R-spondin1調(diào)控骨骼肌生長機制的研究進展

許 濤 葉 茂 金成龍 王修啟

(華南農(nóng)業(yè)大學動物科學學院，廣東省動物營養(yǎng)調(diào)控重點實驗室，國家生豬種業(yè)工程技術研究中心，廣州 510642)

骨骼肌質(zhì)量在動物機體中占比高達50%，是畜禽主要產(chǎn)肉器官，其生長發(fā)育對機體性能極為重要[1]。諸多研究發(fā)現(xiàn)骨骼肌生長過程中Wnt信號網(wǎng)絡不可或缺，而其信號紊亂則會導致骨骼肌生長受阻和再生障礙[2-4]。隨著Wnt信號網(wǎng)絡的研究逐漸深入[5]，對其進行營養(yǎng)精準調(diào)控以促進肌肉生長已成為動物營養(yǎng)和生命醫(yī)學領域的研究熱點。R-spondin1作為Wnt信號網(wǎng)絡的激動因子，已有研究發(fā)現(xiàn)其具有緩解肝肺損傷、腸道損傷及促進毛囊發(fā)育等功能[6-9]。此外，還有研究表明，R-spondin1參與Wnt信號網(wǎng)絡調(diào)控骨骼肌再生修復過程[10]，但其作用機理仍不明確。因此，本文旨在綜述R-spondin1啟動Wnt信號網(wǎng)絡調(diào)控骨骼肌生長的功能，期望通過梳理R-spondin1作用機制發(fā)掘新的研究靶點，為骨骼肌生長調(diào)控提供理論依據(jù)。

1 Wnt信號網(wǎng)絡參與骨骼肌的生長發(fā)育

骨骼肌生長過程極其復雜，涉及骨骼肌衛(wèi)星細胞增殖分化和外源營養(yǎng)物質(zhì)調(diào)控等多重因素。其中，衛(wèi)星細胞作為位于肌膜和基底膜之間的具有成肌潛力的干細胞，對骨骼肌的生長發(fā)育及再生至關重要[11]。當肌肉受到損傷或其他外源刺激時，衛(wèi)星細胞被激活進入高速擴增狀態(tài)，逐步融入舊有肌纖維或相互融合形成新的肌纖維以修補肌肉受損部位[12]。此外，多項研究表明，特異性消融肌肉中衛(wèi)星細胞會導致肌肉再生過程被阻斷，提示衛(wèi)星細胞在肌肉再生過程中的主導地位[13-14]。

據(jù)報道，Wnt信號網(wǎng)絡在骨骼肌衛(wèi)星細胞的增殖、遷移和分化等過程中均具有關鍵調(diào)控作用[15]。研究發(fā)現(xiàn)，肌肉再生過程中，Wnt信號由低水平表達轉(zhuǎn)入高度活躍狀態(tài)，而干擾或阻斷Wnt信號則會導致肌肉再生延遲或受阻[16]。根據(jù)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運組分不同，Wnt信號網(wǎng)絡可被劃分為經(jīng)典的Wnt/β-連環(huán)蛋白(Wnt/β-catenin)信號通路、非經(jīng)典的Wnt/細胞平面極性(Wnt/PCP)信號通路以及Wnt/鈣離子(Wnt/Ca2+)信號通路[5,15]。

Chen等[17]研究表明，飼糧中添加精氨酸可促進豬背最長肌肌內(nèi)脂肪沉積，而該過程可能是通過抑制Wnt/β-catenin信號通路完成的。有意思的是骨骼肌衛(wèi)星細胞也可能參與成脂過程[18]，但是三者是否有必然聯(lián)系還需進一步研究。同時，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，賴氨酸缺乏會抑制Wnt/β-catenin信號通路，降低豬背最長肌質(zhì)量及衛(wèi)星細胞數(shù)量，補足賴氨酸則會重新激活Wnt/β-catenin信號通路[19]。此外，Yang等[20]通過在豬成肌細胞中添加GSK3β的抑制劑氯化鋰，也證明Wnt/β-catenin信號通路是調(diào)節(jié)豬成肌細胞肌源性分化的重要途徑。

Wnt/PCP信號通路的激活會促進衛(wèi)星細胞的對稱分裂，從而增加衛(wèi)星細胞數(shù)量，促進骨骼肌/肌纖維損傷修復潛力[12]。同時，過表達Wnt/PCP信號通路會顯著提高衛(wèi)星細胞遷移及融合能力，最終導致肌纖維肥大[21-22]。此外,衛(wèi)星細胞進入分化狀態(tài)后Wnt/β-catenin的表達水平會隨之升高。與之相反，下調(diào)Wnt/β-catenin的表達水平則會延緩衛(wèi)星細胞進入分化狀態(tài)，阻礙骨骼肌損傷修復[23]。而Wnt/Ca2+信號通路主要調(diào)控衛(wèi)星細胞的遷移及分化過程，該通路的激活會提高衛(wèi)星細胞的分化程度和遷移能力[24]。

2 R-spondin家族蛋白質(zhì)結(jié)構及功能

R-spondin家族是含有血小板反應蛋白質(zhì)1型重復序列(thrombospondin type 1 repeat，TSR-1)的超家族。其家族有4個成員，分別為R-spondin1～4；它們的氨基酸序列同源性為40%～60%，且均含有1個羧基尾巴和2個富含半胱氨酸的弗林蛋白質(zhì)酶域(furin-like cysteine-rich domains，F(xiàn)LD)[25-26]。研究表明，F(xiàn)LD具有R-spondin家族蛋白質(zhì)50%的活性，其主要負責R-spondin對dickkopf相關蛋白1(dickkopf-related protein 1，DKK1)功能的干擾[27]。

盡管R-spondin1～4結(jié)構相似，均對Wnt信號具有增強作用，但其表達規(guī)律及功能卻不盡相同。其中，R-spondin1在早期研究中被發(fā)現(xiàn)與性別逆轉(zhuǎn)有關[28]，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)R-spondin1能夠有效促進腸道生長發(fā)育，同時也是體外培養(yǎng)腸道隱窩干細胞的重要生長因子[29]。Nam等[30]研究發(fā)現(xiàn)，在衛(wèi)星細胞分化過程中R-spondin1表達顯著上調(diào)。另外，R-spondin1能夠促進成年小鼠皮膚細胞毛囊的新生以及調(diào)節(jié)毛發(fā)周期進程[9,31]。除此之外，它還具有誘導骨形成、血管生成和胰島細胞分泌胰島素等功能[32-34]。R-spondin2主要影響早期胚胎中的肢體和肺部的發(fā)育，其敲除會導致肢體及肺部發(fā)育不良[35-36]。Cadieu等[37]對80個品種的1 000多只家犬進行全基因組關聯(lián)分析，發(fā)現(xiàn)R-spondin2的功能對于毛發(fā)的卷曲程度有重要的影響。而R-spondin3與胎盤生長發(fā)育相關，該基因定向敲除會抑制胎盤血管生成，進而導致胚胎死亡[38-39]。在甲癬(一種與指甲發(fā)育缺陷的疾病)發(fā)生個體中R-spondin4功能嚴重受損，表明R-spondin4可能與指甲發(fā)育和疾病的發(fā)生有關，但相關作用機制尚不清楚[40]。

3 R-spondin1作用機制研究進展

3.1 R-spondin1作用機制概述

研究表明，Wnt配體和受體卷曲蛋白質(zhì)(frizzled，F(xiàn)zd)結(jié)合能夠激活Wnt信號；然后，低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(low density lipoprotein receptor related protein 5/6,LRP5/6)會被磷酸化，從而促進下游信號通路的激活[41]。然而，細胞膜上除Fzd和LRP5/6等有利于Wnt信號傳導的受體外，E3泛素連接酶RNF43(ring finger protein 43)和ZNRF3(zinc and ring finger 3)與Fzd結(jié)合則會導致其泛素化降解，從而弱化Wnt信號的傳導。R-spondin1作為Wnt信號網(wǎng)絡的增強子，其FLD區(qū)域可通過與G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體4/5(G-protein-coupled receptors,Lgr4/5)結(jié)合，進而連接RNF43和ZNRF3的胞外區(qū)域，使得膜上RNF43和ZNRF3被清除，最終增強Wnt信號的傳導[42-43](圖1)。

3.2 R-spondin1協(xié)同LRP5/6增強Wnt配體活性

R-spondin1能夠增強Wnt3a的活性。R-spondin1介導的β-catenin/T細胞因子(Tcf)信號通路依賴于內(nèi)源性Wnt3a，相比于單獨添加Wnt3a或R-spondin1，Wnt3a和R-spondin1聯(lián)合處理能夠更加顯著增加LRP5/6磷酸化水平[45]。增強后的Wnt3a與Fzd和LRP5/6受體結(jié)合后，會抑制下游的軸蛋白質(zhì)(Axin)-結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白(APC)-糖原合成酶激酶3β(GSK3β)復合物的形成，從而阻斷β-catenin磷酸化，促進胞質(zhì)內(nèi)β-catenin轉(zhuǎn)運入細胞核形成β-catenin/Tcf復合物以誘導靶基因轉(zhuǎn)錄[46-47]。而細胞表面LRP5/6的水平也能夠限制細胞對經(jīng)典Wnt配體的響應，同時減少c-Myc和β-catenin核內(nèi)蛋白質(zhì)水平[48]。另外，R-spondin1能通過與Kremen相互作用干擾Dickkopf相關蛋白1(DKK1)介導的LRP5/6磷酸化降解，導致細胞膜表面LRP5/6水平升高[49]。上述研究表明R-spondin1可通過LRP5/6磷酸化調(diào)控經(jīng)典Wnt信號通路的表達[50-51]。

R-spondin1 off：R-spondin1缺失；R-spondin1 on：R-spondin1激活；ZNRF3：鋅指環(huán)指蛋白3 zinc and ring finger 3；RNF43：環(huán)指蛋白43 ring finger protein 43；DKK1：Dickkopf相關蛋白1；Lgr4/5：G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體4/5 G-protein-coupled receptors 4/5；LRP5/6:低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6 low density lipoprotein receptor related protein 5/6；Frizzled：受體卷曲蛋白質(zhì)；ub：泛素化 ubiquitination；Dvl：dishevelled protein 散亂蛋白；Axin：軸蛋白 axin scaffolding protein；APC：結(jié)腸腺瘤性息肉病蛋白 adenomatous polyposis coli；GSK3β：糖原合成酶激酶3β glycogen synthase kinase 3β；CK1：酪蛋白質(zhì)激酶1 casein kinase 1；β-catenin：β-連環(huán)蛋白質(zhì)；Tcf/Lef：T細胞因子/淋巴增強因子T-cell factor/lymphoid enhancer factor；follistion：卵泡抑素；Myf5：生肌因子5 myogenic factor 5；Endocytosis of Receptor Complex:受體復合體的內(nèi)吞作用;weaken:減弱；enhance：增強；Membrane clearance of ZNRF3/RNF43：清除膜上ZNRF3/RNF43。圖1 R-spondin1與膜蛋白質(zhì)結(jié)合啟動Wnt/β-catenin信號通路的作用機制Fig.1 Mechanisms of R-spondin1 binding to membrane proteins to activate Wnt/β-catenin signaling pathway[25,44]

3.3 R-spondin1與Lgr4/5結(jié)合增強Wnt信號

R-spondin1主要通過與Lgr4和Lgr5結(jié)合，誘導Wnt信號的負反饋調(diào)節(jié)因子ZNRF3和RNF43的清除，增加膜上可用的Wnt配體數(shù)量，從而增強Wnt信號誘導的LRP5/6的磷酸化，以此來介導Wnt/β-catenin信號的增強。ZNRF3能夠抑制體內(nèi)Wnt/β-catenin信號并破壞Wnt/PCP信號傳導[43]。Koo等[42]發(fā)現(xiàn)在人胚胎腎HEK293T細胞和人結(jié)直腸癌HCT116細胞中，ZNRF3和RNF43都有效抑制了Wnt信號的活性。同樣，Sun等[52]對肝細胞的研究表明，ZNRF3缺失會促進肝細胞增殖，而肝細胞的增殖也受到了RNF43上調(diào)的限制,在ZNRF3突變的小鼠中同時缺失RNF43會誘導肝細胞的擴增，最終會促進肝臟腫瘤的發(fā)生。另外，Lgr4和Lgr5對動物的生長發(fā)育必不可少，研究表明，敲除Lgr5會導致新生仔鼠死亡，Lgr4被敲除則會導致小鼠存活率降低和生長遲緩[53]。而R-spondin1功能的發(fā)揮依賴Lgr4/5的存在。在HEK293T細胞中，R-spondin1增強了由Wnt3a啟動的經(jīng)典Wnt信號。Lgr4的去除盡管不影響Wnt3a的信號傳遞，但會抑制R-spondin1的功能增強，而導入重組的Lgr4/5則可以恢復R-spondin1的功能[54-55]。同時，在HEK293T細胞和爪蟾胚胎中，Lgr4和Lgr5可增強R-spondin1介導的Wnt/β-catenin和Wnt/PCP信號通路[56]。Lgr5在骨骼肌再生中是不可或缺的，其陽性細胞可在骨骼肌損傷后重建受損的肌肉纖維，并補充靜止的衛(wèi)星細胞池[57]。

R-spondin1和Lgr4通過與含GTP酶激活蛋白質(zhì)1的IQ基序(IQ motif containing GTPase-activating protein 1，IQGAP1)支架蛋白質(zhì)形成超復合物R-spondin1-Lgr-IQGAP1來增強Wnt信號。IQGAP1與Lgr4的7個跨膜結(jié)構域(7 transmembrane,7TM)結(jié)合，然后通過絲裂原活化蛋白激酶激酶1/2(MEK1/2)介導的LRP6磷酸化增強β-catenin活化。R-spondin1也能夠通過與Lgr4結(jié)合以清除膜表面的RNF43/ZNRF3增強Wnt信號活性[58]。因此，R-spondin1對Wnt信號的增強可能是一種雙重調(diào)控機制，但具體過程還需進一步的研究。

現(xiàn)有報道關于R-spondin1作用機制的解析主要集中于Wnt/β-catenin信號通路。大量數(shù)據(jù)表明R-spondin1可顯著增強Wnt/β-catenin信號通路活性[25-27]。此外，Wnt信號介導的其他支路，如Wnt/Ca2+信號通路是否也受到R-spondin1的調(diào)控作用尚不可知。

4 R-spondin1在骨骼肌生長發(fā)育中的作用

4.1 R-spondin1啟動經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨骼肌生長

有關R-spondin1通過經(jīng)典Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控骨骼肌生長及再生的研究相對較多。近期研究表明，R-spondin1缺失小鼠在急性損傷后的肌肉再生階段會因Wnt/β-catenin靶基因激活的減少而表現(xiàn)出短暫的延遲生長現(xiàn)象[59]。此外，骨骼肌的再生主要依賴衛(wèi)星細胞的增殖和分化[13-14]。據(jù)報道，R-spondin1基因過表達可以增強C2C12成肌細胞和小鼠原代衛(wèi)星細胞中堿性螺旋-環(huán)-螺旋(basic helix-loop-helix，bHLH)類成肌調(diào)節(jié)因子生肌因子5(Myf5)的mRNA豐度和蛋白質(zhì)表達水平[10]。而Myf5與衛(wèi)星細胞的增殖過程密切相關，但衛(wèi)星細胞是否參與R-spondin1調(diào)控的骨骼肌生長尚不可知[60]。Han等[10]研究表明，在外源R-spondin1基因表達的C2C12細胞(C2C12/R-spondin1HA)中，與對照C2C12細胞的細胞質(zhì)基質(zhì)中的β-catenin水平相比，前者的β-catenin水平顯著高于后者，表明R-spondin1能夠通過激活經(jīng)典Wnt信號通路提高β-catenin水平，進而激活Myf5調(diào)控成肌細胞的增殖。有趣的是，在脛骨前肌中，R-spondin1表達缺失的小鼠肌纖維的數(shù)量、大小和橫截面積沒有改變，同時每條肌纖維的肌核數(shù)和整個肌肉的橫截面積也沒有表現(xiàn)出任何差異[59]，這可能是因為肌肉的生成過程是由多因素調(diào)控的，其他因素彌補了R-spondin1缺失帶來的影響。在衛(wèi)星細胞的肌源性分化過程中，R-spondin1和R-spondin3表達均增加，而R-spondin2表達保持不變[10]。R-spondin3可能通過補償效應代替R-spondin1發(fā)揮相應的作用，這也可以解釋為什么在R-spondin1缺失時機體也會啟動衛(wèi)星細胞的增殖、分化，產(chǎn)生含有更多肌核肌管，而R-spondin家族的另一個成員R-spondin2不僅能夠激活Myf5，還能促進C2C12細胞的肌源性分化并促進肌管肥大。研究表明，Myf5的缺失能夠?qū)е滦∈笤杉〖毎脑缡旆只擟2C12細胞中Myf5基因被抑制時，也會抑制成肌細胞融合[10]。上述研究表明，R-spondin1可能通過激活Myf5參與成肌細胞的分化和成肌融合。然而，在過表達Myf5的C2C12細胞中并沒有發(fā)現(xiàn)肌管融合指數(shù)的增加，其具體原因尚待明確。

4.2 R-spondin1或可通過Wnt/PCP信號通路調(diào)控骨骼肌生長

在肌肉再生過程中，Wnt7a過表達能夠顯著增強生肌作用，促進肌纖維肥大[15]。同時，重組Wnt7a蛋白也可以被用于治療杜氏肌營養(yǎng)不良癥[18]。對其作用機制進行解析發(fā)現(xiàn)Wnt7a是通過激活Wnt/PCP信號通路，誘導衛(wèi)星細胞的對稱分裂，增加衛(wèi)星細胞數(shù)量，更新衛(wèi)星細胞池，從而提升骨骼肌損傷修復潛力[17]。與之相反，而R-spondin1缺失則會上調(diào)Fzd7和RAC1(rac family small GTPase 1)表達，激活Wnt/PCP信號通路以促進成肌細胞的融合[59]。造成兩者差異的原因或許與細胞類型或狀態(tài)有關。另外，當非經(jīng)典Wnt/PCP信號通路被激活，其關鍵組分RAC1和RHOA(ras homolog family member A)表達上調(diào),但并未檢測到R-spondin1的功能發(fā)揮[10]。這可能是由于R-spondin1是Wnt/PCP信號通路的上游，但該觀點還需更多的研究支持。

4.3 R-spondin1通過Wnt信號網(wǎng)絡參與骨骼肌生長

R-spondin1能夠平衡經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路之間的關系，參與調(diào)控骨骼肌生長發(fā)育。據(jù)報道，Wnt/β-catenin信號通路能夠通過刺激成肌細胞中的卵泡抑素和肌生成素的表達誘導成肌分化和肌細胞融合[61]。Wnt7a能夠介導Wnt/PCP信號通路驅(qū)動衛(wèi)星細胞的對稱分裂，也能激活蛋白激酶B(Akt)/哺乳動物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)信號通路誘導肌纖維肥大[17,62]。Lacour等[59]以R-spondin1敲除的小鼠為試驗模型，證明R-spondin1調(diào)控肌細胞融合以促進骨骼肌再生。與野生型細胞相比，R-spondin1缺失小鼠的肌肉祖細胞分化效率降低，但在成肌細胞體外和體內(nèi)均具有更好的融合效率；此外，R-spondin1缺失將導致Wnt/β-catenin信號下調(diào)，抑制成肌細胞分化；研究還發(fā)現(xiàn)，非經(jīng)典Wnt7a/Fzd7/RAC1信號卻會上調(diào)，并表現(xiàn)為成肌細胞融合比例的增加[59]。造成該結(jié)果的原因可能是經(jīng)典和非經(jīng)典Wnt信號通路表達時序性不同，也有可能是非經(jīng)典Wnt信號通路對于經(jīng)典Wnt信號通路具有補償作用，當分化被抑制后，機體啟動非經(jīng)典Wnt信號通路，加速已完成成肌分化的細胞參與細胞融合。因此，R-spondin1或可通過調(diào)節(jié)Wnt信號網(wǎng)絡來參與骨骼肌生長或再生的調(diào)控，但其具體的作用機制仍需進一步探索。

5 小結(jié)與展望

目前，有關R-spondin1在骨骼肌生長發(fā)育過程中的作用機制仍存在諸多未知，其功能和作用機理研究仍有待挖掘。本課題組已經(jīng)完成豬R-spondin1基因克隆和表達純化，并對重組豬R-spondin1蛋白質(zhì)的活性和功能進行了初步驗證，為后續(xù)研究奠定了基礎[63]。作為Wnt信號網(wǎng)絡中重要激活因子，有研究提出R-spondin1在體外培養(yǎng)肌肉組織方面可能會成為一個重要突破方向。此外，R-spondin1與Wnt信號及其他調(diào)控因子的聯(lián)系，將是科研工作者今后考慮的方向。今后，我們將進一步探索R-spondin1調(diào)控骨骼肌生長的機制，以期通過介導R-spondin1的表達水平或外源添加R-spondin1調(diào)控Wnt信號網(wǎng)絡及發(fā)現(xiàn)調(diào)控骨骼肌生長和修復的新的研究靶點，進而提高肌肉生長潛力，為畜牧業(yè)生產(chǎn)提供理論指導。