馬鈴薯鮮粉污染菌的分離鑒定及抑制物篩選

魏雄博，白永宏，鮑壹江，王亞潔，劉 乾，任建芳，陳國梁，1b

（1.延安大學(xué)，a.生命科學(xué)學(xué)院；b.陜西省紅棗重點實驗室，陜西 延安 716000；2.延安職業(yè)技術(shù)學(xué)院，陜西 延安 716000）

在中國，粉條有千余年的加工歷史，其含有豐富的碳水化合物、膳食纖維、蛋白質(zhì)及鈣、鎂、鐵、鉀、磷、鈉等礦物質(zhì)，口感爽滑、老少皆宜，有和胃、健脾、益氣之功效，深受廣大消費者喜愛，在大眾飲食中占據(jù)十分重要的地位［1，2］。但是干粉在食用時要提前浸泡，食用不便，與現(xiàn)代快節(jié)奏生活不相適應(yīng)。冷鮮淀粉食品近年來在超市中越來越多見，在各大城市中鮮粉條也正在被消費者所接受，但鮮粉因其高水分，易發(fā)生變質(zhì)，而保質(zhì)期短，致使其銷售半徑小，貨架期短，對產(chǎn)品的生產(chǎn)、銷售及安全食用帶來了不利的影響［3］。因此，探究引起鮮粉變質(zhì)的菌類并找到相應(yīng)的抑制物，對于其生產(chǎn)、銷售具有重要的指導(dǎo)意義，而有關(guān)這方面的研究鮮見報到。為了篩選出合適的抑菌物，根據(jù)以往文獻報道及前期研究的結(jié)果，篩選出柑橘精油、八角茴香精油、雙乙酸鈉和山梨酸鉀4種抑菌物。植物精油這一天然保鮮劑其抗氧化性、抑菌活性常用于延長食品的保鮮及食品口感、風(fēng)味的改良［4，5］，研究表明柑橘精油和八角茴香精油有良好的殺菌、殺蟲、抗氧化等生物活性［6-9］，從而能夠保護食品免受氧化變質(zhì)，而且其食品安全性已經(jīng)獲美國食品藥品管理局準(zhǔn)許應(yīng)用于食品領(lǐng)域［10］。雙乙酸鈉和山梨酸鉀是新型高效的防霉、防腐劑，且無毒副致癌、致病因素，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于國內(nèi)外食品工業(yè)［11-14］。本研究開展馬鈴薯鮮粉中易染菌分離鑒定及抑制物篩選研究，以期為鮮粉條產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

各種污染變質(zhì)的真空包裝馬鈴薯鮮粉，由陜西省榆林市定邊縣潤澤署業(yè)開發(fā)有限公司提供；2種已鑒定保藏的馬鈴薯鮮粉易染菌種（芽孢桿菌屬、埃希氏菌屬），由延安大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院提供。

雙乙酸鈉、山梨酸鉀均為食品級，上海羅恩試劑有限公司；PCR試劑盒，北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；八角茴香及柑橘，購于農(nóng)貿(mào)市場。

1.2 試驗方法

1.2.1 細菌分離純化 在無菌環(huán)境下取一定量的各類污染變質(zhì)鮮粉條，剪碎、加無菌生理鹽水充分搖晃，作為污染菌原液，然后接種到牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上，在28℃下恒溫培養(yǎng)24～48 h。從中挑選出生長形態(tài)和顏色不同的單菌落，再在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基上進行劃線、分離純化。重復(fù)試驗，直至獲得單一菌落為止。

1.2.2 菌株的鑒定

1）生理鑒定。根據(jù)菌落形狀、色澤等外在形態(tài)，初步篩出單菌落，并采用革蘭氏染色法進行染色后在顯微鏡下觀察鑒定［15］。

2）16SrDNA PCR擴增。將篩選出的單菌落培養(yǎng)至對數(shù)期作為擴增模板，擴增引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGC TCAG-3’）、1492R（5’-GG?TACCTTGTTACGACTT-3’）［16］。PCR反應(yīng)體系（25 μL）：DNA模板2.5μL，Taq酶0.5μL，Buffer 2.5μL，dNTP 2μL，引物各1μL，ddH2O 15.5μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5 min，95℃變性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸1 min 30 s，30個循環(huán)，72℃補充延伸10 min，4℃保存。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并對特異性擴增條帶進行回收，將擴增產(chǎn)物交西北大學(xué)太白校區(qū)國家微生物檢測中心測序。

3）系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建。獲得DNA序列后，在NC?BI網(wǎng)站上（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）進行核酸數(shù)據(jù)比對分析，并用MEGA 5.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹［17］，對其進行歸類。

1.3 抑菌試驗

1.3.1 抑菌物的篩選及制備 八角茴香精油粗提物的制備：取一定量干八角茴香于圓底燒瓶中加入去離子水（料液比1∶7），在160 W功率下微波提取30 min，得到無色揮發(fā)油，用無水Na2SO4干燥，4℃儲藏備用［18］。

柑橘精油粗提物的制備：將新鮮橘皮洗凈、烘干、粉碎，稱取一定量置于蒸餾瓶中，加去離子水（料液比1∶16）及適量NaCl作為萃取助劑［19］，提取2.5 h，將收集的餾出物經(jīng)由石油醚萃取后水浴除去石油醚，即柑橘精油粗提物。

將2種精油粗提物、雙乙酸鈉、山梨酸鉀，按照質(zhì)量分?jǐn)?shù)配成10%、20%、30%、40%、50%濃度梯度溶液，其中精油粗提物用無水乙醇作溶劑，雙乙酸鈉和山梨酸鉀用無菌去離子水作溶劑。

1.3.2 抑菌效果的測定 采用濾紙片法測定抑菌效果，以十字交叉法測量抑菌圈大小。用無水乙醇、無菌去離子水做空白對照。抑菌圈直徑（mm）=樣品抑菌圈直徑－空白對照，3次重復(fù)試驗，取平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 菌株的鑒定

2.1.1 菌株的生理鑒定 對分離出的菌株經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色，初步篩選獲得4種菌株，分別為L-1、L-2、L-3和L-4。由表1可知，L-1菌落顏色為粉紅色，L-2菌落顏色為淡黃色，L-3和L-4菌落顏色為乳白色。L-1、L-2、L-4三株菌為桿狀菌，L-3為球狀菌。4種菌株菌落均不透明，且都為革蘭氏陽性菌。

表1 4種菌株形態(tài)及理化特征

2.1.2 菌落PCR鑒定 以細菌的通用引物27F和1492R作為上下游引物，對馬鈴薯鮮粉貯藏期分離出的4株病原細菌的16s rDNA進行擴增，擴增得到的電泳檢測結(jié)果只得到了L-2菌株的清晰穩(wěn)定條帶，片段約為1 500 bp（圖1）。

圖1 L-2菌株16Sr DNA電泳圖譜

2.1.3 16SrRNA序列比對 將得到的測序序列用DNA-MAN軟件進行拼接，得到所測樣本的DNA序列后，在NCBI網(wǎng)站中進行BLAST蛋白質(zhì)序列比對。經(jīng)序列比對，該序列與多條已知的短小桿菌屬（Cur?tobacterium）序列同相似性達到了99%～100%（表2），根據(jù)16SrRNA序列相似性達到99%以上則認(rèn)為是同一個種［20］，由此可以初步判定該DNA序列所代表的細菌L-2為短小桿菌屬。根據(jù)序列的對比結(jié)果，利用MEGA 5.0軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹，進行系統(tǒng)發(fā)育學(xué)分析［21］。從圖2可以看出，該菌隸屬于短小桿菌屬分支，這與序列比對分析結(jié)果一致。

圖2 L-2菌株根據(jù)16Sr DNA序列構(gòu)建的系統(tǒng)育樹

表2 L-2菌株DNA BLAST對比結(jié)果

2.2 添加物的抑菌效果

通過濾紙片法用短小桿菌屬（C-1）、埃希氏菌屬（E-2）、芽孢桿菌屬（B-3）測試5種不同濃度的添加物抑菌效果。由表3可知，添加物溶液濃度與抑菌效果密切相關(guān)，4種抑菌物對3種菌的抑制圈直徑都隨著抑菌物濃度增加而增大，其中同等濃度下雙乙酸鈉對3種菌抑制效果最好。八角茴香精油、柑橘精油對于短小桿菌屬的抑制作用隨濃度增加提升較小，雙乙酸鈉和八角茴香精油對埃希氏菌屬抑制效果隨著濃度增加抑制效果增幅較大。4種抑菌物對病原菌抑菌效果依次為雙乙酸鈉>八角茴香油>山梨酸鉀>柑橘精油。

3 小結(jié)

從污染的馬鈴薯鮮粉中篩選得到一株病原菌，經(jīng)過16SrDNA分子鑒定并建立系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定該菌屬于短小桿菌屬（Curtobacterium）。而污染馬鈴薯鮮粉的病原菌可能與加工方式、包裝技術(shù)、保藏時間等有關(guān)系［22，23］，所以引起馬鈴薯鮮粉污染的菌株種類、數(shù)量有待進一步分離鑒定。經(jīng)過抑菌圈數(shù)據(jù)對比，同等濃度下雙乙酸鈉對供試的3種易染菌的抑菌圈平均直徑均大于其他3種抑菌物，其作為天然抑菌劑有比較好的研究前景，可進一步作為添加物進行鮮粉保鮮貯藏試驗。