生命素一號抗人胚肺MRC-5成纖維細(xì)胞衰老的機制

王金彩，陳陽，何琪楊

中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院醫(yī)藥生物技術(shù)研究所，北京，100050

隨著年齡的增加，人體出現(xiàn)生理功能和結(jié)構(gòu)的衰老性退化，對營養(yǎng)素的消化和吸收也發(fā)生明顯下降，從而影響如心腦血管疾病、糖尿病和癌癥等多種老年相關(guān)慢性病的發(fā)生和療效[1]。因此，及時有效地補充各種營養(yǎng)素顯得十分重要[2]。生命素一號（shengming-1,SM-1）就是為了上述目的而科學(xué)組合的1 種包含主要營養(yǎng)素的混合產(chǎn)品，其中含維生素E 和維生素B 等多種維生素，硒、鋅、鎂等微量和常量元素，蝦青素等天然抗氧化劑。

細(xì)胞衰老是人體整體衰老的基礎(chǔ)，是判斷干預(yù)產(chǎn)品是否有效的評價指標(biāo)[3-4]。從延緩細(xì)胞衰老角度，評價健康產(chǎn)品和功能食品的初步功效是一種有效、成本較低的方法，尤其適用于評價影響長壽和老年健康的產(chǎn)品[5]。為了更好地闡明SM-1 的健康功效，利用過氧化氫誘導(dǎo)的人胚肺MRC-5 成纖維細(xì)胞衰老模型，與標(biāo)準(zhǔn)的抗氧化劑乙酰半胱氨酸-acetylcysteine,NAC）作為陽性比較[6]，評價SM-1 的抗細(xì)胞衰老作用。

1 材料和方法

1.1 實驗材料和試劑 SM-1 由仁德康泰（天津）健康管理有限公司提供（編號RDKT-SMS-2021.03.06），溶于二甲基亞砜+乙醇（50%+50%）的混合液中，配制成終濃度為50 mmol/L 的母液。NAC（S1623）購自美國Selleck 公司，溶于無菌水中。配成終濃度為100 mmol/L 的母液，儲存在-20 ℃冰箱中備用。過氧化氫（H2O2，貨號75-91-2）購自ALDRICH Chemistry，使用前配制。

細(xì)胞衰老-半乳糖苷酶染色試劑盒（C0602）購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司。熒光染料DCFHDA（D6883）和碘化丙錠（PI，P4107）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。DCFH-DA 配制成濃度為5 mmol/L 的母液，分裝后儲存在-20 ℃冰箱中備用。細(xì)胞增殖檢測試劑盒（Cell counting kit-8(CCK-8)，B34304) 購自美國Bimake 公司。蛋白濃度測定液（#500-0205）和化學(xué)發(fā)光液（ClarityTMWestern ECL Substrate）購自美國BIO-RAD 公司。胎牛血清(10099-141)、MEM 培養(yǎng)基（C11095500BT）、0.25%的胰蛋白酶(25200-72)和HBSS 緩沖液（C14175500BT）購自賽默飛世爾科技（中國）有限公司。

1.2 細(xì)胞來源和培養(yǎng) 人胚肺MRC-5 成纖維細(xì)胞購自美國模式生物保藏中心（ATCC）。在含10%胎牛血清的MEM 培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為5% CO2、溫度為37 ℃。

1.3 實驗方法

1.3.1 CCK-8 法檢測細(xì)胞增殖 取對數(shù)生長期的細(xì)胞，以4 000 個/孔的密度接種于96 孔板，24 h 后使用藥物處理，培養(yǎng)72 h，檢測方法同前[7]。在450 nm 處測定光密度值。細(xì)胞存活率= (藥物處理組背景組/ (對照組-背景組× 100%。在GraphPad Prism 5 中繪制細(xì)胞存活率曲線。

1.3.2 蛋白免疫印跡法 將細(xì)胞以40 萬/孔接種于60 mm的培養(yǎng)皿中，24 h 后使用SM-1 或NAC 處理細(xì)胞24 h。收集細(xì)胞，細(xì)胞裂解，測定蛋白濃度，12.5%SDSPAGE 凝膠分離蛋白，轉(zhuǎn)膜及抗體溫育，圖像檢測的方法同前[7]。兔抗P16 抗體（1∶1 000，ab51243）購自美國Abcam 公司、P-21（1∶1 000，#2947）購自美國Cell Signal Technology 有限公司, 小鼠抗P53 抗體（1∶1 000，sc-126）購自美國Santa Cruz Biotechnolongy 公司。抗兔二抗（1∶1 000，HS101-01）和抗小鼠二抗（1∶1 000，HS201）購自北京轉(zhuǎn)基因生物技術(shù)有限公司。

1.3.3 衰老細(xì)胞的染色 把對數(shù)生長期細(xì)胞以2 萬/孔接種于12 孔板中，24 h 進行實驗。使用SM-1 或NAC預(yù)處理細(xì)胞2 h，然后加入H2O2處理1 h，吸去藥液，使用無血清MEM 培養(yǎng)基洗2 遍，繼續(xù)在細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d，然后換新鮮培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)2 d。衰老細(xì)胞染色按照廠家提供的方法進行，在37 ℃溫箱中孵育過夜。換成PBS 溶液，在倒置顯微鏡下觀察和拍照，按照300 個細(xì)胞含藍(lán)色細(xì)胞數(shù)作為衰老細(xì)胞陽性率。

1.3.4 活性氧自由基（reactive oxidative species, ROS）的檢測 把對數(shù)生長期的細(xì)胞以30 萬/孔傳于6 孔板中，培養(yǎng)24 h 后，進行相關(guān)處理，染色方法同前。染料DCFH-DA 的終濃度為10，染色30 min，用胰酶消化細(xì)胞，離心收集細(xì)胞。使用流式細(xì)胞儀檢測熒光強度，然后使用FlowJo 7.6.1 分析相對熒光強度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)分析 使用SPSS19.0 統(tǒng)計軟件進行分析數(shù)據(jù)。實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，為3 次實驗結(jié)果的平均值。＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 SM-1 具有促進MRC-5細(xì)胞增殖的作用 由于SM-1是一種多種營養(yǎng)素的混合物，本實驗選擇了較大范圍的濃度處理細(xì)胞，較高濃度200對細(xì)胞增殖有輕微的抑制作用，細(xì)胞存活率為95.2%（圖1 A），與對照組相比較（設(shè)定為100%），低于100 g/mL SM-1對細(xì)胞增殖均有一定的促進作用，在10 g/mL 時該作用更明顯（圖1 A）。

圖1 生命素一號促進MRC-5 細(xì)胞的增殖作用

在細(xì)胞培養(yǎng)中，胎牛血清的含有促進細(xì)胞增殖的生長因子，為探究SM-1 是否具有與生長因子類似的作用，本實驗降低血清濃度以觀察SM-1 對細(xì)胞增殖的影響。結(jié)果表明，在2.5%、5%血清濃度下，SM-1對細(xì)胞增殖沒有明顯的促進作用；而在10%血清濃度下，10、20 g/mL SM-1 均有較明顯促進增殖作用（圖1 B）。本實驗也進一步驗證了圖1 A 的促進增殖作用的結(jié)果。

2.2 SM-1 具有較強的抗H2O2抑制細(xì)胞增殖的作用 使用預(yù)處理的方法，觀察SM-1 的作用。陽性化合物NAC 單獨處理細(xì)胞可以促進細(xì)胞增殖＜0.05），10 mol/L NAC 可將細(xì)胞存活率提升10.4%。NAC 處理有明顯的抗H2O2引起的增殖抑制作用，40 mol/L H2O2單獨處理后細(xì)胞存活率為49.6%，NAC 可恢復(fù)細(xì)胞增殖，且有濃度依賴性，最高可將細(xì)胞存活率提升至65.9%＜0.001)（圖2A）。80 mol/L H2O2處理的情況下，NAC 也有一定的抗H2O2抑制增殖作用，但無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。

選擇低質(zhì)量濃度（10 g/mL 以下）的SM-1 對H2O2引起的細(xì)胞增殖抑制的影響。SM-1 單獨處理細(xì)胞也可以促進細(xì)胞增殖，10 g/mL SM-1 可將細(xì)胞存活率最高提升14.4%＜0.001)。SM-1 預(yù)處理有明顯的抗H2O2引起的增殖抑制作用，40 mol/L H2O2單獨處理后細(xì)胞存活率為49.6%，SM-1 可將細(xì)胞存活率提高16.3%，且有濃度依賴性＜0.05)（圖2B）。80 mol/L H2O2處理組與NAC 處理結(jié)果有所不同，SM-1有一定的抗H2O2抑制增殖作用，且高濃度組具有統(tǒng)計學(xué)差異＜0.05)。

圖2 SM-1 具有較強的抗H2O2 抑制細(xì)胞增殖的作用

2.3 SM-1 抑制H2O2誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞衰老的作用衰老細(xì)胞通常體積變大，并表達高活性的-半乳糖苷酶，使用X-Gal 為底物，在-半乳糖苷酶的催化下生成深藍(lán)色產(chǎn)物，在光學(xué)顯微鏡下很容易觀察到陽性細(xì)胞。如圖3A 所示，SM-1 或NAC 單獨處理時，細(xì)胞衰老不明顯。H2O2單獨處理會使細(xì)胞膨大，誘導(dǎo)細(xì)胞衰老，被染成藍(lán)色的衰老細(xì)胞明顯增多。而加SM-1后，與NAC 作用類似，被染成藍(lán)色的衰老細(xì)胞數(shù)量明顯變少，80 mol/L H2O2單獨處理最多可誘導(dǎo)24.7%的細(xì)胞發(fā)生衰老，SM-1 處理將衰老細(xì)胞在降至11%左右。統(tǒng)計陽性細(xì)胞是數(shù)目也表明：SM-1 能明顯地減少H2O2誘導(dǎo)的衰老細(xì)胞數(shù)量（圖3B），具有抗細(xì)胞衰老的作用。

圖3 SM-1 明顯減少H2O2 引起的衰老細(xì)胞數(shù)量

2.4 SM-1 對H2O2誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞活性氧自由基的作用 細(xì)胞衰老過程中，往往是ROS 的升高。經(jīng)過H2O2短暫處理，加SM-1 或NAC 繼續(xù)處理細(xì)胞24 h,使用ROS 的特異熒光染色，流式細(xì)胞儀檢測分析表明：陽性化合物NAC 具有明顯的降低ROS 的作用。SM-1 單獨處理對ROS 的水平無明顯影響，H2O2單獨處理可引起ROS 明顯增加，而加SM-1 處理后可降低H2O2引起的ROS 水平，說明SM-1 具有降低ROS 的作用（圖4）。

圖4 SM-1 降低H2O2 引起的ROS 水平

2.5 SM-1 對H2O2誘導(dǎo)的MRC-5 細(xì)胞相關(guān)衰老蛋白的影響 除了上述指標(biāo)變化外，本研究進一步使用蛋白免疫印跡法分析SM-1 對衰老相關(guān)蛋白的影響。與NAC 作用類似，SM-1 單獨處理對衰老相關(guān)蛋白表達的影響不大，但能明顯降低H2O2誘導(dǎo)的p53，p16 和p27 的表達水平（圖5），說明SM-1 的抗細(xì)胞衰老作用與相關(guān)蛋白表達下降相關(guān)。

圖5 SM-1 降低H2O2 引起的衰老相關(guān)蛋白的表達

3 討論

通過細(xì)胞增殖實驗、衰老細(xì)胞特異染色、活性氧自由基分析及衰老相關(guān)的蛋白表達變化等指標(biāo)表明：生命素一號具有一定的抗細(xì)胞衰老作用。其作用機制與抗氧化及降低衰老相關(guān)的蛋白表達相關(guān)。從抗細(xì)胞衰老角度，本研究結(jié)果進一步說明了生命素一號營養(yǎng)素組方的合理性和科學(xué)性，為人體應(yīng)用提供了可靠的實驗依據(jù)。

本研究使用了標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑NAC，這是抗氧化實驗最常用的化合物，也是臨床治療疾病的藥物[6]。從增殖抑制指標(biāo)看，SM-1 的作用效果與NAC 相當(dāng)，說明SM-1 的組合具有較好的促進健康的優(yōu)勢。在檢測NAC 的抑制ROS 變化時，并不是隨著NAC 濃度的增加，ROS 的水平明顯下降（結(jié)果未顯示）。細(xì)胞增殖實驗也表現(xiàn)出相似的趨勢，過高濃度的NAC 反而增加H2O2的抑制細(xì)胞增殖作用，SM-1 也具有相似的作用特征。為了真實反映SM-1 的作用特征，通過預(yù)實驗確定合適的作用濃度是十分關(guān)鍵的，無論對陽性藥物NAC 還是檢測的化合物均是如此。

從細(xì)胞增殖指標(biāo)判斷，較低濃度的SM-1 單獨處理細(xì)胞，具有一定的促進細(xì)胞增殖的效應(yīng)＜0.01）（圖1～2），該作用特征能有效解釋該混合物的多功能作用特點。聯(lián)系到NAC 也有此作用（圖2），在以前的報道中發(fā)現(xiàn)富硒麥芽粉水溶液單獨處理細(xì)胞，也有促進細(xì)胞增殖的效應(yīng)[7]，提示這可能是具有抗細(xì)胞衰老的營養(yǎng)素或藥物的一個標(biāo)志性特征。這是否可以作為普遍的特征，有待檢測更多的化合物后才能完全確定。

SM-1 含有多種成分，如微量元素硒、多種維生素等。近年來的研究發(fā)現(xiàn)營養(yǎng)素對改善慢性病的治療和患者康復(fù)具有巨大的作用。微量元素硒對改善人體健康有多方面的作用，具有抗病毒、抗腫瘤、延長壽命等功能[8]。近期發(fā)現(xiàn)硒還能明顯改善小鼠的卒中癥狀[9]，說明其作用的多效性。癌癥是目前臨床治療未被滿足要求的重大慢性病，近年來發(fā)現(xiàn)許多營養(yǎng)素如絲氨酸、甘露糖等影響癌癥患者的腫瘤進展及治療效果，展示了從營養(yǎng)素角度改善癌癥治療的誘人前景[10]。

本研究結(jié)果確定了生命素一號具有抗細(xì)胞衰老效應(yīng)，促進細(xì)胞增殖等作用，其機制與抗氧化及抑制衰老相關(guān)的蛋白相關(guān)。因本實驗只是細(xì)胞的體外實驗，需要動物和人體實驗進一步證明。本研究結(jié)果可為生命素一號在中老年人群中的應(yīng)用及其輔助減輕慢性病等作用提供科學(xué)依據(jù)。