異蛋白復(fù)合凝聚研究進展

張延鎮(zhèn)，彭舒悅，王 琪，郭前婉，趙 萌*，方亞鵬

（1 湖北工業(yè)大學(xué) 湖北省食品膠體國際科技合作基地 武漢 430068 2 上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院 上海 200240）

復(fù)合凝聚，又稱結(jié)合型相分離，是基于兩種帶相反電荷的聚電解質(zhì)在同一溶劑中，因靜電吸引發(fā)生去溶劑化，而形成的兩相體系，即富含聚電解質(zhì)的凝聚相和與之對應(yīng)的貧瘠相，兩相在平衡狀態(tài)下均含有兩種聚電解質(zhì)，只是凝聚相濃度高于貧瘠相[1]。參與凝聚過程的物質(zhì)可以是膠體、表面活性劑或聚合物[2-4]。其中，蛋白-多糖體系是食品中典型的復(fù)合凝聚體系，廣泛存在于自然界和食品中[5]，目前已應(yīng)用于食品質(zhì)構(gòu)的設(shè)計與控制[6-7]、功能因子遞送[1，8]、蛋白或多糖純化[9-10]、可食性膜制備[11]等方面。

與傳統(tǒng)的蛋白/多糖復(fù)合凝聚體系不同，兩種荷電蛋白間的復(fù)合凝聚可顯示獨特的凝膠、乳化、配體結(jié)合等功能特性[12]，使其在生物活性分子荷載、食品精細結(jié)構(gòu)設(shè)計等領(lǐng)域具有獨特的優(yōu)勢。本文綜述了異蛋白復(fù)合凝聚的特點、典型體系、影響因素及其在食品中的應(yīng)用，并展望異蛋白復(fù)合凝聚的發(fā)展方向和食品中的應(yīng)用。

1 異蛋白復(fù)合凝聚概述

1.1 異蛋白復(fù)合凝聚的定義及特點

異蛋白復(fù)合凝聚發(fā)生于兩種帶相反電荷的蛋白間。調(diào)節(jié)體系pH 值至兩種蛋白等電點之間，使兩種蛋白分別帶正電和負電，即可誘導(dǎo)異蛋白間發(fā)生復(fù)合凝聚。此外，蛋白表面電荷分布具有非均一性，帶相同電荷的異蛋白間有時也可發(fā)生復(fù)合凝聚。根據(jù)蛋白等電點（pI），將蛋白劃分為酸性蛋白、堿性蛋白兩類，其中pI 大于7 的蛋白質(zhì)為堿性蛋白，反之為酸性蛋白[13]。一般來說，異蛋白復(fù)合凝聚研究大都選擇一種酸性蛋白和一種堿性蛋白，這是為了在較大的pH 值范圍發(fā)生穩(wěn)定的復(fù)合凝聚，有利于研究復(fù)合凝聚發(fā)生機制和復(fù)合物特性，同時可展開相關(guān)應(yīng)用研究。

通過調(diào)控pH 值、離子濃度、蛋白濃度、混合比例等條件，可使異蛋白發(fā)生復(fù)合凝聚，形成凝聚體或凝聚微球。與蛋白/多糖體系相比，異蛋白復(fù)合凝聚體系有以下特點：1） 只有在較窄的pH 值、離子濃度、蛋白濃度、混合比例等條件下才能觀察到復(fù)合凝聚物；2）對pH 值、離子濃度變化極其敏感，驅(qū)動力除靜電相互作用外，還有偶極吸引和疏水相互作用[14]；3）異蛋白復(fù)合凝聚自組裝遵循電荷和尺寸補償原理[15]。目前，由于蛋白結(jié)構(gòu)和種類的復(fù)雜性，異蛋白復(fù)合凝聚還沒有普適的作用模型和作用力分析。需要說明的是：本文僅對等電點相差較大的酸性、堿性蛋白進行歸納總結(jié)，其等電點相距較近的蛋白間的復(fù)合凝聚不在本文討論范圍。

1.2 典型異蛋白復(fù)合凝聚體系

異蛋白復(fù)合凝聚研究一般涉及兩種蛋白：酸性蛋白和堿性蛋白。食品中常見的酸性蛋白主要有：α-乳白蛋白、β-乳球蛋白、酪蛋白、卵白蛋白、卵轉(zhuǎn)鐵蛋白等。而堿性蛋白種類相對較少，主要有乳鐵蛋白（LF）、溶菌酶（LYS）和A 型明膠（GEA）。本文歸納總結(jié)了以乳鐵蛋白、溶菌酶和A 型明膠3 種堿性蛋白為基礎(chǔ)的異蛋白復(fù)合凝聚體系。

1.2.1 乳鐵蛋白 乳鐵蛋白是一種啞鈴狀鐵結(jié)合的糖蛋白，由41%的α-螺旋和24%的β-折疊組成，由17 個二硫鍵穩(wěn)定其三級結(jié)構(gòu)，其分子質(zhì)量約為83 ku，pI 值為8.68.9；脫鐵后LF 柔韌性變好，更易于熱變形和酶促降解[16]。如表1所示，LF可與β-乳球蛋白（BLG）、酪蛋白（CN）等形成異蛋白復(fù)合凝聚物。此外，牛奶中的LF 和骨橋蛋白間存在相互作用，可協(xié)同提高機體免疫[17-18]。

1.2.2 溶菌酶 溶菌酶是一種球狀蛋白，可水解細菌細胞壁多糖，具有抑菌功效。結(jié)構(gòu)中包含129個氨基酸，由39%的α-螺旋和11%的β-折疊組成，分子質(zhì)量為14.3 ku，pI 值為10.7[19]。如表1所示，LYS 和α-乳白蛋白（α-LA）之間的復(fù)合凝聚是文獻報道最多的體系。現(xiàn)有研究探討了LYS-α-LA 復(fù)合凝聚對pH 值、離子濃度、蛋白質(zhì)濃度、溫度和蛋白質(zhì)柔韌性的依賴性及其凝聚機制[14，36-43]。此外，也報道了LYS 與BLG、牛血清蛋白（BSA）、卵白蛋白（OVA）等蛋白間的復(fù)合凝聚[15，33，35-36，44-59]。

表1 典型異蛋白復(fù)合凝聚體系Table 1 Typical coacervated heteroprotein systems

1.2.3 A 型明膠 明膠是膠原蛋白水解物，可分為A 型明膠（GEA）和B 型明膠（GEB）兩類，其分子質(zhì)量自15～250 ku（千道爾頓）不等，隨水解程度的不同而變化[20]。GEA通過酸水解膠原蛋白處理得到，pI 值為8～9，也是一種典型的堿性蛋白。目前，關(guān)于GEA參與的復(fù)合凝聚體系相對較少。Zhao 等[21]利用GEA-Cas 復(fù)合凝聚微球成功包埋益生菌，有效提升了益生菌在貯藏、消化及加熱過程中的存活率。Tiwari 等[22]將GEA-GEB復(fù)合凝聚體應(yīng)用于沙丁胺醇（Salbutamol）的包封。

2 影響異蛋白復(fù)合凝聚的因素

蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)，兩種物質(zhì)帶相反電荷時即發(fā)生靜電相互作用。pH 值、離子濃度、溫度、混合比及蛋白濃度等因素影響其復(fù)合凝聚過程。

2.1 pH 值

異蛋白復(fù)合凝聚主要驅(qū)動力來源于靜電相互作用，通過調(diào)節(jié)pH 值可對蛋白側(cè)鏈基團的解離度進行調(diào)控，從而改變蛋白所帶荷電性與電荷量。pH 值對異蛋白復(fù)合凝聚過程至關(guān)重要。目前，有文獻報道了pH 值對LF-BLG、LYS-BSA、LYSOVT、GEA-Cas 等異蛋白復(fù)合凝聚體系的影響。

對于LF-BLG 體系，BLG 在其等電點附近會自聚集，從而干擾或掩蓋LF-BLG 復(fù)合凝聚。Yan等[23]研究發(fā)現(xiàn)，LF-BLG 復(fù)合物在pH 5.7～6.2 范圍形成，最佳pH 值為6.0；在pH 值低于6.0 時，BLG 自聚集與LF-BLG 復(fù)合物競爭，形成較大的無定型聚集體，導(dǎo)致溶液中游離的BLG 降低，LFBLG 凝聚體消失。Anema 等[24]利用濁度滴定法證實LF-BLG 可在5.3＜pH＜7.3 時發(fā)生復(fù)合凝聚。Tavares 等[25]研究發(fā)現(xiàn)，LF-BLG 在5.50＜pH＜6.00時形成復(fù)合凝聚微球，而在5.00＜pH＜5.25 時形成不規(guī)則復(fù)合凝聚體。上述研究中，LF-BLG 的復(fù)合凝聚pH 值范圍有一定差異，這是由于選取的蛋白濃度和BLG 樣品來源不同所致。

LYS-BSA 復(fù)合凝聚體系深受pH 值影響，以BSA∶LYS=1∶2 為例，其復(fù)合凝聚過程可分為4 個區(qū)域：當(dāng)2.0＜pH＜4.0 時，體系呈凈正電荷，蛋白質(zhì)分子間相互排斥，濁度不變；當(dāng)4.0＜pH＜7.5 時，可溶性復(fù)合物形成且以低密度存在于體系中，濁度呈現(xiàn)緩慢增加趨勢；當(dāng)7.5＜pH＜11.0 時，濁度顯著增加，標志著不溶性復(fù)合物的形成；當(dāng)11.0＜pH＜12.0 時，在靜電排斥力的作用下復(fù)合物解離，濁度降低[58]。類似地，LYS-OVT 復(fù)合凝聚過程也被劃分為4 個區(qū)域[57]。Zhao 等[21]固 定GEA∶Cas=1∶1，在pH 5.0 時體系形成復(fù)合凝聚物沉淀；pH 5.5 時形成液態(tài)復(fù)合凝聚微球；pH=6.0 和pH=6.5 時形成可溶性復(fù)合物。以上研究表明，pH 值除影響蛋白電荷量外，還決定復(fù)合凝聚物的穩(wěn)定范圍及最佳形成條件。

2.2 離子濃度

離子濃度（I）對高分子間的作用力具有較強的調(diào)節(jié)作用，該作用力主要由短程吸引、遠程排斥協(xié)同支配。高離子濃度條件下，短程吸引及遠程排斥均被減弱或屏蔽；低離子濃度條件下，遠程排斥被屏蔽而短程吸引不受影響，有利于復(fù)合物的形成[60]。

不同的異蛋白復(fù)合凝聚物對離子濃度的響應(yīng)不同。LF-BLG 體系的臨界解離離子濃度為20～100 mmol/L[23-24]。LYS-BSA、LYS-OVA 復(fù)合凝聚物對離子濃度更為敏感，臨界解離離子濃度為10～20 mmol/L[15，58]；LYS-CN 復(fù)合凝聚物能夠抵抗相對較高的離子強度（80～100 mmol/L），其中，LYS-β-CN 復(fù)合物在離子濃度高于500 mmol/L 時被明顯抑制[33，35，49]。

提高蛋白濃度可適度改善復(fù)合凝聚體系對離子濃度的敏感性。LF-β-CN 體系在總蛋白質(zhì)量分數(shù)為0.1%時復(fù)合物在I＞25 mmol/L 時解離，溶液變澄清[32]；當(dāng)總蛋白質(zhì)量分數(shù)為1%時，LF-β-CN復(fù)合物在I=400 mmol/L 時依然存在[31]。另外，當(dāng)總蛋白質(zhì)量濃度分別為1 g/L 和10 g/L 時，相同物質(zhì)的量的LYS-琥珀酰化LYS 復(fù)合凝聚物的臨界解離離子濃度分別為20 mmol/L 和800 mmol/L[56]。

離子類型對復(fù)合凝聚物的影響存在差異。Nigen 等[41]對LYS-α-LA 體系研究時發(fā)現(xiàn)：1）I＜100 mmol/L（Na+）時，LYS-α-LA 可自組裝形成微球；2）復(fù)合凝聚微球具有較好穩(wěn)定性，I＞250 mmol/L（Na+）時，仍能保持結(jié)構(gòu)的完整性；3）與Mg2+、Na+相比，Ca2+更易破壞所形成的微球結(jié)構(gòu)。

2.3 溫度

異蛋白復(fù)合物粒徑大小及多分散性系數(shù)（PDI）分布表現(xiàn)出溫度、時間依賴性。Monteiro 等[37]發(fā)現(xiàn)，LYS-α-LA 復(fù)合物粒徑及PDI 隨溫度升高（25～75 ℃）而降低，在溫度高于50 ℃時，復(fù)合物粒徑及PDI 隨加熱時間的延長而增大。Pan 等[50]將LYS-β-CN 復(fù)合物溶液進行高溫?zé)崽幚恚?0 ℃、30 min）后得到單分散的納米顆粒，其粒徑及PDI 較未熱處理時的復(fù)合物均有所降低。此外，溫度變化可導(dǎo)致復(fù)合物呈現(xiàn)不同的超分子結(jié)構(gòu)。LYS-α-LA在pH 7.5，5 ℃條件下形成不規(guī)則聚集體，而在45℃條件下形成微球型復(fù)合物[43]，且不規(guī)則聚集體在溫度提高后能夠重組為凝聚微球[38，40]。

2.4 混合比例

混合比例決定異蛋白復(fù)合凝聚的程度，這一過程與pH 值緊密相關(guān)，不同的混合比例所對應(yīng)的復(fù)合凝聚最適pH 值不同，最終可導(dǎo)致復(fù)合物的組成存在差異[1]。Anema 等[24]在探究LF-BLG 復(fù)合凝聚過程時發(fā)現(xiàn)，隨著體系中LF/（LF+BLG）比例增加，最適復(fù)合凝聚所需pH 值升高，其在最適復(fù)合凝聚條件下形成的復(fù)合凝聚物的組成固定，即LF-BLG 物質(zhì)的量比約為1∶3。Yan 等[23]通過固定體系pH 值為6.0，發(fā)現(xiàn)凝聚物中LF-BLG 物質(zhì)的量比隨體系中LF-BLG 質(zhì)量比的降低而降低，在質(zhì)量比為1∶1 時，體系獲得最大凝聚效率，所對應(yīng)的LF-BLG 物質(zhì)的量比約為1∶4。類似的，Tavares 等[25]在pH 5.5 條件下發(fā)現(xiàn)，隨初始溶液中LF-BLG 物質(zhì)的量比的降低，凝聚物中LF-BLG 物質(zhì)的量比在1∶4 至1∶8 間變化。此外，Nigen 等[43]研究了LYS/α-LA 物質(zhì)的量比例對凝聚物中α-LA 回收率的影響：當(dāng)LYS/α-LA 物質(zhì)的量比＜1.0時，凝聚體中α-LA 回收率與物質(zhì)的量比呈線性增加趨勢；當(dāng)物質(zhì)的量比為1.0 時，凝聚體中最大α-LA 回收率達70%；進一步增加比例，α-LA 的回收率幾乎不變。

2.5 蛋白濃度

蛋白濃度也是復(fù)合凝聚物形成的影響因素。Yan 等[23]在pH 6.0 條件下對不同濃度的LF-BLG體系進行離心，結(jié)果發(fā)現(xiàn)質(zhì)量濃度為40 g/L 時體系獲得最大凝聚效率，高于此質(zhì)量濃度，BLG 自聚集與LF-BLG 復(fù)合物競爭導(dǎo)致復(fù)合凝聚效率降低；總蛋白質(zhì)量濃度低于10 g/L 時，無法觀察到復(fù)合凝聚物，這一結(jié)果與Tavares 等[25]的研究基本一致。

3 異蛋白復(fù)合凝聚在食品中的應(yīng)用

3.1 小分子活性成分的荷載

維生素是機體維持正常生理功能的一類微量有機物質(zhì)，在人體的生長、代謝、發(fā)育過程中發(fā)揮著重要的作用，而在生產(chǎn)加工過程中，維生素因極端pH 值、光照、加熱等條件而降解，導(dǎo)致生物利用率低[61]?；诋惖鞍讖?fù)合凝聚，Chapeau 等[28]制備了含VB9的LF-BLG 復(fù)合物，其荷載量高達6～16 mg/g（VB9/蛋白）。在穩(wěn)定性試驗中[29]，未經(jīng)凝聚體包封的VB9，在模擬紫外照射48 h 后含量降低了90%，而在復(fù)合物包封下的VB9含量僅降低了50%。通過H2O2加速氧化降解18 h，包封與未包封的VB9分別降低20%，75%；另外，含VB9的LF-BLG 復(fù)合物可應(yīng)用于規(guī)?；a(chǎn)[30]。類似地，Diarrassouba 等[54-55]利用LYS-BLG 復(fù)合凝聚微球成功包封VD3，且通過大鼠喂食試驗證實體系包封下的VD3生物利用度提高。

巖藻黃質(zhì)（fucoxanthin，F(xiàn)X）是存在于可食性棕褐色海草中的類胡蘿卜素，結(jié)構(gòu)中含有烯鍵、環(huán)氧基團和多烯鏈共軛羰基，具有抗炎作用、抗氧化等功效[62-63]，與維生素類似，對光照、加熱等條件敏感。研究表明，F(xiàn)X 可通過非共價相互作用與WPI自發(fā)形成納米復(fù)合物，隨后與LYS 凝聚，荷載率達（82.36±3.85）%；對WPI-FX、WPI-FX-LYS 兩組樣品分別進行加熱、儲藏穩(wěn)定性試驗，結(jié)果表明經(jīng)WPI-LYS 包封的FX 穩(wěn)定性最佳，其在兩項試驗中分別保留了74.4%，63.4%；而WPI-FX 僅保留20.9%，27.8%[59]。

沙丁胺醇（Salbutamol）是一種選擇性的腎上腺素受體激動劑，可緩解哮喘、慢性氣道疾病引起的支氣管痙攣[64]。Tiwari 等[22]通過pH 誘導(dǎo)GEAGEB相互作用形成復(fù)合凝聚體，用于封裝沙丁胺醇，結(jié)果表明：在GEA-GEB濁度開始上升之前，將沙丁胺醇添加至體系中，具有更高的包封率及釋放率；在模擬胃液消化試驗中，發(fā)現(xiàn)藥物的體外釋放動力學(xué)具有雙相性，在開始的10 h 內(nèi)，沙丁胺醇釋放速度迅速上升至最大值 （10 h 內(nèi)釋放約10%），隨后40 h 以最大釋放速度在體外釋放。以上研究證實異蛋白復(fù)合凝聚體系在小分子活性成分荷載方面具有良好的應(yīng)用前景。

3.2 益生菌的包埋保護

益生菌在維持腸道菌群平衡，調(diào)節(jié)血糖平衡，改善腸易激綜合癥等方面效果顯著[65]，被廣泛應(yīng)用于食品、藥品等行業(yè)。益生菌對環(huán)境敏感、容易死亡，微囊化是改善這一問題的有效手段[66]。Zhao等[21，67]采用異蛋白復(fù)合凝聚和蛋白/多糖復(fù)合凝聚兩種形式，構(gòu)建含益生菌的GEA-Cas 和GEA-GA（阿拉伯膠）復(fù)合凝聚體系，結(jié)果表明：GEA-Cas 微囊中的益生菌在模擬胃腸液、常溫貯藏和熱處理過程中存活率顯著提升，與構(gòu)建的GEA-GA 微囊相比，益生菌在模擬胃液、腸液、熱處理條件下存活率分別提高了2.06，0.47，1.58 lg（CFU/g）。與蛋白/多糖復(fù)合凝聚體系相比，異蛋白復(fù)合凝聚體系可降低微囊的吸濕性和潤濕性，減緩益生菌微囊在胃腸液中的崩解速率。綜上，作為一種新的益生菌包埋體系，異蛋白復(fù)合凝聚體系保護效果顯著。

3.3 蛋白的分離純化

復(fù)合凝聚過程中蛋白質(zhì)間相互作用具有選擇性，可通過調(diào)節(jié)理化參數(shù)來分離目的蛋白。BLG 存在兩個亞型：BLGA和BLGB，兩者間僅存在兩個氨基酸的差異，其等電點分別為5.1，5.2。Tavares 等[25]對LF-BLGA、LF-BLGB、LF-（BLGA+BLGB相同物質(zhì)的量）3 種復(fù)合凝聚體進行定量分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：在pH 5.5 條件下凝聚體中LF 的回收率范圍分別為：75%～82%，2%～6%，45%～55%，可通過LF 的選擇凝聚作用分離凝聚相中的BLGA和貧瘠相中的BLGB。此外，Pathak 等[68]研究表明，當(dāng)GEBBSA-BLG 以質(zhì)量比1∶1∶0.75 的比例存在于溶液中，調(diào)控體系pH 值至其共同的等電點（pH 5.0±0.02），因蛋白表面電荷的不均一性，故GEB可選擇性地與BSA 分子發(fā)生復(fù)合凝聚。這使得GEBBSA 復(fù)合凝聚體富集于凝聚相中，而貧瘠相中主要含有BLG 分子，最后用體積分數(shù)35%的乙醇分離凝聚體中BSA 分子，所得回收率為40%。這些研究對異蛋白復(fù)合凝聚體系應(yīng)用于蛋白分離純化提供了新的思路。

3.4 乳液穩(wěn)定

基于復(fù)合凝聚，異蛋白間可自組裝成納米顆粒，其可應(yīng)用于皮克林乳液的穩(wěn)定。Wei 等[57]在OVT/LYS=8、pH 9.3 條件下制備單分散、潤濕性適中的納米顆粒，其在含量2%條件下可穩(wěn)定高內(nèi)相乳液（油相分數(shù)為0.75），該乳液在室溫儲藏30 d后，乳液無明顯分層現(xiàn)象。在模擬胃腸液試驗中，皮克林乳液具有較大的界面面積，與空白樣品相比，該乳液的脂解程度由32.1%提至71.5%。此外，懸浮于乳液內(nèi)相中的姜黃素生物利用率由16.1%提至38.3%。該研究在乳液穩(wěn)定方面提供了一種新的思路，也提供了一種疏水性活性成分輸送壁材。

4 結(jié)語

蛋白作為關(guān)鍵的食品組分，常常多種蛋白混合共存于蛋制品、乳制品、肉制品、蛋白飲料等各類食品中，發(fā)揮穩(wěn)定、增稠、乳化、發(fā)泡、凝膠化、調(diào)節(jié)冰晶生長等功能，同時賦予產(chǎn)品特定的質(zhì)構(gòu)、風(fēng)味、營養(yǎng)特征。深入了解異蛋白復(fù)合凝聚，對食品質(zhì)構(gòu)調(diào)控、食品功能因子荷載、食品配料復(fù)合等領(lǐng)域具有重要意義。目前，異蛋白復(fù)合凝聚研究處于起步階段，其復(fù)合凝聚熱力學(xué)、動力學(xué)、結(jié)合模型等機制需進一步研究。另外，異蛋白復(fù)合凝聚在食品中的應(yīng)用需進一步挖掘，如改善起泡性、膜特性、凝膠特性等食品功能，荷載遞送更多功能因子或風(fēng)味成分。