基于網(wǎng)絡藥理學和分子對接技術的“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病作用機制的研究

李俊辰 ，申倩 ，馬育曉 ，林海月 ，張宇

（1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津醫(yī)科大學研究生院，天津 300070；3.天津市中醫(yī)藥研究院附屬醫(yī)院，天津 300120）

銀屑病是一種遺傳與環(huán)境共同作用誘發(fā)、免疫介導的慢性、復發(fā)性、炎癥性、系統(tǒng)性疾病，治療困難，常罹患終身[1]。目前，銀屑病在全球范圍內的發(fā)病率大約是0.1%～3.0%，且在持續(xù)升高，而發(fā)病機制尚未完全明確，因此全球對于銀屑病的研究仍在進一步探索[2]。

藥物配伍是中醫(yī)臨證組方過程中的重要環(huán)節(jié)之一，“藥對”就是藥物配伍的一種重要體現(xiàn)?！八帉Α蹦軌蛲ㄟ^藥物之間的配合而達到超過單味藥功效的效果[3]?！巴淋蜍?茵陳”藥對是中國中西醫(yī)結合治療皮膚病奠基人邊天羽教授治療銀屑病的常用“藥對”。銀屑病系列藥方以土茯苓、茵陳作為君藥，發(fā)揮清熱祛濕的作用，佐以其他藥物，臨床治療銀屑病的效果顯著[4]，因此，“土茯苓-茵陳”藥對是治療銀屑病的系列藥方中的核心組分，下文簡稱為核心組分。

中醫(yī)藥重視藥物之間的配伍關系，在臨床上常多種中藥同時使用發(fā)揮功效，而網(wǎng)絡藥理學有整體性、系統(tǒng)性等優(yōu)點，近年來廣泛應用于篩選中藥活性成分、闡釋中藥多成分、多靶點的作用機制、老藥新用、中藥方劑主成分與配伍關系等方面的研究[5]。本文將基于網(wǎng)絡藥理學的研究方法探索核心組分治療銀屑病的作用機制。

1 資料方法

1.1 核心組分化合物及作用靶點的篩選 釆用TCMSP（http：//lsp.nwsuaf.edu.cn/tcmsp.php），以土茯苓、茵陳為關鍵詞，口服生物利用度（OB）≥30%且類藥性（DL）≥0.18為標準，收集并篩選出核心組分的活性化合物及其作用靶點。

1.2 疾病靶點的確定 利用人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫（OMIM，https：//omim.org/）、Genecards（https：//www.genecards.org/）、PharmGkb（https：//www.pharmgkb.org/）以及藥物靶標數(shù)據(jù)庫（TTD，http：//bidd.nus.edu.sg/group/cjttd/）疾病數(shù)據(jù)庫，以銀屑病為關鍵詞，高相關性為標準，篩選匯總疾病的高關聯(lián)度靶點。

1.3 疾病-化合物共同靶點的篩選 利用VennPainter軟件，將核心組分化合物的作用靶點與疾病靶點取交集，篩選出二者共同的作用靶點。

1.4 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡的構建 將核心組分中的化合物、銀屑病以及二者的共同靶點蛋白上傳至 Cytoscape軟件（http：//www.cytoscape.org/）生成體現(xiàn)藥物-共同靶點-疾病相互作用的網(wǎng)絡圖，以探究核心組分的藥理學作用機制。

1.5 蛋白互作網(wǎng)絡（PPI）的構建 利用String（https：//string-db.org/）蛋白互作數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析共同靶點蛋白之間的相互作用，并用R語言進行計數(shù)分析。

1.6 基因功能注釋（GO）功能富集分析 利用Cytoscape軟件對共同靶點蛋白進行GO功能富集分析，以了解共同靶點蛋白在基因功能中的作用，通過Omicshare軟件（http：//www.omicshare.com/tools/index，php/）對結果進行可視化處理。

1.7 京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析 利用 David（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件將共同靶點進行KEGG通路富集分析，對共同靶點蛋白在信號通路中的作用做注釋分析，得到核心組分治療銀屑病的信號通路，通過Omicshare軟件對結果進行可視化處理。

1.8 主要化合物-共同靶點分子對接 為了進一步驗證靶點預測結果的可靠性，對篩選所得的主要化合物及主要相關靶點進行分子對接驗證。在蛋白質數(shù)據(jù)庫（http：//www.rcsb.org）下載主要相關靶點蛋白結構，在PubChem 數(shù)據(jù)庫（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）下載主要化合物結構，使用DockThor軟件將主要化合物與主要靶點進行分子對接。

2 結果

2.1 核心組分化合物及作用靶點的篩選 利用TCMSP分別查找核心組分的化合物及作用靶點，經(jīng)過整理，核心組分活性化合物共有26種，其中土茯苓15種、茵陳13種（二者共有的化合物為槲皮素、β-谷甾醇），見表1。查找核心組分中化合物的靶點，通過篩選，共有103個化合物作用靶點。

表1 核心組分中26個候選化合物的基本信息

2.2 疾病靶點及藥物-疾病共同靶點的確定 利用OMIM、Genecard、PharmGkb以及TTD疾病數(shù)據(jù)庫，匯總、去重后篩選出1 475個疾病靶點。結合化合物的103個靶點，利用VennPainter軟件，分析得出核心組分與銀屑病的共同靶點有44個。

2.3 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡的構建與分析 利用Cytoscape軟件構建藥物-共同靶點-疾病的網(wǎng)絡圖，見圖1。圖中一共有68個節(jié)點，包括1個銀屑病節(jié)點（紅色）、1個核心組分節(jié)點（黃色三角）、2個土茯苓、茵陳節(jié)點（黃色橢圓）、44個共同靶點的節(jié)點（粉色）、20個化合物節(jié)點（綠色），其中，有6種化合物由于與藥物-疾病共同靶點沒有聯(lián)系，因此未參與網(wǎng)絡的構建。在20種化合物中，包括土茯苓的9種化合物、茵陳的13種化合物，其中二者共同包含的化合物是槲皮素和β-谷甾醇，說明這2種化合物在核心組分組成中占到重要地位。調控的靶點數(shù)目排前5位的化合物是槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、異鼠李素，說明這些化合物在核心組分治療銀屑病中起主要作用。化合物調控的靶點數(shù)目前4位是前列腺素內過氧化物合酶（PTGS）-1、絲氨酸蛋白酶（PRSS）-1、過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARG）-γ、網(wǎng)狀內皮細胞過多癥病毒癌基因同源物（REL）-A，是核心組分治療銀屑病的主要靶點。

圖1 藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡

2.4 PPI網(wǎng)絡的構建與分析 利用String蛋白互作數(shù)據(jù)庫和Cytoscape軟件分析共同靶點蛋白之間的相互關系，選擇高可信度（0.700），并隱藏網(wǎng)絡中斷開連接的節(jié)點：ATP結合盒C亞家族成員（ABCC）-1、PRSS-1、乙酰膽堿酯酶（ACHE）。節(jié)點表示蛋白質，之間的連線表示蛋白質之間相互作用的證據(jù)，見圖2。PPI計數(shù)排名前3位的靶點是白細胞介素（IL）-6、血管內皮生長因子（VEGF）-A、表皮生長因子受體（EGFR），相互關系計數(shù)越多，說明該靶點在核心組分治療銀屑病中起更為重要的作用，見圖3。

圖2 PPI網(wǎng)絡

圖3 PPI計數(shù)

2.5 GO功能富集分析 對核心成分化合物和銀屑病的共同靶點進行GO功能富集分析，以錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）＜0.05為標準，確認了697條結果，利用Omicshare軟件對結果進行可視化處理，展示前20個共同的基因功能，見圖4。排名前5位的分別是對氧水平的反應、對缺氧的反應、對低氧水平的反應、對氧化應激的反應以及對活性氧代謝過程的反應。

圖4 GO功能富集

2.6 KEGG通路富集分析 對核心組分化合物與銀屑病的共同靶點利用DAVID數(shù)據(jù)庫進行KEGG通路富集分析，以P＜0.01，F(xiàn)DR＜0.05進行篩選，并將結果利用Omicshare軟件可視化，見圖5。信號通路主要包括在糖尿病并發(fā)癥中的晚期糖基化終產(chǎn)物（AGE）-晚期糖基化終產(chǎn)物受體（RAGE）信號通路、流體剪切損傷和動脈粥樣硬化通路、卡波西肉瘤相關的皰疹病毒感染通路、結腸癌通路、癌癥蛋白多糖通路、EGFR酪氨酸激酶抑制劑耐藥通路、腫瘤MicroRNAs通路、肝細胞癌通路、人巨細胞病毒感染通路、前列腺癌通路、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）-蛋白激酶 B（Akt）信號通路、低氧誘導因子（HIF）-1信號通路、腫瘤壞死因子（TNF）信號通路、乙型肝炎、絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）信號通路、酪氨酸激酶受體（ErbB）信號通路、松弛素信號通路、細胞程序性死亡-配體1（PD-L1）表達和程序性細胞死亡蛋白（PD）-1檢查點信號通路、麻疹、丙型肝炎。

圖5 KEGG通路富集分析

2.7 主要化合物-主要靶點分子對接 將主要化合物槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素與主要靶點IL-6、VEGF-A、EGFR兩兩組合，進行分子對接，見表2。根據(jù)DockThor結果顯示β-谷甾醇與IL-6，槲皮素、柚皮素與VEGF-A之間的分子結構無法實現(xiàn)對接，證明二者之間可能不存在相互作用。當配體與受體結合的構象越穩(wěn)定時，能量越低，發(fā)生作用的可能性越大，根據(jù)最低結合能的結果顯示，排名前3位的是槲皮素與EGFR、β-谷甾醇與EGFR、β-谷甾醇與VEGF-A，見圖6。

圖6 主要化合物與主要靶點對接示意圖

表2 主要化合物-主要靶點對接最低結合能（kcal/mol）

3 討論

3.1 核心組分主要化合物對銀屑病的作用 根據(jù)TCMSP分析結果顯示，核心組分包含活性化合物共有26種，其中土茯苓15種、茵陳13種（二者共有的化合物為槲皮素、β-谷甾醇）。根據(jù)藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡顯示，核心組分中起主要作用的化合物是槲皮素、β-谷甾醇、柚皮素、薯蕷皂苷元、異鼠李素。

已有研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病的主要病理改變是角質形成細胞的過度增殖[6]。Src家族酪氨酸激酶（SFK）是觸發(fā)細胞生長和分化信號通路的關鍵，研究發(fā)現(xiàn)，槲皮素能夠通過與SFK分子結合，調控角質形成細胞的生長[7]。β-谷甾醇的調控靶點數(shù)目僅次于槲皮素，其能夠抑制皮膚的炎性反應，減少TNF、IL-1β和IL-6的釋放，改善銀屑樣特征性皮損[8]。柚皮素可以抑制IL-6的過度表達，減輕銀屑病皮損部位的炎性反應[9]。此外，柚皮素可以降低銀屑病治療用藥甲氨蝶呤的肝毒性，減少不良反應[10]。薯蕷皂苷元能通過阻滯細胞周期和降低核因子（NF）-κB水平而抑制人永生化角質形成細胞生長，同時通過調節(jié)含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase）-3誘導細胞凋亡，并且通過抑制Toll樣受體（TLR）-4髓樣分化因子（Myd88）途徑下調促炎性細胞因子，此外，薯蕷皂苷元通過降低角質形成細胞中VEGFA的表達而部分抑制血管形成，因此，薯蕷皂苷元能從多個方面減輕銀屑病的發(fā)生和發(fā)展[11]。目前，異鼠李素對銀屑病的作用機制尚不明確，有研究發(fā)現(xiàn)異鼠李素有保護心腦血管、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、保護器官、預防肥胖等作用，相關機制包括調節(jié)PI3K-AKT、NF-κB、MAPK 等信號通路以及相關細胞因子和激酶的表達[12]。因此可推測異鼠李素可能通過抑制角質形成細胞的增殖，減輕皮損炎性反應來治療銀屑病，但具體機制還需要進一步實驗驗證。

3.2 核心組分與銀屑病主要共同靶點對銀屑病的作用 根據(jù)藥物-共同靶點-疾病網(wǎng)絡顯示，化合物調控的靶點數(shù)目前4位是PTGS-1、PRSS-1、PPAR-G、REL-A。

PTGS-1在銀屑病中的作用主要體現(xiàn)在導致血管內皮生成異常，和增強內皮的炎性反應2個方面[13-14]。PRSS-1是肽酶S1家族中的一員，S1家族在銀屑病的炎性反應中起重要作用，但PRSS-1對銀屑病的具體機制尚不明確，可能與炎性反應密切相關[15]。PPAR-G是PPAR脂肪酸代謝中的關鍵基因，研究發(fā)現(xiàn)，銀屑病患者的皮損組織與健康人皮膚組織相比，包含PPAR-G在內的7個PPAR脂肪酸代謝相關基因表達都降低，說明銀屑病的發(fā)生不僅與免疫相關，也與各種代謝途徑相關[16]。REL-A屬于NF-κB家族，研究發(fā)現(xiàn)，NF-κB能夠與TNF-α聯(lián)合作用影響銀屑病的發(fā)生發(fā)展[17]。

3.3 核心組分治療銀屑病的作用方向及信號通路 KEGG信號通路富集分析可以看出核心組分治療銀屑病的信號通路主要集中在氧水平、免疫反應、炎性反應、細胞增殖分化等方面。銀屑病的病理特征包括角質形成細胞異常增殖和/或關節(jié)滑膜細胞與軟骨細胞的炎性反應，以及微血管的異常新生，其中角質形成細胞的異常增殖，會導致表皮細胞對氧的需求增加。與健康人相比，銀屑病患者表皮組織的HIF-1α表達顯著增加[18]。獲得2019年諾貝爾生理學或醫(yī)學獎“氧感知通路”反映了生物體對氧的反應機制，同時也提示醫(yī)者銀屑病的發(fā)生發(fā)展是否與其有密不可分的關系。從現(xiàn)有的文獻來看，在皮膚損傷或感染后，病原體相關分子模式被TLR識別[19]。在角質形成細胞中，NF-κB被TLR激活，并易位至核內，以誘導人源抗菌肽（LL-37）和HIF-1α表達[20]。LL-37通過抑制泛素連接酶-E3對HIF-1α的水解，而增加HIF-1α的水平[21-23]。而后HIF-1α通過HIF-1α/VEGF/Akt/eNOS通路調節(jié)血管內皮細胞，促進血管生成，引發(fā)銀屑病[24-25]。另一方面，NF-κB與IL-36共同作用，通過IL-6影響Th17/Treg平衡產(chǎn)生更多的Th17細胞[26]。Th17細胞活化后通過STAT3/HIF-1α/RORγt/IL-17通路產(chǎn)生IL-17[27-28]。IL-17可通過調控絲聚合蛋白的表達，引起角質形成細胞的角化不全[29]。綜上所述，HIF-1α相關通路在角質形成細胞、血管內皮細胞與Th17細胞的病理改變中發(fā)揮了關鍵作用，進而引起了角質形成細胞異常增殖、血管新生異?；钴S與一系列炎性反應瀑布式級聯(lián)反應，因此，銀屑病的發(fā)生可能與HIF-1α相關通路密切相關。通過GO富集分析可以發(fā)現(xiàn)，核心組分治療銀屑病的作用主要體現(xiàn)在氧感知方面，同時KEGG富集結果中MAPK、HIF-1α、PI3K-AKT等信號通路均與氧感知相關，這說明核心組分對銀屑病的治療主要表現(xiàn)在對氧感知相關通路的調控上。

“土茯苓-茵陳”藥對是邊天羽教授治療銀屑病的系列藥方中的核心組分，臨床有良好的療效，但是藥理研究報道較少，本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法構建了“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病多成分-多靶點-多通路的復雜網(wǎng)絡關系，研究結果分析了“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病的活性成分和分子機制，為進一步開展“土茯苓-茵陳”藥對治療銀屑病作用機制的研究提供了科學依據(jù)。