氨曲南及其注射劑無菌檢查方法適用性試驗(yàn)

傅莉萍，王朝麗，李 婷，張 平*

(1.上海市松江食品藥品檢驗(yàn)所微生物檢驗(yàn)室,上海 201600；2.?？谑兄扑帍S有限公司,?？?570311；3.上海美迪西生物醫(yī)藥有限公司，上海 200120)

氨曲南是單酰胺環(huán)類的新型β-內(nèi)酰胺類抗菌藥，通過抑制細(xì)菌細(xì)胞壁的合成發(fā)揮殺菌作用，對(duì)G-桿菌細(xì)胞膜上的青霉素結(jié)合蛋白(penicillin-binding protein，PBP)-3有高度親和力，從而導(dǎo)致細(xì)胞溶解、死亡。氨曲南的抗菌譜主要為G-菌，臨床主要用于敏感需氧G-菌所致感染[1]。制劑的無菌性是臨床安全用藥的重要保障，無菌檢查法是保障無菌制劑安全性的重要方法[2]。方法適用性試驗(yàn)是考察所采用的方法是否適用于該產(chǎn)品的無菌檢查，以避免對(duì)檢查結(jié)果的誤判[3]?？股仡惼贩N無菌檢查結(jié)果準(zhǔn)確與否的關(guān)鍵是無菌檢查過程中對(duì)其抑菌性的有效消除[4]。本研究采用增加薄膜過濾法沖洗量，并在培養(yǎng)基中添加青霉素酶的方法，通過3個(gè)批次獨(dú)立的方法適用性試驗(yàn)，為氨曲南及其注射劑建立了一種準(zhǔn)確、高效的無菌檢查方法。

1 材 料

1.1 儀器和菌種 C級(jí)背景局部A級(jí)的凈化工作臺(tái)、MLS-3781L-PC高壓蒸汽滅菌鍋(日本Panasonic公司)；PL402-L電子天平(梅特勒-托力多公司)；KS12生物安全柜(Thermo公司)；BD400微生物培養(yǎng)箱(德國Binder公司)；HTY-602A集菌儀、KDGB330/NKF330集菌培養(yǎng)器(浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司)。金黃色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]、大腸桿菌[CMCC(B)44102]、枯草芽孢桿菌[CMCC(B)63501]、白念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株均購自浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司，菌種使用前均經(jīng)鑒定，確認(rèn)合格。

1.2 試劑和藥品 pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基、沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基、哥倫比亞瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開發(fā)公司)；精氨酸(分析純，上海麥克林生化科技有限公司)；氯化鈉(分析純，上海凌峰化學(xué)試劑公司)。以上試劑使用前均經(jīng)無菌性檢查和靈敏度檢查，確認(rèn)合格。青霉素酶[規(guī)格：>300萬單位/ml×5 ml，阿拉丁試劑(上海)有限公司]。氨曲南原料藥(批號(hào)SS06042001001、SS06042001002、SS06042001003，重慶天地藥業(yè)有限責(zé)任公司);注射用氨曲南(規(guī)格：0.5 g，批號(hào)09200222、09200223、09200224，?？谑兄扑帍S有限公司)。

2 方法和結(jié)果

2.1 薄膜過濾法 取每種培養(yǎng)基規(guī)定接種的供試品總量，用薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入<100 CFU試驗(yàn)菌，加硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基或胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至濾筒內(nèi)。另取一個(gè)裝有等體積培養(yǎng)基的容器，加入等量試驗(yàn)菌，作為對(duì)照。置規(guī)定溫度培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)間不得超過5 d。其余試驗(yàn)菌采用同法操作。

2.2 菌液的制備 根據(jù)菌種說明書，分別取1支金黃色葡萄球菌、生孢梭菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌、黑曲霉(濃度均為110～1100 CFU/pcs)的標(biāo)準(zhǔn)菌株，用2.2 ml生理鹽水渦旋振蕩溶解，作為工作用菌懸液。使用時(shí)取0.1 ml加入過濾器，使最終制備的供試品液中含菌落數(shù)≤100 CFU。

2.3 供試品溶液的制備 (1)氨曲南原料藥：按《中華人民共和國藥典》(以下簡稱中國藥典)四部通則1101，出廠檢驗(yàn)抗生素固體原料藥≥5 g，取6個(gè)容器，每個(gè)容器供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量0.5 g，即做方法適用性試驗(yàn)時(shí)每種培養(yǎng)基接入的供試品總量為6×0.5 g=3 g。在A級(jí)環(huán)境下稱取9 g氨曲南原料藥作為三聯(lián)罐集菌器的用量，加2.34%精氨酸無菌溶液200 ml使溶解，可以每次3 g，分次稱取，分次加入2.34%精氨酸無菌溶液，使總?cè)軇w積為200 ml。(2)注射用氨曲南：按中國藥典四部通則1101，注射劑出廠檢驗(yàn)批產(chǎn)量>500支，接種每種培養(yǎng)基的最少檢驗(yàn)數(shù)量為20支。300 mg≤固體制劑≤5 g，每支供試品接入每種培養(yǎng)基的最少量是150 mg，即方法適用性試驗(yàn)時(shí)每種培養(yǎng)基接入的樣品總量為20支×0.15 g/支=3 g，即注射用氨曲南的用量。取18支注射用氨曲南作為三聯(lián)罐集菌器的用量，每支分別加0.9%氯化鈉無菌溶液溶解，并稀釋成氨曲南濃度為90 mg/ml的溶液。

2.4 方法適用性試驗(yàn) 以氨曲南原料藥(批號(hào)SS06042001001)作為試驗(yàn)組研究對(duì)象， 按表1設(shè)計(jì)無菌檢查方法適用性試驗(yàn)。

2.4.1 試驗(yàn)組(氨曲南原料藥) 取1套三聯(lián)罐集菌器，用少量的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，取200 ml供試品溶液平均濾入三聯(lián)罐集菌器中(相當(dāng)于每罐含氨曲南3 g)，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為 100 ml。根據(jù)試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的沖洗量沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中分別加入<100 CFU的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、生孢梭菌的菌懸液。每個(gè)集菌器中注入100 ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，每個(gè)集菌器中加入試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的中和劑溶液。同法制備胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基集菌器罐，分別加入<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉的菌懸液。

2.4.2 試驗(yàn)組(注射用氨曲南) 取18支注射用氨曲南，每支分別加0.9%氯化鈉無菌溶液溶解并稀釋成含氨曲南90 mg/ml的供試品溶液。取1套三聯(lián)罐集菌器，用少量的pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液潤濕濾膜，將18支供試品溶液平均濾入三聯(lián)罐集菌器中(相當(dāng)于每罐含氨曲南3 g)，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗量為 100 ml。根據(jù)試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的沖洗量沖洗濾膜，在最后一次沖洗液中分別加入<100 CFU的金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、生孢梭菌的菌懸液。每個(gè)集菌器中注入100 ml硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基，每個(gè)集菌器中加入試驗(yàn)方案設(shè)計(jì)的中和劑溶液。同法制備胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基集菌器罐，分別加入<100 CFU的枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉的菌懸液。

2.4.3 菌液對(duì)照組 以0.9%氯化鈉無菌溶液替代供試品溶液，按照試驗(yàn)組(注射用氨曲南)操作，不加中和劑，6個(gè)集菌器分別加入6種試驗(yàn)菌。

2.4.4 中和劑對(duì)照組 以0.9%氯化鈉無菌溶液替代供試品溶液，按照試驗(yàn)組(氨曲南原料藥)操作，加入中和劑溶液，6個(gè)集菌器分別加入6種試驗(yàn)菌。

2.4.5 供試品對(duì)照組 取制備好的供試品溶液(三聯(lián)罐集菌器每罐含氨曲南3 g)，以0.9%氯化鈉無菌溶液代替試驗(yàn)菌液，其余操作與試驗(yàn)組(氨曲南原料藥)相同，加入中和劑溶液。

2.4.6 陰性對(duì)照組 以0.9%氯化鈉無菌溶液替代供試品溶液，按照試驗(yàn)組(氨曲南原料藥)操作，不加中和劑，不加試驗(yàn)菌液。將上述硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基集菌器置30～35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基集菌器置20～25 ℃的培養(yǎng)箱培養(yǎng)，培養(yǎng)時(shí)長不得超過5 d。

2.5 方法適用性試驗(yàn)

2.5.1 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果 取金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、生孢梭菌、枯草芽孢桿菌、白念珠菌和黑曲霉工作用菌懸液0.1 ml置平皿中，分別加入適量瓊脂培養(yǎng)基，在適宜的溫度培養(yǎng)后，菌落計(jì)數(shù)均<100 CFU。菌落計(jì)數(shù)結(jié)果見表2。

表2 菌落計(jì)數(shù)結(jié)果Table 2 Colony count results

2.5.2 試驗(yàn)方法確認(rèn) 以氨曲南原料藥(批號(hào)SS06042001001)作為試驗(yàn)組研究對(duì)象，5種方案試驗(yàn)結(jié)果見表3。以青霉素酶作為中和劑，只有方案5中的6種試驗(yàn)菌在5 d之內(nèi)均生長良好。最終確認(rèn)以方案5作為氨曲南無菌檢查方法，即以600萬單位青霉素酶作為中和劑，用800 ml沖洗液沖洗。

表3 5種試驗(yàn)方案的測(cè)定結(jié)果Table 3 Results of the five test schemes

2.5.3 方法適用性試驗(yàn)結(jié)果 取3批氨曲南原料藥(批號(hào)SS06042001001、SS06042001002、SS06042001003)，分別進(jìn)行3次方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表4。3批供試品試驗(yàn)組、中和劑對(duì)照組與陽性對(duì)照組比較，6種試驗(yàn)菌均生長良好，并且與菌液對(duì)照組的培養(yǎng)結(jié)果相似，說明供試品在該檢驗(yàn)條件下抑菌作用完全消除，并且以青霉素酶作為中和劑對(duì)6種試驗(yàn)菌的生長無影響，可按該法進(jìn)行氨曲南原料藥的無菌檢查。

表4 氨曲南原料藥無菌檢查方法適用性試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of applicability of the sterility test for aztreonam material

取3批注射用氨曲南(批號(hào)09200222、09200223、09200224)，分別進(jìn)行3次方法適用性試驗(yàn)，結(jié)果見表5。3批供試品試驗(yàn)組、中和劑對(duì)照組與陽性對(duì)照組比較，6種試驗(yàn)菌均生長良好，并且與菌液對(duì)照組的培養(yǎng)結(jié)果相似，說明供試品在該檢驗(yàn)條件下抑菌作用完全消除，并且以青霉素酶作為中和劑對(duì)6種試驗(yàn)菌的生長無影響，可按該法進(jìn)行注射用氨曲南的無菌檢查。

表5 注射用氨曲南方法適用性試驗(yàn)結(jié)果Table 5 Results of applicability of sterility test for aztreonam for injection

2.6 建立無菌檢查方法 取氨曲南原料藥9 g， 加200 ml的2.34%精氨酸無菌溶液使溶解，經(jīng)薄膜過濾法處理，用pH 7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液分次沖洗(每膜沖洗量800 ml)，每管培養(yǎng)基中加入≥600萬單位的青霉素酶，以大腸桿菌為陽性對(duì)照菌，依法檢查，應(yīng)符合規(guī)定。取適量注射用氨曲南，加0.9%氯化鈉無菌溶液溶解并稀釋成含氨曲南90 mg/ml的溶液，按照氨曲南項(xiàng)下的方法檢查，結(jié)果符合規(guī)定。

3 討 論

中國藥典氨曲南項(xiàng)下規(guī)定[5]，氨曲南為微溶于水的白色至淡黃色結(jié)晶性粉末，無菌檢查時(shí)取9 g溶于100 ml的2.34%精氨酸溶液中。為了保證本品的溶解度和溶解速度，在氨曲南中加入一定比例精氨酸，可以起到促進(jìn)氨曲南溶解和穩(wěn)定的作用。本研究實(shí)際操作過程中發(fā)現(xiàn)，100 ml的2.34%精氨酸溶液很難溶解9 g氨曲南，且放置后氨曲南易發(fā)生氧化反應(yīng)，產(chǎn)生雜質(zhì)，使溶液變紅，無法采用薄膜過濾法進(jìn)行無菌檢查。中國藥典2020年版四部通則1101無菌檢查法規(guī)定[6]，無菌檢查法包括薄膜過濾法和直接接種法，只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過濾法。薄膜過濾法在藥品無菌檢查中應(yīng)用越來越廣泛，是無菌檢查的首選方法[7]。本研究摸索了溶解氨曲南溶劑的量，最終確定采用分步稱量，將200 ml的2.34%精氨酸溶液逐步加入，既能快速、完全溶解9 g氨曲南，防止氨曲南被氧化，又可以使用最小的溶劑量，加快薄膜過濾法的過濾速度，提高工作效率。

《中國藥典分析檢測(cè)技術(shù)指南》[8]指出，方法適用性試驗(yàn)的供試品用量可以是指接種到培養(yǎng)基中所需的檢驗(yàn)量，而不一定要取滿足供試品的檢驗(yàn)數(shù)量。所以在制備供試品過程中，氨曲南原料藥和注射用氨曲南取樣量采用滿足檢驗(yàn)量的要求，但檢驗(yàn)數(shù)量不做要求。在藥品無菌檢查中，對(duì)抑菌性供試品可以使用適宜的中和劑消除抑菌成分，使用的中和劑不應(yīng)與培養(yǎng)基發(fā)生反應(yīng)，不應(yīng)改變培養(yǎng)基原有性狀，不應(yīng)對(duì)結(jié)果判斷產(chǎn)生影響[9]。本研究在摸索無菌檢查方法過程中，采用600萬單位青霉素酶作為中和劑，中和劑對(duì)照組的菌種與陽性對(duì)照組的菌種一樣生長良好，表明600萬單位青霉素酶能滿足作為中和劑的要求。研究報(bào)道[10]，氨曲南無菌檢查法采用薄膜過濾法結(jié)合添加青霉素酶作為中和劑，但本研究中因樣本和試劑耗材來源的不同，采用500 ml沖洗量無法實(shí)現(xiàn)大腸桿菌的回收。濾膜對(duì)藥物的吸附性起著關(guān)鍵的作用，過濾抗生素應(yīng)盡量選擇低吸附性的濾器和濾膜[8]。本研究采用浙江泰林生物技術(shù)股份有限公司提供的KDGB330、NKF330一次性封閉式集菌培養(yǎng)器，采用尼龍膜材質(zhì)濾膜，適用于強(qiáng)抑菌性的抗生素藥液。

本研究采用的無菌檢查用培養(yǎng)基均通過技術(shù)驗(yàn)證，根據(jù)中國藥典[12]要求，進(jìn)行培養(yǎng)基適用性試驗(yàn)，包括無菌檢查和靈敏度檢查，并根據(jù)供試品特性選擇陽性對(duì)照菌，對(duì)抗G-菌為主的供試品應(yīng)以大腸桿菌為對(duì)照菌。同時(shí)，《中國藥典分析檢測(cè)技術(shù)指南》[8]規(guī)定，若檢驗(yàn)程序或產(chǎn)品發(fā)生變化可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，應(yīng)重新進(jìn)行方法適用性試驗(yàn)。產(chǎn)品的適用性試驗(yàn)除規(guī)定的情況外，還應(yīng)建立定期再確認(rèn)的制度，對(duì)所選方法和所用條件進(jìn)行挑戰(zhàn)性試驗(yàn)來確認(rèn)，以防止未覺察的影響因素對(duì)無菌檢查結(jié)果的干擾。本產(chǎn)品可以選擇最敏感的大腸桿菌作為再確認(rèn)的試驗(yàn)菌，并在后續(xù)生產(chǎn)過程中累積數(shù)據(jù)，通過長期跟蹤維持或改進(jìn)工藝，保證產(chǎn)品質(zhì)量[11]。