特應(yīng)性皮炎不同T細(xì)胞亞群平衡紊亂與中醫(yī)證型關(guān)聯(lián)及YAP對(duì)其調(diào)控作用的研究

賈金靖，葉思祺，張瑜，晏烽根，劉俊峰，莫秀梅，李紅毅，陳達(dá)燦

[廣州中醫(yī)藥大學(xué)第二附屬醫(yī)院（省部共建中醫(yī)濕證國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東省中醫(yī)藥防治難治性慢病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室），廣東 廣州 510120]

特應(yīng)性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一種慢性、復(fù)發(fā)性、瘙癢性皮膚疾病，目前其確切發(fā)病機(jī)制尚不明確，既往認(rèn)為是以輔助性T細(xì)胞（Th）2為主的免疫反應(yīng)，并釋放一系列細(xì)胞因子，引起Th1/Th2調(diào)節(jié)失衡[1]，進(jìn)一步加重屏障功能障礙形成惡性循環(huán)。新近研究表明，Th17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Treg）在AD急、慢性期的數(shù)量、功能差異在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用[2]，構(gòu)成一個(gè)復(fù)雜龐大的Th1/Th2/Th17/Treg免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。Yes相關(guān)蛋白（YAP）是Hippo信號(hào)通路下游的關(guān)鍵成員。以往的研究多集中在腫瘤領(lǐng)域[3]，在AD中所起的作用尚未見報(bào)道。近來研究表明，Hippo信號(hào)通路在Th17及Treg的分化中發(fā)揮重要作用[4-7]，YAP作為Hippo通路的效應(yīng)分子，很可能是維持這一平衡的關(guān)鍵因素。

AD 屬于中醫(yī)“四彎風(fēng)”、“奶癬”、“胎斂瘡”等的范疇[8]。AD急性期通常辨為心脾積熱證或心火脾虛證；慢性期通常辨為脾虛蘊(yùn)濕證或血虛風(fēng)燥證。本文研究AD不同中醫(yī)證型之間Th1/Th2/Th17/Treg的比例以及YAP表達(dá)量對(duì)其平衡紊亂的影響，探討其特征及機(jī)制，有利于深入了解中醫(yī)辨證分型的本質(zhì)，從而指導(dǎo)臨床更合理選方，提高療效。

1 材料與方法

1.1 一般資料 收集AD患者35例，其中男22例，女 13例，年齡 6～46歲，平均（18.12±1.49）歲，病程0.5～20年，平均（6.61±0.85）年。均符合 Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]，排除合并感染性疾病、其他臟器或血液系統(tǒng)等嚴(yán)重原發(fā)性疾病、惡性腫瘤，或者合并需要治療的其他皮膚病，孕婦或處于哺乳期者，近1個(gè)月內(nèi)未服用糖皮質(zhì)激素、免疫抑制劑。健康對(duì)照者24例，男 12例，女12例，年齡 6～26歲，平均（20.96±1.16）歲。所有入組者均征求本人同意并簽署知情同意書（18歲以下患者由其父母或監(jiān)護(hù)人簽字）并獲廣東省中醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。中醫(yī)證型診斷標(biāo)準(zhǔn)參照《特應(yīng)性皮炎中醫(yī)診療方案專家共識(shí)》[10]，將AD患者分為心火脾虛證21例，其中男13例，女8例，年齡 6～46歲，平均（19.71±1.87）歲，病程 0.5～20.0年，平均（7.54±1.22）年；脾虛蘊(yùn)濕證 9例，其中男6例，女3例，年齡 6～27歲，平均（14.11±3.11）歲，病程0.5～13年，平均（4.89±1.34）年；血虛風(fēng)燥證5例，其中男3例，女2例，年齡10～24歲，平均（16.80±3.07）歲，病程 1～11 年，平均（5.80±1.78）年。病情采用AD嚴(yán)重程度評(píng)分（SCORAD）法計(jì)算。

1.2 方法

1.2.1 酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）法檢測血清中細(xì)胞因子含量 患者及健康對(duì)照者均抽取外周靜脈血40～50mL，一部分靜置后2000r/min，離心10min，離心半徑9.5 cm，小心吸取血清。按照ELISA試劑盒（武漢EIAab科技有限公司）說明書進(jìn)行操作，檢測人血清中Th1相關(guān)細(xì)胞因子 [干擾素（IFN）-γ]、Th2 相關(guān)細(xì)胞因子[白細(xì)胞介素（IL）-4]、Th17 相關(guān)細(xì)胞因子（IL-6、IL-17A、IL-21）、Treg相關(guān)細(xì)胞因子[轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）-β、IL-2、IL-10]的水平。

1.2.2 Th1/Th2/Th17/Treg比例測定 患者及健康對(duì)照者外周靜血用Ficoll密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞（PBMC），使用流式細(xì)胞儀進(jìn)行各細(xì)胞亞群比例的測定，用不同的單克隆抗體進(jìn)行標(biāo)記后檢測，其中 CD3+CD4+IFN-γ+為 Th1，CD3+CD4+IL-4+為 Th2，CD3+CD4+IL-17A+為 Th17，CD3+CD4+CD25+FOXP3+為 Treg。

1.2.3 T細(xì)胞亞群細(xì)胞的誘導(dǎo)分化 用人Naive CD4+T細(xì)胞分離試劑盒（美國Miltenyi Biotec公司）分選PBMC中的Naive CD4+T細(xì)胞，再進(jìn)一步按照Th1分化試劑盒、Th2分化試劑盒、Th17分化試劑盒、Treg分化試劑盒（均來自美國R&Dsystems公司）誘導(dǎo) Naive CD4+T 細(xì)胞向 Th1、Th2、Th17、Treg分化。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測YAP mRNA表達(dá)情況 用Trizol法提取誘導(dǎo)分化后的不同 T 細(xì)胞亞群（Th1、Th2、Th17、Treg）以及小鼠皮損中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，采用SYBR Green試劑盒，在冰面上制備qRT-PCR反應(yīng)體系，以GAPDH為內(nèi)參照，qRT-PCR儀檢測患者及健康對(duì)照者不同T細(xì)胞亞群中的YAP mRNA表達(dá)情況。所采用的引物序列為YAP：Forward：ATGAGATGGATACAGGTGATAC，Reverse：GGCTTCAAGGTAGTCTGG；GAPDH：Forward：CATCAAGAAGGTGGTGAAG，Reverse：GCTGTTGAAGTCAGAGGAG。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示；2組間比較采用t檢驗(yàn)；3組及以上之間的比較采用方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AD患者及健康對(duì)照者的臨床特征分析 AD組和健康對(duì)照組年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=-1.169，P=0.247），性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.964，P=0.326）；AD不同中醫(yī)證型組之間性別差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.082，P=0.960），年齡差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.388，P=0.264），病程差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.942，P=0.401），嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=0.582，P=0.565），外周血IgE水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=1.757，P=0.189），SCORAD 差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=16.738，P＜0.001），進(jìn)一步LSD兩兩比較結(jié)果顯示：心火脾虛組與脾虛濕蘊(yùn)組相比P＜0.001，心火脾虛組與血虛風(fēng)燥組相比P＜0.001，脾虛濕蘊(yùn)組與血虛風(fēng)燥組相比 P=0.130。見表 1、2。

表1 AD組和健康對(duì)照組的臨床特征 例

2.2 AD不同中醫(yī)證型之間存在Th1/Th2/Th17/Treg平衡紊亂 筆者用流式細(xì)胞儀檢測Th1/Th2/Th17/Treg細(xì)胞占總CD4+T細(xì)胞的比例，結(jié)果顯示：Th1在心火脾虛組輕度降低，在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組升高，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Th2在心火脾虛組顯著升高（P＜0.05），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組降低，但未低于正常對(duì)照組水平；Th17同樣在心火脾虛組顯著升高（P＜0.05），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組降低，但未低于正常對(duì)照組水平；而Treg在心火脾虛組顯著降低（P＜0.05），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組升高，均超過了正常對(duì)照組的水平，且在血虛風(fēng)燥組其升高的程度與正常對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見圖1A。進(jìn)一步分析各個(gè)中醫(yī)證型之間Th2/Th1、Th17/Treg比例，結(jié)果可見，在心火脾虛組其Th2/Th1及Th17/Treg比例較正常對(duì)照組均明顯升高（P＜0.05），脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組較正常對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖1B、C。

圖1 在AD中存在Th1/Th2/Th17/Treg平衡紊亂

ELISA法檢測血清中不同細(xì)胞因子的表達(dá)，可見Th1相關(guān)細(xì)胞因子IFN-γ在心火脾虛組顯著降低（P＜0.01），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組升高，但異質(zhì)性較大，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Th2相關(guān)細(xì)胞因子IL-4在心火脾虛組顯著升高（P＜0.001），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組又回落，但未降至正常對(duì)照組水平之下；Th17相關(guān)細(xì)胞因子中，IL-17A及IL-21在心火脾虛組顯著升高（P＜0.01），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組降低，而IL-6雖然也有這一趨勢，但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；Treg相關(guān)細(xì)胞因子中僅IL-10在心火脾虛組顯著降低（P＜0.01），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組又回升，并超過正常對(duì)照組水平，其余TGF-β及IL-2均無明顯變化，見圖2A～H。

圖2 ELISA檢測血清中不同細(xì)胞因子的表達(dá)

2.3 YAP在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)存在差異 在健康對(duì)照組中，可見YAP mRNA在Treg中明顯升高，均高于在 Th1、Th17、Treg中的含量（P＜0.05），見圖3A；而在AD組中，YAP mRNA在Th17中表達(dá)升高，并且高于了在Th1中的表達(dá)，與健康對(duì)照組相比在Treg中表達(dá)降低，與Th1及Th2相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見圖3B。進(jìn)一步對(duì)不同中醫(yī)證型之間YAP表達(dá)量作以比較，可見YAP mRNA在Th1及Th2中的表達(dá)在不同中醫(yī)證型之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；YAP mRNA在Th17中的表達(dá)在心火脾虛組明顯升高（P＜0.01），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組的表達(dá)降低，但仍高于正常對(duì)照組；YAP mRNA在Treg中的表達(dá)在心火脾虛組明顯降低（P＜0.05），在脾虛濕蘊(yùn)和血虛風(fēng)燥組的表達(dá)回升，但未恢復(fù)至正常對(duì)照組的水平，見圖3C。

圖3 YAP mRNA在不同T細(xì)胞亞群中的表達(dá)

表2 AD組中不同中醫(yī)證型的臨床特征 （±s）

表2 AD組中不同中醫(yī)證型的臨床特征 （±s）

注：*P＜0.001 vs.心火脾虛組。

組別 n 男 女 年齡（歲） 病程（年） S C O R A D（分） 嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)（1 0 9/L，0.0 2～0.5 2） I g E（I U/m L，0～2 0 0）心火脾虛 2 1 1 3 8 1 9.7 1±1.8 7 7.5 4±1.2 2 7 2.5 4±2.1 3 1.3 7±0.2 5 7 4 9 9.6 2±1 8 1 7.4 6脾虛濕蘊(yùn) 9 6 3 1 4.1 1±3.1 1 4.8 9±1.3 4 5 6.1 1±2.5 3* 0.9 7±1.3 9 2 9 3 1.3 3±1 4 7 4.0 4血虛風(fēng)燥 5 3 2 1 6.8 0±3.0 7 5.8 0±1.7 8 4 7.2 8±6.8 9* 1.2 6±0.2 3 2 9 2 2.7 8±1 6 4 7.5 2

3 討論

AD又稱為異位性皮炎，其特征為患者的皮膚屏障功能受損、免疫系統(tǒng)功能失調(diào)[11]。其受累人群廣泛，約有15%的兒童及3%的成人患病[12]。目前中醫(yī)藥在AD的治療中發(fā)揮的作用已經(jīng)越來越得到國際認(rèn)可，許多關(guān)于AD指南中均提及中醫(yī)藥療法[13]，認(rèn)為其是應(yīng)對(duì)診療困境中可選擇的方法。

AD是一個(gè)典型的多因素共同作用的疾病，傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為AD的發(fā)病與Th2為主的Th1/Th2失衡有關(guān)[1]，而近幾年國內(nèi)外大量研究中得出，Th17及Treg相關(guān)細(xì)胞因子的失衡也可能是AD發(fā)病的重要機(jī)制[2]。在AD患者皮損中和PBMC中能檢測到IL-17，并且IL-17的水平與AD病情嚴(yán)重程度相關(guān)，同時(shí)檢測AD患者血漿中Th17細(xì)胞的數(shù)量明顯升高，推測Th17細(xì)胞及其分泌的IL-17參與AD的發(fā)病[14-15]。此后又有研究發(fā)現(xiàn)Treg的數(shù)量及功能在AD患者中發(fā)生改變，推測Treg也參與了AD的發(fā)病[16]。如同Th1/Th2平衡一樣，Th17/Treg平衡也是維持機(jī)體免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素。然而究竟是何因素在調(diào)控其平衡中發(fā)揮關(guān)鍵作用，仍是一個(gè)尚未解決的難點(diǎn)。

YAP屬于Hippo信號(hào)通路下游的關(guān)鍵成員，研究表明其可能通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和凋亡、調(diào)控組織器官生長發(fā)育和大小、調(diào)節(jié)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）、調(diào)節(jié)細(xì)胞間接觸抑制、參與干細(xì)胞自我更新等途徑參與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，因此YAP基因被認(rèn)為是一種癌基因[3]。最近，Ni等[4]研究健康人外周血與小鼠脾臟、淋巴結(jié)分離的T細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)與Th1、Th2、Th17相比，YAP在Treg中特異性高表達(dá)，且對(duì)維持Foxp3的表達(dá)發(fā)揮重要作用。敲除YAP或者加入特異性抑制劑維替泊芬可導(dǎo)致Treg功能失調(diào)，進(jìn)而不能發(fā)揮抗腫瘤免疫活性。YAP特異性基因敲除鼠的初始CD4+T 細(xì)胞表達(dá) IL-17A、IFN-γ、IL-2 均增加，而Foxp3表達(dá)降低。因此推測YAP的表達(dá)下調(diào)可促進(jìn)Th17及Th1細(xì)胞發(fā)育、但抑制Treg產(chǎn)生。Fan等[5]研究發(fā)現(xiàn)，肝癌患者外周血中YAP表達(dá)上調(diào)，并且與Foxp3表達(dá)水平及Treg百分比呈正相關(guān)。體外實(shí)驗(yàn)表明，健康人外周血T細(xì)胞中過表達(dá)YAP可通過轉(zhuǎn)化生長因子β受體（TGFBR2）促使初始CD4+T細(xì)胞向Treg分化。Ramjee等[6]關(guān)于心肌梗死的實(shí)驗(yàn)印證了缺乏YAP和有PDZ結(jié)合基序的轉(zhuǎn)錄共激活因子（TAZ）表達(dá)的鼠模型中受累心肌的Treg數(shù)目減少，這樣的鼠心梗后心包炎性反應(yīng)和心肌纖維化更加嚴(yán)重。Suh等[7]研究了118例胃腺癌標(biāo)本后得出，腫瘤中YAP的表達(dá)與Foxp3的表達(dá)和Treg數(shù)量正相關(guān)，F(xiàn)oxp3表達(dá)較高者預(yù)后較好。此外，另一個(gè)YAP類似物的Hippo通路效應(yīng)分子TAZ被發(fā)現(xiàn)在Th17細(xì)胞中特異性高表達(dá)，并可作為初始CD4+T細(xì)胞向Th17分化的促進(jìn)因素、但卻是Foxp3+Treg表達(dá)和功能的抑制因素[17]。Th17/Treg平衡失調(diào)是AD發(fā)病機(jī)制中很關(guān)鍵的一環(huán)，YAP作為Hippo通路的效應(yīng)分子，很可能在維持這一平衡中發(fā)揮重要作用。

本研究收集了不同中醫(yī)證型的AD患者和健康對(duì)照者，2組的性別、年齡、病程、嗜酸性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)及IgE差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，不過在不同中醫(yī)證型之間，反映病情嚴(yán)重程度的SCORAD評(píng)分差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。目前大部分文獻(xiàn)把一個(gè)較短時(shí)期內(nèi)皮疹的加重定義為AD的復(fù)發(fā)或急性期[18-19]，因?yàn)镾CORAD評(píng)分可反映AD皮疹的嚴(yán)重程度，可以間接反應(yīng)AD病程中的急性發(fā)作期和慢性緩解期。進(jìn)一步研究不同T細(xì)胞亞群在各個(gè)證型之間比例的差別，可以看到在AD中心火脾虛證Th2細(xì)胞比例及其細(xì)胞因子IL-4升高明顯，在脾虛濕蘊(yùn)證和血虛風(fēng)燥證雖有升高但是差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，主要是Th1及其細(xì)胞因子IFN-γ升高為主，而在心脾積熱證中Th1及其細(xì)胞因子IFN-γ反有降低趨勢，這與傳統(tǒng)認(rèn)為的AD在急性期是以Th2為主的免疫反應(yīng)、慢性期是以Th1為主的免疫反應(yīng)相吻合。Th17及其細(xì)胞因子IL-17A、IL-21雖然在整個(gè)AD組均有升高，但是在心火脾虛證中升高更顯著。Treg及其細(xì)胞因子IL-10在心火脾虛證中明顯降低，在脾虛濕蘊(yùn)證和血虛風(fēng)燥證中反而升高超過了健康對(duì)照組。既往有認(rèn)為在AD中Treg的數(shù)量下降及功能抑制[20-22]，或者增加[23-25]、甚至無明顯變化[26]的研究報(bào)道。既往研究證實(shí)YAP對(duì)Treg的分化及功能維持至關(guān)重要，其下調(diào)反而可能是促進(jìn)Th17發(fā)育的因素[4]。筆者的研究證實(shí)在健康人群中YAP在Treg中的表達(dá)高于其他T細(xì)胞亞群，在AD患者中其在Treg中的表達(dá)降低，并且在心火脾虛組更明顯，可能YAP在Treg中的下調(diào)與其分化受組、功能抑制有關(guān)，進(jìn)而不能發(fā)揮其抑炎作用，促進(jìn)了AD的炎性反應(yīng)加重了病情；而YAP在Th17中的表達(dá)在AD組卻明顯升高，尤其是在心火脾虛組，說明其可能是促使Th17分化和功能的因素。因?yàn)樵跈C(jī)體中Th17/Treg也是一個(gè)動(dòng)態(tài)平衡的過程，IL-2在TGF-β的輔助下可誘導(dǎo)Foxp3的表達(dá)，從而維持外周Treg的數(shù)量、功能[27]。但在IL-6存在的情況下，TGF-β則促進(jìn)初始T細(xì)胞分化為Th17[28-30]。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)在AD中存在Th2/Th1、Th17/Treg平衡紊亂，YAP在Treg中的表達(dá)下調(diào)、Th17中的表達(dá)上調(diào)很可能是介導(dǎo)AD Th17/Treg平衡向Th17偏移的關(guān)鍵因素，且這一特征在心火脾虛證中更明顯。本研究仍有一定的局限性，首先是由于需要的血液標(biāo)本量較大，主要見于嬰兒期AD的心脾積熱證未能收集到標(biāo)本進(jìn)行研究，缺失了這部分的數(shù)據(jù)；其次因?yàn)樵谂R床中脾虛濕蘊(yùn)證和血虛風(fēng)燥證的AD患者所占比例也很低，納入本研究的樣本例數(shù)較少，目前的結(jié)果僅僅推測出與急性期相關(guān)的心火脾虛證差異明顯，上述特征并沒有區(qū)分開脾虛濕蘊(yùn)證和血虛風(fēng)燥證二者的差別。本研究為中醫(yī)辨證分型的標(biāo)準(zhǔn)化、規(guī)范化以及選擇新藥靶點(diǎn)提供了一定的理論基礎(chǔ)和實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但仍處在初步探索階段，還需要更大樣本量及更多數(shù)據(jù)進(jìn)一步深入探索。