芳樟醇抑制嗜冷桿菌引起的秘魯魷魚甲醛升高

劉雪飛，馬吾霞，李穎暢，李學(xué)鵬，蔡友瓊，楊賢慶，勵建榮*

（1 渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院 生鮮農(nóng)產(chǎn)品貯藏加工及安全控制技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心 遼寧錦州 121013 2 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院東海水產(chǎn)研究所 上海 200090 3 中國水產(chǎn)科學(xué)研究院南海水產(chǎn)研究所 廣州 510300）

魷魚，頭足類動物，其肉富含蛋白質(zhì)，生產(chǎn)和消費均逐年上升[1]。據(jù)《中國漁業(yè)統(tǒng)計年鑒》數(shù)據(jù)顯示，2018年我國魷魚捕撈量達(dá)29.2 萬t[2]，魷魚加工行業(yè)年產(chǎn)值達(dá)200 億元，已成為我國水產(chǎn)加工的支柱產(chǎn)業(yè)之一[3]。然而，魷魚制品中甲醛（Formaldehyde，F(xiàn)A） 含量超標(biāo)的報道曾一度使魷魚市場陷入低谷[4]，并一直是魷魚食用安全的關(guān)鍵問題。甲醛，也稱蟻醛，35%～40%的甲醛水溶液俗稱“福爾馬林”，因其可以凝固蛋白質(zhì)，故具有防腐和殺菌能力[5]。在IARC（International Agency for Research on Cancer，國際癌癥研究機構(gòu)）公布的致癌物清單中，甲醛被放在一類致癌物列表中，世界衛(wèi)生組織（WHO）還建立了每日0.15 mg/kg 體重的甲醛耐受日攝入量（TDI）[6]。甲醛是國家明令禁止添加到食品中的非食品添加劑[7]，在食品中不得檢出，長期食用會嚴(yán)重危害人體健康，具有致癌致畸作用[8]。

內(nèi)源性甲醛是水產(chǎn)品中甲醛的主要來源，而這些內(nèi)源性甲醛的產(chǎn)生機理主要有兩個途徑：生物途徑和非酶途徑。其中，生物途徑是魷魚中分解氧化三甲胺（TMAO）的酶和微生物的作用。該酶被稱為氧化三甲胺脫甲基酶（Trimethylamine N-oxide Demethylase，TMAOase），廣泛存在于海產(chǎn)動物組織中，能催化TMAO 轉(zhuǎn)變?yōu)槎装罚―imethylamine，DMA）和甲醛[9]。魷魚一般采用低溫貯藏，這會抑制其中微生物的生長。許多學(xué)者對非酶途徑和生物酶學(xué)途徑的研究頗多，而關(guān)于微生物對甲醛產(chǎn)生的影響未有報道。有研究表明，在魷魚低溫貯藏過程中菌落總數(shù)與感官評分具有良好的相關(guān)性（|r|＞0.9），而嗜冷菌數(shù)占菌落總數(shù)的95%以上[10]，即嗜冷菌是引起低溫貯藏魷魚品質(zhì)下降的優(yōu)勢微生物[11]。低溫貯藏魷魚中嗜冷菌與甲醛生成的相關(guān)性及其控制研究十分重要。

天然芳樟醇?xì)馕都冋?、清?具有令人愉悅的香氣，是我國食品添加劑標(biāo)準(zhǔn)中允許使用的香料，且展現(xiàn)出豐富的生物活性，在醫(yī)療保健和家庭衛(wèi)生等領(lǐng)域中具有廣泛的應(yīng)用[12]。林雅慧[13]發(fā)現(xiàn)芳樟精油對各種供試呼吸道致病菌均有顯著的抗菌作用，且抗菌能力優(yōu)于山蒼籽油、丁香油、迷迭香油、薄荷油等其它植物精油。鄭紅富等[14]發(fā)現(xiàn)芳樟醇的抗菌作用機制是改變菌體細(xì)胞膜蛋白的結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞破裂死亡。此外，芳樟醇對致齲菌具有很好的抗菌活性，可以作為牙膏或者漱口液的成分[15]。

在前期研究過程中本小組從-18 ℃貯藏的秘魯魷魚中分離到1 株近海生嗜冷桿菌L4（Psychrobacter maritimus），該菌能夠引起魷魚中甲醛含量的顯著升高，影響魷魚制品的食用安全和品質(zhì)。本文從抑菌角度控制由嗜冷菌引起的魷魚中內(nèi)源性甲醛的升高及品質(zhì)劣變，以期提高其貯藏品質(zhì)和食用安全性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

秘魯魷魚（Dosidicus gigas）購自錦州市林西水產(chǎn)市場，切成大小規(guī)格基本一致的魷魚塊（150 g，12 cm×12 cm）。近海生嗜冷桿菌L4 （P.maritimus）由渤海大學(xué)食品安全實驗室分離并保存。

芳樟醇（98%），購自上海源葉生物科技有限公司；平板計數(shù)瓊脂，購自青島海博生物技術(shù)有限公司；2,4-二硝基苯肼（DNPH）、對甲苯磺酰氯，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；二水氧化三甲胺，購自上海麥克林生化科技有限公司；三氯化鈦、苦味酸、甲苯，購自錦州藥業(yè)（集團(tuán)）器化玻有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent HPLC1260 高效液相色譜儀、Agilent GC7890 氣相色譜儀，美國安捷倫科技公司；UV-2550 型紫外可見分光光度計，日本島津公司；FE20 型pH 計，METTLER TOLEDO 公司；Biofuge Stratos 冷凍高速離心機，美國Thermo Fisher Scientific 公司；GI54DS 高壓蒸汽滅菌鍋，南京智德豐科學(xué)儀器有限公司；MS105UD 電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多有限公司；恒溫恒濕箱，上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 抑菌劑篩選 查閱文獻(xiàn)后選取左旋香芹酮、芳樟醇、乙酸芳樟酯3 種GB 2760 準(zhǔn)許使用的植物精油單體物為備選抑菌劑，以體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇將精油稀釋為不同濃度梯度（2.5，5，10，20 μL/mL），分別加入到活化后的L4 菌液中。同時做只有L4 菌液的空白組和向L4 菌液中加入等量體積分?jǐn)?shù)50%甲醇的對照組，在28 ℃搖床中培養(yǎng)24 h 后測OD595值，確定最佳抑菌劑。

1.3.2 無菌魚塊制備 在鋪有保鮮膜的超凈臺中，將秘魯魷魚塊用體積分?jǐn)?shù)75%的酒精浸泡30 s，再用無菌水清洗2 次后在超凈工作臺內(nèi)晾干備用[16]。

1.3.3 接種與貯藏 樣品分為3 組：空白組、芳樟醇組、L4 組。將L4 活化至菌濃為105CFU/mL 左右[17]，用體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇溶解芳樟醇使其質(zhì)量濃度為5 μL/mL。在超凈臺中將晾干的秘魯魷魚塊充分浸沒在L4 菌懸液中，約1 min 后撈出瀝干，此為L4 組；芳樟醇組則是將已浸過L4 菌懸液的魷魚塊再次浸沒在芳樟醇溶液中，約1 min 后撈出瀝干；空白組樣品既不加菌也不加芳樟醇。所有樣品分別裝入已滅菌的蒸煮袋中，封口并做好標(biāo)記，移至15 ℃的恒溫恒濕箱中貯藏，每隔1 d 定時測樣，取樣至第10 天。

1.3.4 感官品質(zhì) 參考雷志方等[18]的方法并稍作修改。挑選8 名經(jīng)過專業(yè)培訓(xùn)的食品院研究生（4男4 女，來自全國不同地區(qū)），按照設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)（表1）對貯藏期間樣品的外觀、氣味、品質(zhì)進(jìn)行感官評分，各項最高分為10 分，總計最高分為30 分，結(jié)果取總分值的平均值，最后對總評分結(jié)果進(jìn)行綜合分析。

表1 感官品質(zhì)評價標(biāo)準(zhǔn)Table 1 Evaluation criteria of sensory quality

1.3.5 菌落總數(shù) 細(xì)菌菌落總數(shù)測定參照GB 4789.2-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)測定》[19]。

1.3.6 FA 測定 魷魚上清液的提取[20]：稱取5 g粉碎的魷魚肉末至100 mL 具塞三角瓶中，加入40 mL 超純水，振蕩混勻后浸泡10 min，加入10 mL 10% 三氯乙酸（TCA）混勻，冰浴超聲30 min，10 000 r/min 離心6 min，取上清液，用1 mol/L NaOH 調(diào)至pH=4，然后定容至50 mL。FA 的測定參考Li 等[21]的方法并稍作修改。取5 mL 上清液與2.5 mL 1 mg/mL 2，4-二硝基苯肼衍生劑混勻，60℃水浴30 min，冷水迅速冷卻后經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾，然后用高效液相色譜儀進(jìn)行檢測。色譜條件：色 譜 柱：ODS-C18 柱 （4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：甲醇∶超純水=70∶30；進(jìn)樣量：20 μL；流速：0.5 mL/min；檢測器：紫外檢測器；波長：355 nm。

1.3.7 DMA 測定 參考賈佳等[22]的方法并稍作修改。取2 mL 上清液，加入2 mL 65% KOH 溶液，加超純水定容至5 mL，加入2 mL 對甲苯磺酰氯-甲苯溶液，60 ℃水浴加熱60 min，取出冰浴冷卻，漩渦振蕩3 min，取甲苯層進(jìn)行GC-FID 分析。

1.3.8 三甲胺（TMA）測定 參考朱軍莉等[23]的方法并稍作修改。取4 mL 上清液于25 mL 具塞比色管中，另用4 mL 蒸餾水作為空白對照，每個比色管依次加入1 mL 10% FA、5 mL 甲苯、3 mL 25%KOH，30 ℃水浴20 min，振蕩比色管使內(nèi)容物充分混合，然后將甲苯層用0.2 g 無水硫酸鈉吸水，吸取2 mL 無水甲苯層與2 mL 苦味酸混合，在410 nm 處測定吸光值。

1.3.9 TMAO 測定 TiCl3可使TMAO 還原為TMA，通過比色測定TMA 的含量，進(jìn)而對TMAO進(jìn)行定量。測定時取4 mL 待測溶液于25 mL 具塞比色管中，另用4 mL 蒸餾水作為空白對照，每個比色管加入1% TiCl3溶液0.5 mL，80 ℃水浴90 s，冷水冷卻，以下測定步驟同TMA 測定步驟。

根據(jù)以下公式計算TMAO 含量：

X=（A1-A2）×75.11/59.11

式中：X——樣品中 TMAO 含量，mg/L；A1——經(jīng)TiCl3還原后的TMA 含量，mg/L；A2——樣品中TMA 含量，mg/L；75.11——TMAO 的分子質(zhì)量；59.11——TMA 的分子質(zhì)量。

1.3.10 硫代巴比妥酸值（TBA） 測定 參照GB 5009.181-2016 《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品中丙二醛的測定》中的分光光度法，測定樣品的TBA 值。稱取10 g 絞碎的秘魯魷魚肉末，向其中加入25 mL 蒸餾水，均質(zhì)后加入25 mL 質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的三氯乙酸，攪拌均勻，靜置30 min，用雙層定量慢速濾紙過濾，棄去初濾液，續(xù)濾液備用。取5 mL 清液，向其中加入5 mL 0.02 mol/L 的硫代巴比妥酸，混勻，置于80 ℃恒溫水浴中加熱40 min，然后立刻冷卻至室溫，在532 nm 波長下測定吸光度。

1.3.11 pH 值 參考楊華等[24]的方法并稍作修改。取10 g 絞碎的秘魯魷魚肉末，加入超純水100 mL，均質(zhì)。靜置30 min 后過濾，取濾液50 mL用pH 計測其pH 值。

1.3.12 數(shù)據(jù)分析 每組樣品做3 個平行。采用Excel、SPSS 23 及Origin 8.5 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理、分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 抑菌劑的確定

由表2數(shù)據(jù)可知，對照組和空白組無顯著差異，因此可認(rèn)為體積分?jǐn)?shù)50%的甲醇對嗜冷桿菌L4 并無抑菌作用。左旋香芹酮、芳樟醇和乙酸芳樟酯這3 種備選抑菌劑在相同濃度下時，均為芳樟醇的抑菌效果最為顯著（P＜0.05）。而芳樟醇在不同濃度下時，以5 μL/mL 時對嗜冷桿菌L4 的抑菌效果最優(yōu)，故選5 μL/mL 的芳樟醇作為后續(xù)試驗抑菌劑及使用濃度。

表2 不同抑菌劑對嗜冷桿菌L4 的影響Table 2 Effects of different bacteriostatic agents on P.maritimus L4

2.2 FA、DMA、TMA 和TMAO

從圖1可以看出，隨著貯藏時間的延長，3 組樣品中的FA、DMA 和TMA 含量均呈上升趨勢，而TMAO 含量均呈下降趨勢。有研究發(fā)現(xiàn)魚肉中細(xì)菌數(shù)量與TMA 的生成量之間有著密切聯(lián)系[25]，TMAO 在細(xì)菌作用下可在新鮮海魚體內(nèi)分解為TMA[26]。本試驗結(jié)果說明TMAO 逐漸被降解為FA、DMA 和TMA，但不同處理組其降解程度不同。L4 組的FA、DMA 和TMA 含量上升幅度以及TMAO 含量下降幅度均顯著大于芳樟醇組和空白組（P＜0.05）。貯藏到第10 天時，L4 組的TMAO 含量降為470.191 mg/kg，與貯藏初始含量（17 078.429 mg/kg）相比，降解率達(dá)到了97%。而FA 含量由貯藏初始的0.173 mg/kg 攀升到31.835 mg/kg，增加了約184 倍。同時，DMA 和TMA 含量至第10 天時也分別增加了約11.2 倍和58.9 倍。說明嗜冷桿菌L4 能夠迅速降解魷魚體內(nèi)的TMAO 并轉(zhuǎn)化為FA、DMA 和TMA，降低魷魚食用安全性。FA、DMA和TMA 含量在第6 天和第8 天時上升幅度最為顯著（P＜0.05）。

圖1 芳樟醇對秘魯魷魚FA、DMA、TMA 和TMAO 含量的影響Fig.1 Effect of linalool on FA，DMA，TMA and TMAO contents in D.gigas

經(jīng)芳樟醇處理后，F(xiàn)A、DMA 和TMA 含量顯著低于同期L4 組（P＜0.05），降低倍數(shù)在1.3～12.2 之間。而TMAO 含量高于L4 組同期指標(biāo)的1.1～15.9倍。在第10 天時，芳樟醇組的TMAO 含量為4 786.142 mg/kg，是L4 組的10.2 倍，F(xiàn)A 含量為14.837 mg/kg，接近L4 組同期指標(biāo)（31.835 mg/kg）的1/2。說明芳樟醇能夠明顯減慢嗜冷桿菌L4 引起的FA 升高，提高秘魯魷魚貯藏期安全。

2.3 感官品質(zhì)

感官評分在水產(chǎn)品品質(zhì)評定中占有重要地位，可以直觀反映水產(chǎn)品在貯藏過程中的品質(zhì)變化規(guī)律。由圖2可知，秘魯魷魚在15 ℃貯藏的過程中各處理組感官評分均呈現(xiàn)降低的趨勢。從3組樣品感官評分的優(yōu)劣來看，芳樟醇組＞空白組＞L4 組。其中，L4 組的感官評分隨貯藏時間的推移下降最快，在第4 天時魚塊已有明顯的臭味出現(xiàn)，感官評分值為22，顏色微變泛黃，略有彈性。而芳樟醇組的魚塊在第8 天時才開始出現(xiàn)明顯臭味，感官評分值為20，脂肪黃出現(xiàn)，顏色開始變暗，肉質(zhì)軟化。表明嗜冷桿菌L4 加快了蛋白質(zhì)水解的進(jìn)程，導(dǎo)致秘魯魷魚塊品質(zhì)劣變，芳樟醇處理可以較好的保持秘魯魷魚的品質(zhì)，進(jìn)而延長其貨架期。

圖2 芳樟醇對秘魯魷魚感官品質(zhì)的影響Fig.2 Effect of linalool on sensory quality of D.gigas

2.4 菌落總數(shù)

微生物的生長繁殖是導(dǎo)致水產(chǎn)品腐敗變質(zhì)的主要因素，因此菌落總數(shù)的變化可以很好的反映水產(chǎn)品的新鮮度，即使采用低溫貯藏，嗜冷菌依然可以引起魷魚的品質(zhì)劣變[10]。如圖3所示，隨著貯藏時間的延長，3 組樣品的菌落總數(shù)值皆不斷增加。L4 組在第2 天時菌落總數(shù)值已達(dá)到6.2 lg（CFU/g），超過了國家標(biāo)準(zhǔn)限定值6.0 lg（CFU/g），而芳樟醇組在第4 天時才達(dá)到限定值，至少比L4組延長2 d 的貨架期。空白組由于前期進(jìn)行了消毒處理故菌數(shù)增長較慢，但在實際捕撈后的魷魚貯藏過程中不會進(jìn)行消毒處理，故帶菌狀態(tài)更接近實際情況。芳樟醇組和空白組的菌落總數(shù)值一直顯著低于L4 組（P＜0.05），說明芳樟醇具有抑菌作用，可以有效抑制秘魯魷魚塊中微生物的生長繁殖，保持魷魚的鮮度，與林雅慧[13]的結(jié)果一致。

圖3 芳樟醇對秘魯魷魚菌落總數(shù)的影響Fig.3 Effect of linalool on total plate count of D.gigas

2.5 TBA

TBA 含量可作為評價水產(chǎn)品脂質(zhì)氧化程度的重要指標(biāo)，通過TBA 與脂質(zhì)氧化產(chǎn)生的丙二醛發(fā)生反應(yīng)，水浴顯色，檢測532 nm 波長處的吸光度值判斷其脂質(zhì)氧化程度的大小[27]。有研究表明魚體脂肪氧化程度與脂肪含量、魚的種類、貯藏溫度等因素有關(guān)[28]。秘魯魷魚塊在15 ℃貯藏過程中TBA 含量的變化如圖4所示，空白組、芳樟醇組和L4 組的TBA 含量整體均表現(xiàn)出先升高再降低的趨勢，且空白組和芳樟醇組的TBA 含量顯著低于L4 組（P＜0.05）。分析認(rèn)為，芳樟醇抑制了嗜冷桿菌L4 的大量增殖，降低了微生物對脂肪的利用率，進(jìn)而使脂肪氧化速度減慢。從第6 天開始，3 組樣品的TBA 呈現(xiàn)下降的趨勢，這是因為魷魚在貯藏后期脂肪氧化產(chǎn)生的丙二醛與魷魚體內(nèi)的氨基酸、核酸、核苷、蛋白質(zhì)及醛類化合物等成分發(fā)生反應(yīng)[29]，致使TBA 濃度下降。

圖4 芳樟醇對秘魯魷魚TBA 含量的影響Fig.4 Effect of linalool on TBA content in D.gigas

2.6 pH 值

pH 值常作為判斷水產(chǎn)品品質(zhì)的重要指標(biāo)之一，因為pH 值越高越容易污染微生物，引起營養(yǎng)物質(zhì)的降解，食品腐敗得越快[30]。如圖5所示，隨著貯藏時間的推移，3 組樣品的pH 值呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢。pH 值降低的原因是魷魚死亡后體內(nèi)的糖原經(jīng)無氧降解，產(chǎn)生乳酸和丙酮酸等酸性物質(zhì)[31]。從第2 天開始3 組樣品的pH 值持續(xù)升高，這是由于微生物的生長繁殖使魷魚內(nèi)的蛋白質(zhì)、氨基酸等含氮物質(zhì)被降解，產(chǎn)生的氨、三甲胺、吲哚等[32]，使其pH 值上升。在第10 天時L4 組pH值升至8.67±0.02，空白組和芳樟醇組的pH 值分別為7.61±0.01 和8.05±0.01。芳樟醇組的pH 值始終低于L4 組，可能的原因是芳樟醇通過抑制嗜冷桿菌L4 減少了菌體胞外蛋白酶的產(chǎn)量，減緩對魚肉的分解作用，堿性物質(zhì)積累量少，進(jìn)而放慢了pH 值上升速度[33]。

圖5 芳樟醇對秘魯魷魚pH 值的影響Fig.5 Effect of linalool on pH of D.gigas

3 結(jié)論

試驗發(fā)現(xiàn)，接種了嗜冷桿菌L4 的秘魯魷魚其FA、DMA 和TMA 含量均顯著高于同期空白組（P＜0.05），并且該組魷魚塊的品質(zhì)劣變、菌落總數(shù)、TBA 值和pH 值也顯著高于空白組（P＜0.05）。說明嗜冷桿菌L4 能夠促進(jìn)秘魯魷魚中FA 的產(chǎn)生和品質(zhì)劣變。而芳樟醇組各項指標(biāo)均顯著優(yōu)于L4 組（P＜0.05），同時優(yōu)于或同于空白組，說明芳樟醇具有抑菌性，能夠抑制嗜冷桿菌L4 引起的秘魯魷魚的甲醛升高及品質(zhì)劣變，提高其食用安全性和貯藏品質(zhì)。但一種試劑作用單一，今后可采用多種生物活性成分復(fù)合或結(jié)合保藏技術(shù)進(jìn)一步提高魷魚的食用安全性。