不同玉米自交系的低氮應(yīng)答分析

徐金銘，金 戈，李 超，于曉明

（吉林農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，吉林吉林 132101）

0 引言

作物的高產(chǎn)和穩(wěn)產(chǎn)，離不開氮肥的生產(chǎn)和利用，甚至作物產(chǎn)量的50%左右都受到氮素的影響。玉米是高需氮作物，氮的吸收利用效率與玉米的產(chǎn)量直接相關(guān)?？赏ㄟ^發(fā)掘有效氮響應(yīng)基因和繁育低氮耐受玉米品種，提高貧瘠地區(qū)玉米產(chǎn)量[1]，氮肥的合理使用會(huì)極大為玉米生長提供充足的營養(yǎng)物質(zhì)，最終會(huì)決定作物的總產(chǎn)量[2]。農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常存在的現(xiàn)象是氮肥施用量大造成浪費(fèi)。使用的大量的氮肥不僅沒有使產(chǎn)量有實(shí)質(zhì)的提升，相反的是造成了極大的資源浪費(fèi)和對(duì)環(huán)境有了惡劣影響，這并不不利于農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展[3]。據(jù)統(tǒng)計(jì)，全球的氮肥消耗量中，中國超過1/3，且氮肥的使用嚴(yán)重超標(biāo)，更嚴(yán)重的是氮肥利用率偏低，只有30%左右[4]。分析玉米低氮耐受性形成的機(jī)理，提高玉米氮利用效率，是解決上述問題的關(guān)鍵。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究使用的試驗(yàn)材料為玉米自交系B73和Mo17。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 玉米低氮處理。對(duì)玉米在水培條件下進(jìn)行低氮條件培養(yǎng)（硝酸鹽作為唯一氮源）。挑選大小一致、子粒飽滿的種子，置于濕潤濾紙上25℃發(fā)芽48 h；芽生長至0.5 cm左右時(shí)，選擇出芽一致的種子去除胚乳，移入裝有改良的Hoagland營養(yǎng)液（KNO3濃度為5 mM）中培養(yǎng)5天，電動(dòng)氣泵每天通氣12 h；再分別以無氮（0mM KNO3）、低氮（0.5 mM KNO3）和正常（5 mM KNO3）營養(yǎng)液培養(yǎng)15天，然后稱量玉米植株的干重、氮含量等。

1.2.2 玉米生理指標(biāo)測定。我們檢測了在低氮（0.5 mM KNO3）和正常氮（5 mM KNO3）條件下生長的B73和Mo17的不同生理指標(biāo)，包括：總氮含量、硝酸還原酶（NR）活性、亞硝酸還原酶（NiR）活性。用Elementar isprime 100 vario EL（Elementar，German）測量總氮的量，使用Smartchem 450自動(dòng)化學(xué)分析儀（Unitscience，USA）測定硝酸鹽的含量。硝酸還原酶和亞硝酸還原酶活性檢測分別使用NR和NIR分析試劑盒（Plant）（Jonln，China）完成。

1.2.3 基因表達(dá)分析。對(duì)V1期玉米植株進(jìn)行正常氮（5 mM KNO3）和低氮處理（0.5 mM KNO3）24 h，提取植株總RNA。使用熒光實(shí)時(shí)定量PCR法，檢測玉米硝酸還原酶基因ZmNNR1和ZmNNR2。反轉(zhuǎn)錄和熒光實(shí)時(shí)定量PCR反應(yīng)參照Meng等人方法[5]，使用的內(nèi)參基因?yàn)閆mACT1。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氮濃度條件下玉米自交系的表型分析

對(duì)發(fā)芽后5天的玉米植株進(jìn)行不同濃度的氮處理：正常氮（5mM KNO3）、低氮（0.5mM KNO3）、無氮（0mM KNO3）處理，處理15天后比較兩個(gè)自交系之間的生物量和側(cè)根長。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，外源氮素的減少影響了B73和Mo17生物量的積累（圖1A）。值得注意的是，在正常氮和無氮條件下，自交系B73與Mo17的干重之間無明顯差異；而在低氮的情況下，自交系Mo17的干重顯著高于B73（圖1）。上述結(jié)果表明，Mo17在低氮條件下比B73具有更快的物質(zhì)積累速度。

2.2 不同氮濃度條件自交系的生理分析

硝酸鹽是植物可溶性蛋白質(zhì)和葉綠素合成的重要氮素來源，葉片總氮可以作為植物整體氮代謝狀態(tài)的評(píng)價(jià)指標(biāo)[7]。本研究對(duì)玉米葉片總氮含量檢測發(fā)現(xiàn)，在低氮（0.5mM KNO3）條件下，自交系Mo17與B73的總氮含量有顯著差異（P<0.05）；在正常氮（5mM KNO3）條件下，Mo17與B73的差異不顯著（圖1B）。

圖1?不同氮濃度條件下的玉米干重、硝酸還原酶活性與基因表達(dá)分析

我們進(jìn)一步分析了Mo17和B73中的硝酸還原酶活性，結(jié)果如圖1C所示，在正常氮條件下，Mo17與B73中的硝酸還原酶活性的差異不顯著；而在低氮條件下，Mo17的硝酸還原酶活性顯著高于B73。對(duì)亞硝酸還原酶活性的檢測發(fā)現(xiàn)，在低氮（0.5mM KNO3）條件和正常氮（5mM KNO3）條件下，Mo17與B73無顯著差異（圖1D）。上述結(jié)果表明，Mo17具有更高硝酸還原酶活性，從而使Mo17具有更高的氮利用效率。

2.3 不同氮條件下關(guān)鍵氮響應(yīng)基因表達(dá)分析

因?yàn)镸o17中具有較高的硝酸還原酶活性，因此我們檢測了Mo17和B73中的硝酸還原酶基因ZmNNR1和ZmNNR2的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在正常氮和低氮條件下，Mo17中的ZmNNR1和ZmNNR2表達(dá)水平都顯著高于B73（圖1E，F(xiàn)）。這個(gè)結(jié)果表明，Mo17中硝酸還原酶活性的提高可能是ZmNNR1和ZmNNR2的高表達(dá)造成的。

3 結(jié)語

玉米是我國最重要的大田糧食作物之一，也是一種研究較多的遺傳模式植物。本研究發(fā)現(xiàn)，玉米在低氮環(huán)境條件下，自交系Mo17的耐受性比B73明顯提高。在低氮條件下，Mo17體內(nèi)積累了更多的氮素，而且Mo17的干物質(zhì)積累速度也均快于B73。

植物根部吸收外源的硝酸根后，進(jìn)行還原反應(yīng)的第一步是在硝酸還原酶的作用下將硝酸根還原成亞硝酸根。本研究進(jìn)一步的生理分析發(fā)現(xiàn)，Mo17在低氮條件下具有更高的硝酸還原酶活性，這可能是Mo17對(duì)低氮的耐受性強(qiáng)于B73的主要原因。而且，對(duì)ZmNNR1和ZmNNR2基因表達(dá)的分析發(fā)現(xiàn)，Mo17中的ZmNNR1和ZmNNR2表達(dá)也顯著高于B73。因此，我們認(rèn)為Mo17表現(xiàn)出更強(qiáng)的低氮耐受性是由于其具有更高的硝酸還原酶基因表達(dá)水平，增強(qiáng)了體內(nèi)的硝酸還原酶活性，從而提高了Mo17的氮吸收效率。