跨膜受體蛋白NOTCH1誘導(dǎo)人皮膚鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡的機(jī)制研究

王莉，陳尚周，雷淑英，周發(fā)瓊

（恩施土家族苗族自治州中心醫(yī)院，湖北 恩施 445000）

人皮膚鱗狀細(xì)胞癌（sSCC）和其他非黑色素瘤皮膚腫瘤是導(dǎo)致腫瘤相關(guān)死亡的原因之一[1]。流行病學(xué)調(diào)查表明，全世界20%以上的人群在一生中都有可能患皮膚腫瘤[2]。此外，在過(guò)去10年時(shí)間里sSCC發(fā)病率呈逐漸上升的趨勢(shì)，其治療主要依賴于手術(shù)、放療及化療聯(lián)合干預(yù)，而晚期或轉(zhuǎn)移性皮膚癌預(yù)后并不理想[3-5]。分子靶向干預(yù)是治療sSCC較好的選擇，這有助于發(fā)現(xiàn)新的腫瘤標(biāo)志物用于診斷和治療[6]。

跨膜受體蛋白NOTCH1通路是一種重要的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)形式，其關(guān)鍵作用是決定細(xì)胞類(lèi)型和分化[7]；在角質(zhì)形成細(xì)胞中，其誘導(dǎo)分化并抑制腫瘤的發(fā)展[8]。NOTCH1在角質(zhì)形成細(xì)胞中的缺失足以增加對(duì)皮膚癌形成的易感性[9-10]，并且隨著上皮內(nèi)和侵襲性鱗狀細(xì)胞癌（SCC）的發(fā)展，其真皮內(nèi)功能的喪失導(dǎo)致皮膚癌變[11]。NOTCH1下游信號(hào)CYFIP1是一種新的上皮癌侵襲抑制因子，已有學(xué)者提出在結(jié)腸癌、乳腺癌和肺癌組織中CYFIP1基因通常缺失[12]。因此，本研究旨在探討NOTCH1基因?qū)SCC細(xì)胞增殖和凋亡影響的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料及方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng) 非典型角質(zhì)形成細(xì)胞系（HaCaT）、sSCC細(xì)胞系（SCL-1和A431）購(gòu)自武漢巴菲爾生物有限公司。HaCaT、SCL-1和A431細(xì)胞均采用含10%胎牛血清（Gibco公司，美國(guó)）的DMEM培養(yǎng)基（ScienCell Research Laboratories公司，美國(guó)），在37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2 細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 陰性對(duì)照質(zhì)粒（NC）和NOTCH1 siRNA質(zhì)粒由武漢巴菲爾生物有限公司合成（武漢，中國(guó)）按照說(shuō)明書(shū)轉(zhuǎn)染至SCL-1和A431細(xì)胞。將NOTCH1 cDNA嵌入pcDNA3.1載體（EurofinsGenomics公司，德國(guó)）構(gòu)建pcDNA/NOTCH1表達(dá)載體，空載體（Empty vector）作為對(duì)照，并采用Lipofectamine 2000試劑將pcDNA/NOTCH1載體和空載體轉(zhuǎn)染至SCL-1和A431細(xì)胞，操作步驟嚴(yán)格按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量多聚核苷酸鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qRT-PCR）實(shí)驗(yàn) SCL-1和A431細(xì)胞中總的RNA由Trizol試劑（Invitrogen公司，美國(guó)）提取，并采用QuantiTect逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Qiagen公司，德國(guó)）合成cDNA。qRTPCR實(shí)驗(yàn)操作的終反應(yīng)體積為10 μL，包含5 μL的SsoFastTM EvaGreen Supermix試劑（Applied Biosystems公司，美國(guó)）、1 μL 引物、1 μL 的 cDNA 模板和3 μL 的 ddH2O。引物序列如下：NOTCH1，F(xiàn)：5’-CGTGCAGAGTGAGACCGTGGA-3’，R：5’-TGCGGTCTGTCTGGTTGTGCA-3’；Cyclin D1，F(xiàn)：5’-GAGTAGTGCGAAGCATAGGTCT-3’，R：5’-CTAGCAGAGTAGTCGAGCGC-3’；Bcl-2，F(xiàn)：5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGGTC-3’，R：5’-TGCATATTTGTTTGGGGCAGG-3’；MMP-2，F(xiàn)：5’-TGATCTTGACCAGAATACCATCGA-3’，R：5’-GGCTTGCGAGGGAAGAAGTT-3’。采用 7500 RT-PCR system（Applied Biosystems公司，美國(guó)）進(jìn)行PCR擴(kuò)增，循環(huán)條件如下：50℃ 2 min，95℃ 2 min，95℃ 3 s進(jìn)行 40個(gè)循環(huán)，60 ℃ 30 s。實(shí)驗(yàn)重復(fù) 3 次，并采用 2-ΔΔCT方法分析mRNA相對(duì)表達(dá)水平。

1.4 Western blot分析 收集細(xì)胞，每組加入200 μL的裂解液，置于冰上充分裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液，4℃條件下離心12 000 r/min離心半徑為15 cm，離心12 min，收集上清。二辛喹酸（BCA）蛋白定量試劑盒檢測(cè)了上清中總蛋白濃度，每孔上樣40 μg進(jìn)行電泳分離，恒壓70 V，電泳3 h。然后在恒流275 mA條件下電轉(zhuǎn)70 min，5%脫脂牛奶封閉1 h后，將目的條帶放入對(duì)應(yīng)的一抗溶液（稀釋比1∶1 000）中，4 ℃搖床孵育過(guò)夜。Tris-HCl緩沖鹽溶液+吐溫20洗膜緩沖液（TBST）洗膜3次，10 min/次，再把條帶放入盛二抗（稀釋比1∶3 000）的平皿中室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，10 min/次。加入4 mL的ECL顯影液顯色3 min，凝膠成像系統(tǒng)曝光。

1.5 細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn) 將各對(duì)數(shù)期細(xì)胞系接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至50%，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，每孔加入100 μL含10 μL的CCK8試劑的DMEM培養(yǎng)液，放入培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育1.5 h，在酶標(biāo)儀450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)細(xì)胞吸光度OD值，并計(jì)算細(xì)胞相對(duì)活力。計(jì)算公式如下：細(xì)胞相對(duì)活力（%）=OD實(shí)驗(yàn)組/OD對(duì)照組×100%。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè) 將各對(duì)數(shù)期細(xì)胞系接種于96孔板，每孔1×104個(gè)細(xì)胞，培養(yǎng)至50%，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒24 h后，棄去舊培養(yǎng)液，磷酸鹽緩沖液（PBS）清洗2次，采用2.0 mg/mL的PI染液和RNaseⅠ染色30 min，流式細(xì)胞儀立即檢測(cè)細(xì)胞周期分布情況。另外，收集細(xì)胞，PBS重懸后，分別加入Annexin-V FITC和PI處理細(xì)胞（按照試劑盒操作說(shuō)明書(shū)進(jìn)行），最后用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，組間兩兩比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 sSCC細(xì)胞中NOTCH1表達(dá)下調(diào) SCL-1和A431細(xì)胞中NOTCH1蛋白和mRNA表達(dá)水平相比于HaCaT細(xì)胞明顯降低，差異比較均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此提示，NOTCH1在sSCC細(xì)胞中起著抗腫瘤的作用。見(jiàn)圖1。

圖1 sSCC細(xì)胞癌細(xì)胞系中NOTCH1表達(dá)下調(diào)

2.2 NOTCH1過(guò)表達(dá)抑制sSCC細(xì)胞增殖 將pcDNA3.1/NOTCH1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SCL-1和A431細(xì)胞，NOTCH1蛋白和mRNA表達(dá)水平提示NOTCH1過(guò)表達(dá)組NOTCH1細(xì)胞活力相比于對(duì)照組明顯降低，而細(xì)胞凋亡率顯著升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖 2。

圖2 NOTCH1過(guò)表達(dá)誘導(dǎo)sSCC細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡

2.3 NOTCH1沉默誘導(dǎo)sSCC細(xì)胞增殖 實(shí)驗(yàn)將NOTCH1 siRNA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至SCL-1和A431細(xì)胞，提示NOTCH1沉默組（NOTCH siRNA）細(xì)胞活力相比于對(duì)照組（NC siRNA）明顯增高，而細(xì)胞凋亡率顯著降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖3。

圖3 NOTCH1沉默誘導(dǎo)sSCC細(xì)胞癌細(xì)胞增殖

2.4 NOTCH1調(diào)節(jié)下游CYFIP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)NOTCH1過(guò)表達(dá)和沉默對(duì)CYFIP1蛋白表達(dá)水平的影響 研究發(fā)現(xiàn)NOTCH1過(guò)表達(dá)能明顯誘導(dǎo)CYFIP1蛋白表達(dá)（P＜0.05），而 NOTCH1沉默則顯著抑制 CYFIP1蛋白表達(dá)（P＜0.05），見(jiàn)圖 4。

圖4 NOTCH1誘導(dǎo)CYFIP1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

2.5 NOTCH1調(diào)節(jié)CYFIP1靶基因表達(dá) NOTCH1過(guò)表達(dá)能明顯降低特異性周期蛋白（Cyclin）D1、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。NOTCH1沉默能明顯增高cyclin D1、Bcl-2和MMP-2 mRNA表達(dá)，與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)圖5。

圖5 NOTCH1調(diào)節(jié)cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)

3 討論

近年來(lái)，NOTCH1信號(hào)在腫瘤發(fā)生中的作用得到了充分的證實(shí)。然而，對(duì)于NOTCH1在sSCC中的作用機(jī)制研究較少。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)NOTCH1在sSCC細(xì)胞的表達(dá)水平下調(diào)，提示可能抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用[13]。研究還發(fā)現(xiàn)NOTCH1表達(dá)上調(diào)可通過(guò)激活下游靶標(biāo)CYFIP1信號(hào)，進(jìn)行抑制SCL-1和A431細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)其凋亡。這些結(jié)果表明，NOTCH1與單純性sSCC的發(fā)生密切相關(guān)。CYFIP1可誘導(dǎo)細(xì)胞Cyclin D1、細(xì)胞淋巴瘤蛋白（Bcl）-2及金屬基質(zhì)蛋白酶（MMP）-2等原癌基因的表達(dá)，從而改變腫瘤細(xì)胞的增殖、周期、凋亡和侵襲能力[14-15]。NOTCH1被認(rèn)為是CYFIP1轉(zhuǎn)導(dǎo)的正調(diào)節(jié)子，NOTCH1可與CYFIP1相互作用，進(jìn)而促使后者表達(dá)[12]。本研究發(fā)現(xiàn)NOTCH1過(guò)表達(dá)能明顯降低cyclin D1、Bcl-2和MMP-2蛋白表達(dá)，進(jìn)而抑制SCL-1和A431細(xì)胞增殖活力。

NOTCH1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)在角質(zhì)形成細(xì)胞中的促分化和抑制腫瘤的功能已經(jīng)得到證實(shí)。NOTCH1激活參與角質(zhì)形成細(xì)胞的細(xì)胞周期調(diào)控，可通過(guò)調(diào)節(jié)p63、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRF）家族成員及基底整合素的表達(dá)直接誘導(dǎo)該細(xì)胞分化[16]。本研究還表明NOTCH1信號(hào)參與調(diào)節(jié)sSCC細(xì)胞增殖能力通過(guò)CYFIP1。迄今為止，在結(jié)腸癌、肺癌和乳腺癌模型中，已證明CYFIP1能抑制腫瘤細(xì)胞侵襲；相比于正常組織，上述3類(lèi)特殊腫瘤中CYFIP1表達(dá)水平明顯降低[17]。本研究結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)NOTCH1的SCL-1和A431細(xì)胞系中CYFIP1表達(dá)水平也隨之增高，而沉默NOTCH1的sSCC細(xì)胞系中CYFIP1表達(dá)水平則明顯降低，說(shuō)明NOTCH1是CYFIP1的正向調(diào)節(jié)子。

據(jù)報(bào)道，NOTCH1可抑制多發(fā)性腫瘤的生長(zhǎng)[18-19]。NOTCH1低表達(dá)或沉默可促進(jìn)上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），進(jìn)一步導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞侵襲性和耐藥性升高[20]。此外，miR-3178通過(guò)靶向作用NOTCH1抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移[21]。因此，NOTCH1與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)，可作為腫瘤診斷和預(yù)后的一個(gè)有潛在價(jià)值的指標(biāo)。NOTCH1基因突變與腫瘤細(xì)胞凋亡過(guò)程密切相關(guān)[22]。本文發(fā)現(xiàn)NOTCH1在sSCC細(xì)胞中表達(dá)顯著降低，NOTCH1上調(diào)可抑制SCL-1和A431細(xì)胞的增殖、誘導(dǎo)其凋亡，NOTCH1下調(diào)則發(fā)揮相反的作用。上述研究結(jié)果也提示，NOTCH1在sSCC中起著抗腫瘤的作用。

總之，NOTCH1對(duì)sSCC有抑制腫瘤的作用。研究表明NOTCH1在sSCC細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，NOTCH1過(guò)表達(dá)抑制與CYFIP1通路激活相關(guān)的細(xì)胞增殖。本研究為進(jìn)一步認(rèn)識(shí)腫瘤的分子發(fā)病機(jī)制提供了新視角，并表明調(diào)控抗腫瘤基因NOTCH1表達(dá)可能是治療腫瘤的新策略。