基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討益氣活血方抗肝纖維化作用的活性成分及其分子機(jī)制研究

楊 提，曾婷婷，張卉青，葉琳嵐，藺婷婷，丁 楠*

(1.海軍軍醫(yī)大學(xué)長海醫(yī)院藥學(xué)部，上海 200433；2.上海市浦東新區(qū)公利醫(yī)院藥劑科，上海 200135；3.聯(lián)勤保障部隊(duì)天津康復(fù)療養(yǎng)中心藥械科，天津201112；4.廣東省東莞市濱海灣中心醫(yī)院藥劑科，廣東東莞 523900)

肝纖維化(liver fibrosis)是多種慢性肝病共有的病理特征，主要表現(xiàn)為肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells，HSCs)的活化和細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix，ECM)的過度增生和異常沉積[1]。肝纖維化的本質(zhì)是肝臟對(duì)于各種慢性損傷的一種修復(fù)反應(yīng)。多種因素造成的肝損傷如慢性病毒感染(主要是丙型和乙型肝炎)、過量飲酒、代謝紊亂或自身免疫損傷等均可引起肝內(nèi)結(jié)締組織的異常增生，引發(fā)肝纖維化。長期且持續(xù)的肝纖維化會(huì)造成器官結(jié)構(gòu)破壞，功能衰退，最終可能導(dǎo)致肝硬化、終末期肝病或肝癌。由于肝纖維化的發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前臨床上尚未發(fā)現(xiàn)理想的抗肝纖維化藥物，因此，尋找更為有效和安全的藥物是防治肝纖維化的關(guān)鍵問題。

研究表明，傳統(tǒng)中藥復(fù)方因具有多靶點(diǎn)、多途徑且毒性低等優(yōu)點(diǎn)，在抗肝纖維化的治療中發(fā)揮著重要作用。其中益氣活血方可通過抑制HSCs活化和促進(jìn)膠原降解減輕ECM的過度積聚，進(jìn)而延緩肝纖維化的進(jìn)程[2]。益氣活血方因成分復(fù)雜，其抗肝纖維化的活性成分以及分子機(jī)制至今并不十分明確，尚待深入研究。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是基于網(wǎng)絡(luò)生物學(xué)和多向藥理學(xué)，通過構(gòu)建疾病、基因、靶標(biāo)和藥物等之間的相互作用網(wǎng)絡(luò)，從整體角度出發(fā)，較為全面地解釋中藥組分靶點(diǎn)以及途徑間的相互作用關(guān)系的學(xué)科[3]。本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，建立益氣活血方主要成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，預(yù)測其發(fā)揮抗肝纖維化作用的主要活性成分、作用靶點(diǎn)及通路，為中醫(yī)藥防治肝纖維化的機(jī)制研究提供理論基礎(chǔ)與科學(xué)依據(jù)。

1 資料和方法

1.1 分析軟件和數(shù)據(jù)庫 Cytoscape 3.7.2軟件、R語言軟件(https://www.r-project.org/)；中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫和分析平臺(tái)(Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，網(wǎng)址http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)、中醫(yī)藥綜合數(shù)據(jù)庫(Traditional Chinese Medicine Integrated Database，TCMID，網(wǎng)址http://www.megabionet.org/tcmid/)、GeneCards數(shù)據(jù)庫(https://www.genecards.org/)、UniProt數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)，String數(shù)據(jù)庫(http://string-db.org/cgi/input.pl)。

1.2 益氣活血方有效化合物的篩選 益氣活血方由黃芪、丹參、云茯苓、白豆蔻、郁金、內(nèi)金6味中藥組成。通過TCMSP和TCMID分別檢索6味中藥的主要化學(xué)成分，以口服生物利用度(oral bioavailability，OB)≥ 30%和類藥性(drug-likeness，DL)≥ 0.18為依據(jù)篩選潛在的藥效成分，并獲取各活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)。篩選結(jié)束后，為標(biāo)準(zhǔn)化蛋白質(zhì)靶點(diǎn)信息，在UniProt蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫將各活性成分的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范。

1.3 構(gòu)建益氣活血方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò) 主要通過Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建與分析益氣活血方“活性成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，其中用“節(jié)點(diǎn)”(node)表示成分或靶點(diǎn)，用“邊”(edge)表示兩者之間的關(guān)系；采用Cytoscape 3.7.2軟件內(nèi)置的network analyzer分析工具分析網(wǎng)絡(luò)特征參數(shù)，包括連接度、介度及緊密度等，研究益氣活血方中較為重要的活性成分和靶點(diǎn)及兩者之間的關(guān)系。

1.4 肝纖維化靶點(diǎn)篩選 利用GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索“hepatic fibrosis”、“l(fā)iver fibrosis”獲取肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)，以相關(guān)性分值(relevance score)≥14為篩選條件，獲得相關(guān)性較大的基因作為疾病候選靶點(diǎn)。

1.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建 為探究益氣活血方藥物與肝纖維化之間的相互作用關(guān)系，利用Venny 2.1.1軟件分析兩者的作用靶點(diǎn)，最終獲得益氣活血方防治肝纖維化的潛在作用靶點(diǎn)，并以韋恩(Venn)圖的形式展現(xiàn)。通過潛在靶點(diǎn)獲得相應(yīng)的潛在化合物及其所屬中藥名稱，并利用Cytoscape 3.7.2軟件建立中藥-潛在化合物-潛在靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)圖。

1.6 基因本體功能與通路富集分析 基因本體(gene ontology,GO)是對(duì)基因和蛋白質(zhì)功能進(jìn)行限定和描述的數(shù)據(jù)庫，包括細(xì)胞組分(cellular component，CC)、分子功能(molecular function，MF)、生物過程(biological process，BP)三個(gè)部分，因不同基因在生物體內(nèi)協(xié)同發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)功能，基于京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)富集通路的分析，更有助于了解基因的生物學(xué)功能。應(yīng)用R語言軟件中clusterProfiler GO.R插件及Perl語言對(duì)益氣活血方活性成分與肝纖維化的共同靶點(diǎn)進(jìn)行GO分析以及KEGG通路富集分析，并對(duì)分析結(jié)果進(jìn)行可視化，探究益氣活血方防治肝纖維化可能涉及的生物功能和信號(hào)通路。

1.7 觀察指標(biāo) 觀察指標(biāo)為益氣活血方主要活性成分，以及活性成分與肝纖維化的共同蛋白質(zhì)靶點(diǎn)之間的聯(lián)系。

2 結(jié) 果

2.1 益氣活血方活性成分及靶點(diǎn)獲取結(jié)果 通過TCMSP和TCMID檢索益氣活血方中的6味中藥，并以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件篩選活性成分，經(jīng)過Uniprot數(shù)據(jù)庫檢索并剔除重復(fù)值，得到82種候選活性成分及323個(gè)靶點(diǎn)。

2.2 肝纖維化候選靶點(diǎn)篩選結(jié)果 通過GeneCards數(shù)據(jù)庫分別檢索關(guān)鍵詞“hepatic fibrosis”、“l(fā)iver fibrosis”，根據(jù)relevance score≥14篩選相關(guān)性較大的靶點(diǎn)，合并2個(gè)關(guān)鍵詞搜索結(jié)果后，刪除重復(fù)值，共得到肝纖維化相關(guān)靶點(diǎn)881個(gè)，作為肝纖維化候選靶點(diǎn)。

2.3 潛在活性化合物及靶點(diǎn)篩選結(jié)果 采用Venny 2.1.1軟件將益氣活血方候選靶點(diǎn)與肝纖維化候選靶點(diǎn)取交集，得到109個(gè)共有靶點(diǎn)(見圖1)，以及對(duì)應(yīng)的潛在72種活性化合物，并根據(jù)潛在靶點(diǎn)與化合物可知所屬中藥名稱，見表1。

表1 益氣活血方治療肝纖維化的相關(guān)信息Table 1 Information related to the treatment of liver fibrosis with Yiqi Huoxue decoction

2.4 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò) 將篩選出的109個(gè)共有靶點(diǎn)輸入String數(shù)據(jù)庫，限定物種為人，其他參數(shù)設(shè)定為默認(rèn)值，剔除孤立的靶點(diǎn)蛋白，得到益氣活血方靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)(protein-protein interaction network，PPI)，見圖2。

圖2 益氣活血方抗肝纖維化藥物活性成分-疾病共有靶點(diǎn)蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)Figure 2 Protein-protein interaction network of common targets between active components of Yiqi Huoxue decoction and liver fibrosis

(續(xù)表)

應(yīng)用R語言count.R插件統(tǒng)計(jì)出現(xiàn)頻次在前20位的蛋白質(zhì)靶點(diǎn)，其中出現(xiàn)頻次較高的有轉(zhuǎn)錄激活因子-3(signal transducer and activator of transcription-3，STAT3)、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶-1(serine/threonine protein kinase-1，AKT1)、原癌基因(proto-oncogene，JUN)、抑癌基因TP53等，可作為益氣活血方抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。

2.5 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建結(jié)果 利用Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建中藥-潛在化合物-共有靶點(diǎn)-疾病網(wǎng)絡(luò)，得到184 個(gè)節(jié)點(diǎn)(110個(gè)靶點(diǎn)，72個(gè)活性成分，疾病和藥物各1個(gè))，708條邊，見圖3。

圖3 益氣活血方抗肝纖維化藥物活性成分-疾病靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖aFigure 3 Network diagram of active components of Yiqi Huoxue decoction and liver fibrosis targetsaa：粉紅色代表益氣活血方，黃色代表肝纖維化，藍(lán)色代表益氣活血方活性成分，綠色代表益氣活血方抗肝纖維化藥物活性成分-疾病共有靶點(diǎn)

網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋵W(xué)分析結(jié)果顯示，槲皮素(quercetin)連接度為80，介度為0.193 1，緊密度為0.570 1，預(yù)測槲皮素為益氣活血方防治糖尿病心肌病的主要成分，其次為木犀草素(luteolin，連接度為39，介度為0.049 8，緊密度為0.458 6)、山奈酚(kaempferol，連接度為35，介度為0.038 9，緊密度為0.447 4)，柚皮素(naringenin，連接度為22，介度為0.026 7，緊密度為0.422 6)，見表2。

表2 益氣活血方主要活性成分網(wǎng)絡(luò)節(jié)點(diǎn)特征參數(shù)Table 2 Network node characteristic parameters of main active components of Yiqi Huoxue decoction

2.6 GO功能分析及KEGG富集通路結(jié)果 利用R語言對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因富集分析(根據(jù)Ben-jamin校正法、P<0.05)，進(jìn)一步探討益氣活血方抗肝纖維化的作用機(jī)制。將GO富集分析結(jié)果分為BP、CC、MF三類，并根據(jù)信號(hào)通路中基因所占總體輸入基因的比率(GeneRatio)排列(展示前15位，見圖4)。氣泡顏色由紅到紫代表P值從小到大，P值越小代表顯著性越強(qiáng)，氣泡越大代表該通路的基因計(jì)數(shù)越大，橫軸代表該信號(hào)通路基因所占總體輸入基因的比率。圖4A表明益氣活血方抗肝纖維化靶點(diǎn)富集主要涉及的生物學(xué)過程為營養(yǎng)元素的應(yīng)答過程(response to nutrient levels)、脂多糖的應(yīng)答過程(response to lipopolysaccharide)、氧化應(yīng)激反應(yīng)(response to oxidative stress)、類固醇代謝應(yīng)答過程(response to steroid hormone)、脂多糖的反應(yīng)(response to lipopolysaccharide)、活性氧代謝過程(reactive oxygen species metabolic process)、小分子代謝過程的調(diào)控(regulation of small molecule metabolic process)等。圖4B為細(xì)胞組分分析，可見關(guān)鍵靶點(diǎn)主要作用于囊泡腔(vesicle lumen)、膜筏(membrane raft)、膜微結(jié)構(gòu)域(membrane microdomain)等。圖4C為分子功能分析結(jié)果，可見相關(guān)靶點(diǎn)抗肝纖維化的功能主要富集于受體配體活性(receptor ligand activity)、信號(hào)受體激活劑活性(signaling receptor activator activity)、細(xì)胞因子受

體結(jié)合(cytokine receptor binding)、細(xì)胞因子活性(cytokine activity)、 DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合(DNA-binding transcription factor binding)等。KEGG通路富集分析結(jié)果根據(jù)GeneRatio排序，展示排名前20位的信號(hào)通路，如圖4D所示，益氣活血方抗肝纖維化的作用靶點(diǎn)主要包括PI3K-Akt信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，體現(xiàn)了益氣活血方多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

3 討 論

肝纖維化是肝臟對(duì)損傷的修復(fù)反應(yīng)，是各種慢性肝病共有的病理改變，以ECM在肝臟過度沉積為特征， 屬可逆病變。根據(jù)中醫(yī)經(jīng)典理論并結(jié)合臨床經(jīng)驗(yàn)，肝纖維化的主要病機(jī)為“氣虛血瘀、肝郁脾虛”，采用“益氣活血、健脾化瘀”方法可改善肝臟儲(chǔ)備功能，延緩或阻止肝纖維化進(jìn)程。益氣活血方經(jīng)過多名中醫(yī)藥專家論證，具有滋肝補(bǔ)腎、疏肝健脾之功效，方中黃芪扶正補(bǔ)氣，丹參、郁金活血祛瘀、利膽退黃，云茯苓健脾寧心，白豆蔻開胃消食，臨床上多用于慢性病毒性肝炎肝纖維化的治療。

本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法初步篩選出益氣活血方抗肝纖維化的活性成分為槲皮素、木犀草素、山奈酚、柚皮素、丹參酮Ⅱa等。槲皮素、木犀草素、柚皮素均屬天然的黃酮類化合物，具有抗肝纖維化的藥理特性。WU等[4]發(fā)現(xiàn)槲皮素可通過抑制TGF-β1/Smads信號(hào)通路并激活PI3K/Akt信號(hào)通路，來抑制經(jīng)膽管結(jié)扎或四氯化碳誘導(dǎo)的肝硬化模型小鼠的肝臟細(xì)胞自噬反應(yīng)，從而減輕肝臟損傷。WANG等[5]發(fā)現(xiàn)槲皮素還能以劑量依賴的方式調(diào)節(jié)NF-κB/IкBα、p38 MAPK和Bcl-2/Bax信號(hào)的傳導(dǎo)，延緩肝纖維化的進(jìn)程。CUMMINS等[6]利用人和鼠的肝星狀細(xì)胞系研究發(fā)現(xiàn)，木犀草素可通過下調(diào)STAT3總量及其磷酸化水平，并抑制其轉(zhuǎn)錄活性，進(jìn)而抑制HSCs活化，發(fā)揮抗肝纖維化的作用。LIU等[7]發(fā)現(xiàn)在TGF-β1誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞中，柚皮素可通過選擇性抑制Smad3的轉(zhuǎn)錄，從而抑制HSCs增殖和ECM的積聚，減輕肝纖維化程度。山奈酚是一種天然黃酮醇，具有顯著的抗氧化應(yīng)激活性，可以抑制多種抗氧化酶的表達(dá)并減弱脂質(zhì)過氧化反應(yīng)，從而發(fā)揮肝細(xì)胞保護(hù)作用[8]。丹參酮為活血化瘀藥。丹參酮Ⅱa是丹參酮的主要活性成分之一，通過改造其結(jié)構(gòu)，形成磺酸鈉鹽，提高其水溶性，在清除肝臟炎癥、阻滯鈣離子通道，改善肝臟微循環(huán)，逆轉(zhuǎn)或者抑制肝纖維化方面發(fā)揮著重要作用[9]。以上提示益氣活血方活性成分的篩選具有一定的依據(jù)。

本研究對(duì)益氣活血方與肝纖維化的共同靶點(diǎn)進(jìn)行PPI映射并構(gòu)建藥物活性成分-肝纖維化-共有靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析后發(fā)現(xiàn)，出現(xiàn)頻次較高的關(guān)鍵靶點(diǎn)有STAT3、TNF-α、AKT1、JUN、TP53等，可作為益氣活血方抗肝纖維化的潛在靶點(diǎn)。STAT3是STAT蛋白家族的成員，作為一種轉(zhuǎn)錄因子，在肝纖維化進(jìn)程中占有重要地位[10]。TNF-α為一種致炎因子，可誘導(dǎo)多種纖維化相關(guān)因子形成信號(hào)網(wǎng)絡(luò)，共同調(diào)控肝纖維化過程[11]。AKT1作為AKT家族成員之一，參與細(xì)胞代謝、調(diào)亡、轉(zhuǎn)錄調(diào)控多種生理過程。JUN與抑癌基因TP53在肝纖維化中的關(guān)系尚未見報(bào)道，今后可加強(qiáng)這方面的研究。以上研究結(jié)果提示，益氣活血方可能通過上述幾個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)之間的協(xié)同作用共同發(fā)揮抗肝纖維化作用。

GO分析和KEGG通路富集分析明確了益氣活血方在抗肝纖維化作用中的生物學(xué)過程以及信號(hào)通路。其中涉及的主要生物學(xué)過程包括營養(yǎng)元素的應(yīng)答過程、脂多糖的應(yīng)答過程、氧化應(yīng)激反應(yīng)、類固醇代謝應(yīng)答過程、脂多糖的反應(yīng)、活性氧代謝過程、小分子代謝過程的調(diào)控等，表明益氣活血方可能通過調(diào)控多個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)過程發(fā)揮抗肝纖維化作用；涉及的主要信號(hào)通路包括PI3K-Akt信號(hào)通路、流體剪應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路、MAPK信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、IL-17信號(hào)通路等，這些通路與肝炎、肝癌等肝臟相關(guān)疾病有密切的關(guān)系，在肝纖維化過程中有著重要作用，也表明益氣活血方通過作用于多個(gè)信號(hào)通路共同發(fā)揮抗肝纖維化作用。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)技術(shù)分析了益氣活血方抗肝纖維化的分子機(jī)制，該過程涉及多個(gè)不同的生物學(xué)過程和信號(hào)通路，體現(xiàn)了中醫(yī)藥多成分、多靶點(diǎn)聯(lián)合作用，全方位治療疾病的整體思路。但是本研究僅是以生物信息學(xué)和網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫為基礎(chǔ)對(duì)益氣活血方抗肝纖維化分子機(jī)制的預(yù)測，后續(xù)還需要進(jìn)一步對(duì)分析所得的核心成分、關(guān)鍵靶點(diǎn)以及信號(hào)通路進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)而闡明益氣活血方發(fā)揮抗肝纖維化作用具體的分子機(jī)制。