種能夠分析基因組和基因表達特征圖譜的新型工具。目前，已開發(fā)出多種商業(yè)化DNA微陣列和DNA芯片用于基因組研究。DNA微陣列分析包括寡核苷酸芯片、cDNA芯片和基因組芯片等，其分為兩種模式：一種是將目的基因固定于支持物上，適于分析大量、不同的目的基因；另一種是將大量探針固定于支持物上，適于對相同目的基因進行不同探針序列的分析（Mar‐zancola et al.，2016）。

本研究采用關(guān)鍵詞“skeletal muscle”“aging”和“resis‐tance exercise”在GEO數(shù)據(jù)集數(shù)據(jù)庫進行組合檢索，限定人類種屬，檢出微陣列數(shù)據(jù)集25套。篩除與本研究需求不符及樣本量過?。╪＜7）和/或缺失值過多的低質(zhì)量數(shù)據(jù)集后，納入3套數(shù)據(jù)集進行分析，分別為GSE 25941（GDS 5216）（Raue et al.，2012）、GSE 38718（Liu et al.，2013）和 GSE 8479（Melov et al.，2007）。GSE 25941 和GSE 38718數(shù)據(jù)集均基于GPL 570平臺構(gòu)建（表1）。GSE 25941數(shù)據(jù)集含36名被試，其中青年對照被試15名［（25±3）歲］：男性7名，女性8名；老年被試21名［（78±6）歲］：男性10名，女性11名。GSE 38718數(shù)據(jù)集含22名被試，其中青年對照被試14名（19～28）歲：男、女各7名；老年被試8名（65～76歲）；男、女各4名。GSE 8479數(shù)據(jù)集基于GPL 2700平臺構(gòu)建（Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip），含14名老年被試（65～79歲），其中男性6名，女性8名，接受為期26周的抗阻訓練：每周訓練2次（周一與周四，或周二與周五），訓練內(nèi)容包括腿舉、臥推、坐姿腿屈伸、俯臥腿屈伸、肩上推舉、坐姿高位下拉、提踵、卷腹和坐姿背伸展等，每個動作完成3組，每組10次重復。訓練采用遞增負荷運動方式，初始負荷為50%1RM，每2周重新測定1RM值，訓練期結(jié)束時負荷增至80%1RM。

表1 本研究采用的GEO微陣列數(shù)據(jù)集信息Table 1 Details for GEO Microarray Datasets

1.2 數(shù)據(jù)預處理

下載平臺注釋文件和預處理過的基因表達矩陣文件（series matrix），分離出各樣本的基因表達（Matrix_Ta‐ble_Begin～Matrix_Table_End）并保存為txt文件。將平臺注釋文件作為背景文件，轉(zhuǎn)換數(shù)據(jù)使各數(shù)據(jù)集探針名ID為對應基因的國際標準名（gene symbol），應用R包對下載文件進行背景校正、中位數(shù)標準化和Log2轉(zhuǎn)換。由于GSE 8479數(shù)據(jù)集只選擇滿足本研究設計需求的老年被試，因此預處理時下載原始數(shù)據(jù)后剔除冗余數(shù)據(jù)，采用RMAExpress軟件對芯片原始數(shù)據(jù)進行背景校正與中位數(shù)標準化，形成基因表達矩陣文件再進行后續(xù)分析。

1.3 差異表達基因篩選

本研究進行兩重比較：靜息衰老與靜息青年被試骨骼肌基因表達譜；衰老被試接受抗阻訓練干預前后。

基因差異表達采用R語言Bioconductor系列包中的Limma包進行分析。在R中輸入操作命令代碼后通過Limma包對數(shù)據(jù)集中的靜息青年對照和靜息衰老被試，以及靜息衰老被試與訓練干預衰老被試的差異表達基因（differentially expressed genes，DEGs）進行分析，滿足|LogFC|＞1.5和P＜0.05條件的基因被視為DEGs（FC為Fold Change）。對各數(shù)據(jù)集篩選出的DEGs進行層次聚類，采用歐式距離計算法度量樣本相似性。

1.4 微陣列數(shù)據(jù)整合分析

鑒于獨立研究存在的潛在偏倚與不足，本研究采用重疊分析法（overlapping analysis）對兩重比較獲得的全部DEGs進行整合分析并繪制韋恩圖，篩選出在3套微陣列數(shù)據(jù)集中均差異顯著的基因用于后續(xù)分析。

1.5 差異表達基因的GO功能注釋和KEGG通路富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫在線分析工具和KOBAS在線分析數(shù)據(jù)庫對候選基因進行富集分析（Sherman et al.，2007），顯著性水平置于0.05。DEGs的KEGG通路分析采用KO‐BAS與Revigo數(shù)據(jù)庫進行聯(lián)合處理，當P值與校正P值均小于0.05時視為顯著性富集通路，富集通路后采用Cyto‐scape軟件進行可視化。

1.6 差異基因編碼蛋白的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)互作分析

采用STRING網(wǎng)絡分析數(shù)據(jù)庫鑒定蛋白質(zhì)之間的互作關(guān)系（protein-protein interaction，PPI）?；プ鹘Y(jié)果來源于實驗數(shù)據(jù)、數(shù)據(jù)庫、文本挖掘和生物信息學預測等（Von Mering et al.，2003）。將STRING分析結(jié)果導入Cytoscape進行可視化，每個節(jié)點代表一個蛋白，節(jié)點間的連線反映蛋白之間的交互，用于鑒定DEGs編碼蛋白間的互作與通路。采用3種數(shù)據(jù)挖掘方法共同鑒定關(guān)鍵基因：首先，在STRING分析結(jié)果中通過節(jié)點計數(shù)進行篩選，將計數(shù)10以上的節(jié)點納入篩選范圍；其次，采用Cytoscape的MCODE App對構(gòu)建的整個網(wǎng)絡進行模塊挖掘，篩選得分最高的模塊及相應蛋白；最后，采用CytoHubba App對STRING分析結(jié)果按照節(jié)點度（degree）進行排序，篩選出前10位節(jié)點。將3種分析與挖掘的結(jié)果進行比對，結(jié)合PPI交互網(wǎng)絡確定功能最集中的蛋白并采用BinGo App進行二次富集分析。此聯(lián)合鑒定方法可有效規(guī)避單一篩選存在的潛在偏倚與假陽性風險。

2 研究結(jié)果

2.1 微陣列數(shù)據(jù)信息與差異表達基因篩選

對本研究3套數(shù)據(jù)集中的骨骼肌基因表達譜數(shù)據(jù)經(jīng)中位數(shù)標準化處理后，采用R語言的Limma包對標準化數(shù)據(jù)進行基因篩選，在GSE 25941數(shù)據(jù)集中篩選出1 291個DEGs（圖1A），在GSE 38718數(shù)據(jù)集篩選出581個DEGs（圖1B），在GSE 8479數(shù)據(jù)集篩選出60個DEGs（圖1C）。

圖1 GSE 25941（A）、GSE 38718（B）和GSE 8479（C）數(shù)據(jù)集差異表達基因數(shù)據(jù)火山圖Figure 1. Differential Expression of Data between Two Sets of Samples in GSE25941（A），GSE38718（B）and GSE8479（C）Datasets

2.2 差異表達基因整合分析結(jié)果

本研究采用重疊分析法對3套微陣列數(shù)據(jù)集進行分析（圖2），篩選出共同表達的差異基因共計60個（表2）。差異基因重疊分析較RobustRankAggreg算法（RRA）更為嚴謹，可更好地篩除邊緣顯著基因或僅在單個、兩個微陣列數(shù)據(jù)集中表達顯著的差異基因。

表2 整合微陣列數(shù)據(jù)篩選的差異表達基因Table 2 Screening DEGs by Integrated Microarray

圖2 數(shù)據(jù)集差異表達基因重疊分析韋恩圖Figure2. Venn Diagram for DEGs Based on Overlapping Analysis

2.3 差異表達基因的GO富集分析結(jié)果

GO功能富集分析包括3個功能組，分別為生物過程（biological process）、分子功能（molecular function）和細胞組成（cellular component）。就衰老骨骼肌響應抗阻運動干預的DEGs的GO富集分析顯著性條目（圖3）而言，在細胞組成功能組中，抗阻運動對衰老骨骼肌影響的DEGs富集于細胞骨架蛋白、Poly（A）RNA、脂肪酸、蛋白質(zhì)結(jié)合以及運動、抗氧化、轉(zhuǎn)運體與酶催化活性；在細胞組成功能組中，DEGs富集于內(nèi)膜系統(tǒng)、細胞質(zhì)、細胞器及細胞外區(qū)域；在分子功能中，DEGs主要富集于單細胞-多細胞有機物過程（如肌肉系統(tǒng)過程與肌肉收縮）、信號轉(zhuǎn)導、細胞器組織、響應應激與刺激、調(diào)節(jié)細胞死亡、氮端蛋白質(zhì)氨基酸乙?；?、細胞過程及代謝等功能。

圖3 差異表達基因GO功能富集分析的顯著性條目Figure 3. Significant Terms of GO Enrichment Analysis

2.4 差異表達基因的KEGG通路分析結(jié)果

采用KOBAS在線分析和Revigo數(shù)據(jù)庫對篩選出的DEGs進行KEGG通路分析（表3）發(fā)現(xiàn)，在P值與校正P值顯著性水平均置于0.05時，共有10個DEGs顯著富集于MAPK、胰島素、PI3K-Akt與actin細胞骨架調(diào)節(jié)信號通路。導入Cytoscape計算網(wǎng)絡拓撲特點并確定每個節(jié)點，基因與通路節(jié)點間的交互如圖4。

圖4 差異表達基因的顯著通路富集Figure 4. Significant Pathway Enrichment of DEGs

表3 差異表達基因的KEGG通路分析Table 3 KEGG Pathway Analysis of DEGs

2.5 PPI拓撲網(wǎng)絡分析結(jié)果

DEGs的PPI拓撲網(wǎng)絡分析（圖5）顯示，共計60個節(jié)點（node）與176條邊（edge），平均節(jié)點度（degree）為5.87，平均聚類系數(shù)為0.453，PPI富集P值為0.017 5。圈體內(nèi)所示蛋白與其他蛋白存在≥5的相互作用關(guān)系，為拓撲網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)的中心節(jié)點，刪除這些節(jié)點蛋白后，網(wǎng)絡結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性降低。MCODE模塊挖掘（圖6A）與CytoHubba基于degree排序篩選出的關(guān)鍵基因（圖6B），結(jié)合STRING數(shù)據(jù)庫節(jié)點計數(shù)結(jié)果（表4），鑒定出交互最顯著的基因共計15個：MXRA5、JAK1、CCNG1、FOS、MYH1、RHOQ、ZAK、ASB11、CCNI、KIF5B、DUSP1、MYL5、ASB15、PRKAA2與SLMAP。

表4 STRING節(jié)點計數(shù)篩選關(guān)鍵基因結(jié)果Table 4 The Results of Gene Screening by Nodes Counting from STRING Database

圖5 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)交互網(wǎng)絡圖Figure 5. Protein-Protein Interaction Network

圖6 MCODE模塊挖掘（A）與degree排序（B）篩選基因結(jié)果Figure 6. The Results of Gene Screening by MCODE Mining（A）and Degree Ranking（B）

2.6 關(guān)鍵基因的GO功能與KEGG通路富集分析

應用BinGO進行功能富集分析（表5），展示顯著性前5位結(jié)果，發(fā)現(xiàn)生物過程主要富集到骨骼肌對內(nèi)源與外源性刺激的響應及骨骼肌細胞內(nèi)的信號轉(zhuǎn)導；分子功能富集到運動（神經(jīng)元）活性，及核糖核苷酸、Rho GTPase結(jié)合閾、嘌呤核糖核苷酸與蛋白質(zhì)的結(jié)合；細胞組成富集到II型肌球蛋白復合物、肌肉肌球蛋白復合物、細胞骨架、細胞骨架組分與蛋白質(zhì)復合物。就KEGG通路而言，主要富集到MAPK、胰島素與PI3K-Akt信號通路。ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ 和 PRKAA2可能是抗阻訓練改善衰老骨骼肌表型的關(guān)鍵靶點。

表5 關(guān)鍵基因GO功能與KEGG通路富集分析結(jié)果Table 5 The Results of GO and KEGG Enrichment Analysis for Hub Genes

3 分析與討論

衰老性肌萎縮是骨骼肌衰老退行性病變的關(guān)鍵表型，主要表現(xiàn)為骨骼肌質(zhì)量的丟失以及功能衰退。衰老性肌萎縮患者的骨骼肌質(zhì)量以每年1%的速率衰減，隨著年齡增長而逐漸加速（Yamada，2018）。其發(fā)生與發(fā)展可顯著增加老年人跌倒、殘疾甚至死亡的風險，嚴重影響身心健康與生活質(zhì)量，成為影響健康老齡化的重大社會問題。因此，厘清衰老性肌萎縮發(fā)生與發(fā)展的分子機理具有重要意義。

文獻梳理表明（夏志等，2016），衰老性骨骼肌萎縮與多種病原學因素相關(guān)，可能包括：1）營養(yǎng)狀態(tài)失衡：機體組織對營養(yǎng)素的反應下降和/或營養(yǎng)不良，造成蛋白質(zhì)代謝紊亂；2）缺乏體力活動和/或運動：現(xiàn)代社會靜坐少動的生活方式使得老年人群易于進入“缺乏體力活動—體質(zhì)健康下降—難以運動”這一循環(huán)；3）自由基攻擊：線粒體DNA缺失突變所致的氧化損傷；4）內(nèi)分泌功能改變：激素、生長因子的分泌與釋放發(fā)生變化，如雌激素、生長激素、睪酮、脫氫表雄酮減少和/或機體組織對胰島素、胰島素樣生長因子刺激的響應性改變；5）慢性炎癥：IL-1、TNF-α和IL-6等促炎性細胞因子的分解代謝效應；6）神經(jīng)-肌肉完整性損害：不可逆的纖維損傷或永久性失去神經(jīng)支配使神經(jīng)-肌肉之間失去正常聯(lián)系；7）衛(wèi)星細胞募集水平改變：衰老過程中，Ⅱ型肌纖維衛(wèi)星細胞的數(shù)量和募集能力大幅下降；8）細胞凋亡：肌細胞的凋亡及其誘導的線粒體DNA突變。盡管基于表型指標的研究提供了多種可能性機制線索，但是骨骼肌衰老的機制迄今仍未澄清。

基因組的不穩(wěn)定性（genomic instability）是機體衰老的首要生物標志，因此，有機生命體在生命周期中的基因損傷累積被視為衰老的共同特性（Lopez-Otin et al.，2013）。前人采用微陣列手段就衰老骨骼肌的基因表達譜變化進行了探討，但其響應長期抗阻訓練干預的適應性變化迄今鮮見相關(guān)報道（Jozsi et al.，2000；Su et al.，2015）。就本研究分析的數(shù)據(jù)集而言，雖然研究者已公開報道研究結(jié)果，但其對微陣列數(shù)據(jù)的分析尚有不足，如GSE 25941（GDS 5216）（Raue et al.，2012）與 GSE 38718（Liu et al.，2013）并未對衰老骨骼肌與青年被試骨骼肌的基因表達譜差異進行細致比較，未能明確兩者之間存在顯著表達差異的具體基因，從而未能進行相應的功能富集與通路分析；GSE 8479（Melov et al.，2007）重點關(guān)注力量等骨骼肌表型響應運動干預發(fā)生的適應變化，對于運動導致的衰老骨骼肌基因譜變化未作深入分析，亦未能明確抗阻運動究竟通過何種基因與通路介導改善骨骼肌衰老。本研究中，通過重疊分析法整合3套微陣列數(shù)據(jù)集的結(jié)果，結(jié)合LogFC閾值篩除邊緣顯著基因與僅在單個或兩個微陣列數(shù)據(jù)集中表達顯著的差異基因，最終篩選出衰老骨骼肌接受26周抗阻訓練干預后的DEGs共計60個，通過PPI網(wǎng)絡分析鑒定出15個基因的編碼蛋白交互最顯著。其中，ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ和 PRKAA2主要富集于MAPK、胰島素和PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路。與既有研究相比，它不僅深入分析挖掘了研究中的微陣列數(shù)據(jù)，而且進一步鑒定了可能介導抗阻運動改善骨骼肌衰老的關(guān)鍵基因與信號轉(zhuǎn)導通路。

ZAK、DUSP1與FOS富集于MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，其編碼蛋白均為MAPK信號途徑的重要調(diào)節(jié)因子。其中，ZAK基因是信號轉(zhuǎn)導分子MAPK3家族成員，編碼一種N端含激酶催化結(jié)構(gòu)域的蛋白。該蛋白具有促凋亡活性，在骨骼肌細胞周期調(diào)節(jié)中有重要貢獻。DUSP1編碼一種具有酪氨酸/蘇氨酸雙重特異性的磷酸酶，該蛋白可去磷酸化MAP激酶MAPK1/ERK2，在骨骼肌細胞響應環(huán)境刺激以及對增殖的負向調(diào)控中均發(fā)揮重要作用。FOS基因家族編碼亮氨酸拉鏈蛋白，使其與JUN家族的蛋白質(zhì)形成二聚體轉(zhuǎn)錄因子復合物AP-1，行使調(diào)節(jié)骨骼肌細胞增殖、分化和轉(zhuǎn)化的功能。MAPK是一類重要的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族，主要由ERK1/2、ERK3/4、ERK5、p38和JNK/SAPK 5個亞類組成。其信號通路在所有真核生物中均存在，在骨骼肌細胞基因表達、分化、再生和響應環(huán)境刺激等方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用。這與GO功能富集分析中細胞過程及細胞功能富集到的結(jié)果（表5）一致。ERK1/2和p38 MAPK是最重要的兩條通路，均可響應運動刺激發(fā)生表達變化。ERK1/2可通過活化核轉(zhuǎn)錄因子影響基因轉(zhuǎn)錄，與骨骼肌響應運動刺激的適應性變化密切相關(guān)。運動可使ERK1/2活性迅速上調(diào)并誘導MAPK活化，參與預防骨骼肌萎縮（Kramer et al.，2007）。William‐son等（2003）觀察到：與年輕被試［（21.8±0.9）歲］相比，衰老被試［（79.1±3.3）歲］股外側(cè)肌內(nèi)MAPK信號通路蛋白表達總量并無差異，ERK1/2與p38 MAPK磷酸化表達水平升高。但進行急性抗阻運動后，年輕被試骨骼肌ERK1/2與p38 MAPK磷酸化水平進一步上調(diào)，衰老被試則呈相反變化趨勢。Parkington等（2004）采用電刺激進行的動物實驗結(jié)果亦得出相同結(jié)論。p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導途徑作為骨骼肌內(nèi)多種細胞信息傳遞的中介通路，可參與骨骼肌細胞增殖、發(fā)育、響應環(huán)境刺激等多種胞內(nèi)生理過程，影響干細胞的自主丟失與更新。研究表明，衰老小鼠骨骼肌內(nèi)的衛(wèi)星細胞穩(wěn)態(tài)過程因p38 MAPK信號轉(zhuǎn)導通路的失調(diào)而受到影響（Bernet et al.，2014）。p38 MAPK的增齡性變化與抗阻運動干預后變化與ERK1/2一致（Williamson et al.，2003）。Mylabathula等（2006）的大鼠實驗也觀察到衰老導致的相同變化趨勢。衰老骨骼肌處于被稱為“stress-like conditions”的狀態(tài)，這可能是ERK1/2與p38 MAPK較年輕被試呈現(xiàn)出高磷酸化表達水平的重要原因（韓雨梅等，2009）。響應抗阻運動刺激后的表達下調(diào)可能標志著衰老骨骼肌響應營養(yǎng)、藥物、運動等合成代謝刺激的能力下降，是形成合成抵抗（anabolic resis‐tance）的因素之一（Potsch et al.，2014）。

JAK1、RHOQ分別與PRKAA2共同富集于胰島素或PI3K-Akt信號轉(zhuǎn)導通路。其中，JAK1編碼一種膜蛋白，該蛋白是一類蛋白酪氨酸激酶的成員，可催化ATP上的γ-磷酸轉(zhuǎn)移到蛋白酪氨酸殘基，在骨骼肌細胞生長、增殖、分化中具有重要作用。RHOQ編碼Rho GTPases家族成員，與GTP水解密切相關(guān)。PRKAA2編碼AMPK的催化亞基，上調(diào)其功能表達水平，可磷酸化下游眾多與骨骼肌代謝相關(guān)的限速酶。胰島素是主要的餐后（postprandial）合成代謝激素，胰島素抵抗可能發(fā)生衰老性肌萎縮。就胰島素與衰老性肌萎縮的關(guān)聯(lián)而言，Morais等（2018）得出兩個結(jié)論：其一，老年人合成代謝反應的削弱是由于胰島素不能產(chǎn)生與年輕人相似的蛋白質(zhì)合成刺激水平；其二，蛋白質(zhì)反應的敏感性降低與糖有關(guān)。通過多重回歸分析發(fā)現(xiàn)，衰老過程中常見的絕對去脂體質(zhì)量降低和體脂含量增加與胰島素在刺激蛋白質(zhì)合成時的合成代謝作用變化密切相關(guān)。因此，通過運動改善胰島素敏感性被視為改善老年人骨骼肌健康水平的重要途徑（Villareal et al.，2011）。盡管衰老骨骼肌響應急性抗阻運動產(chǎn)生的基因表達譜變化顯著低于青年（Rivas et al.，2014），但長期抗阻訓練仍然可以對衰老機體胰島素信號轉(zhuǎn)導產(chǎn)生積極影響。究其機理，可能主要基于兩方面：一方面，抗阻訓練可經(jīng)IGF-1/PI3K/Akt信號通路刺激衰老骨骼肌細胞蛋白質(zhì)合成。Ribeiro等（2017）對衰老大鼠進行為期12周爬梯抗阻訓練，觀察到IGF-1介導的骨骼肌合成代謝上調(diào)，認為其對調(diào)控骨骼肌衰老（形態(tài)學與代謝適應）關(guān)鍵因子的基因表達具有重要影響。另一方面，抗阻訓練可影響GLUT-4轉(zhuǎn)位至骨骼肌細胞膜，改善胰島素敏感性。胰島素抵抗與骨骼肌衰老及蛋白質(zhì)合成代謝削弱存在聯(lián)系，因此，其對衰老骨骼肌的蛋白質(zhì)代謝平衡亦有貢獻。PI3K-Akt信號通路在改善調(diào)節(jié)衰老骨骼肌結(jié)構(gòu)功能狀態(tài)方面的作用已達成廣泛共識（Mayhew et al.，2009），加之其與胰島素信號通路交互，因此在維持衰老骨骼肌健康水平方面亦有重要影響。本研究中，PRKAA2同時富集于胰島素與PI3K-Akt信號途徑，也為兩條通路的互作提供佐證。由于PRKAA2編碼AMPKα2，進一步提示抗阻運動對衰老骨骼肌的AMPK信號通路可能亦有影響。Fortes等（2017）指出，抗阻運動促進骨骼肌肥大的機制同時涉及PI3K-Akt途徑的活化，以及對AMPK功能表達的抑制。

MAPK、胰島素、PI3K-Akt以及AMPK信號通路在衰老骨骼肌響應抗阻訓練干預時究竟如何互作，目前尚未澄清。但有研究表明，哺乳動物雷帕霉素靶蛋白復合物1（mTORC1，含mTOR、Raptor和mLST8）可能是其共同作用途徑之一。mTORC1是骨骼肌響應合成代謝刺激、調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成與適應性肥大的關(guān)鍵信號分子，mTOR-p70S6K-4EBP1通路對抗阻運動的響應性更是直接影響其抗衰老性肌萎縮效應（Ogasawara et al.，2017）。因此，組織特異性mTORC1激動劑的研發(fā)在骨骼肌萎縮干預領(lǐng)域始終是備受關(guān)注的熱點問題（Saxton et al.，2017）。衰老骨骼肌mTORC1底物磷酸化水平下調(diào)（Wilkinson et al.，2018），抗阻運動可能通過 MAPK、PI3K-Akt、胰島素（IGF-1）及AMPK介導逆轉(zhuǎn)這一趨勢。但是，ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ和PRKAA2作為涉及其中的關(guān)鍵基因，其編碼蛋白如何參與這一調(diào)節(jié)網(wǎng)絡，能否作為臨床改善衰老性骨骼肌萎縮的潛在靶點，有待大量基礎實驗予以證實。

4 結(jié)論

衰老可致骨骼肌基因表達譜發(fā)生顯著變化，抗阻訓練亦可通過調(diào)節(jié)基因表達變化而改變骨骼肌表型。本研究通過生物信息學研究方法，深入挖掘、分析了既有微陣列數(shù)據(jù)，鑒定出相關(guān)DEGs共計60個。其中，MXRA5、JAK1、CCNG1、FOS、MYH1、RHOQ、ZAK、ASB11、CCNI、KIF5B、DUSP1、MYL5、ASB15、PRKAA2與 SLMAP可能是介導衰老骨骼肌響應長期抗阻訓練的關(guān)鍵基因；ZAK、DUSP1、FOS、JAK1、RHOQ和PRKAA2可能通過MAPK、胰島素、PI3K-Akt及AMPK信號級聯(lián)介導響應抗阻訓練刺激，調(diào)節(jié)mTORC1功能表達，改善衰老骨骼肌表型，可能是臨床防治骨骼肌衰老的候選靶點。