一株多重耐藥產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的分離鑒定及生物學(xué)特性的研究

王寧寧，李曉月，劉澤文，劉 威，高 婷，周丹娜，楊克禮，郭 銳，梁 婉，陳文杰，貝為成，田永祥，袁芳艷

（1.湖北省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽細(xì)菌病防治制劑創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/畜禽病原微生物學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，武漢 430064；2.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)/生豬養(yǎng)殖協(xié)同中心，武漢 430070；3.廣西揚(yáng)翔股份有限公司，廣西 貴港 537106）

產(chǎn)腸毒素性大腸桿菌（Enterotoxigenic Escherichia coli，ETEC）屬于腸桿菌科埃希氏菌屬成員，為革蘭氏陰性的直桿菌，無芽孢，有菌毛，主要分為F4（K88）、F5（K99）、F6（987P）和F41四種。腸毒素分為不耐熱腸毒素（LT）和耐熱腸毒素（ST）兩種。在動(dòng)物中，只有豬源菌株能同時(shí)產(chǎn)生LT和ST，其他菌株僅產(chǎn)生ST。ETEC是引起仔豬大腸桿菌性腹瀉的最常見的流行病原體，是一類引起人和幼畜（初生仔豬、犢牛、羔羊）腹瀉的重要病原菌，初生幼畜被ETEC感染后，常因劇烈水樣腹瀉和迅速脫水而死亡，發(fā)病率和死亡率均很高，給養(yǎng)殖行業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。在ETEC眾多血清型中，K88血清型流行最為廣泛［1，2］。

本研究從湖北省某養(yǎng)豬場采集腹瀉豬腸道樣品，進(jìn)行細(xì)菌分離鑒定，通過菌落形態(tài)、PCR檢測等進(jìn)行鑒定，分離到產(chǎn)腸毒素大腸桿菌，進(jìn)一步通過耐藥性檢測，表明分離菌株對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑等青霉素類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類耐藥。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 病料 取自湖北省某豬場腹瀉仔豬的腸道樣品。

1.1.2 試劑 麥康凱瓊脂培養(yǎng)基、LB瓊脂培養(yǎng)基、LB肉湯培養(yǎng)基等，按常規(guī)方法配制。革蘭氏染色液、Vazyme 2×Taq Master Mix、DL2000 DNA Maker購自寶生物工程（大連）有限公司；細(xì)菌藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司。

1.2 細(xì)菌分離純化培養(yǎng)

用無菌鑷子取腸道組織病料，劃線接種于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)18～24 h，挑取單個(gè)粉紅色疑似菌落繼續(xù)劃線，于麥康凱瓊脂培養(yǎng)基中進(jìn)行純化培養(yǎng)。

1.3 細(xì)菌鏡檢

參考文獻(xiàn)［3］，對疑似菌株進(jìn)行革蘭氏染色，并用光學(xué)顯微鏡進(jìn)行細(xì)菌形態(tài)觀察。

1.4 分子生物學(xué)鑒定

1.4.1 引物合成 所用引物參考劉澤文等［8］合成大腸桿菌PCR引物進(jìn)行，由擎科生物技術(shù)有限公司合成。引物序列如表1所示。

表1 引物序列

1.4.2 可疑菌株DNA提取 挑取可疑菌落接種于LB肉湯中，37℃振蕩培養(yǎng)18～24 h。處理菌液，收集上清液作DNA模板，并以大腸桿菌K88株作陽性對照，無菌水作陰性對照。

1.4.3 PCR擴(kuò)增 參考Vazyme 2×TaqMaster Mix使用說明書。PCR反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性3 min；94℃變性30 s；52℃退火30 s；72℃延伸1 min，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min，取適量PCR樣品進(jìn)行瓊脂凝膠電泳檢測。

1.5 細(xì)菌生長曲線

挑取平板上單菌落接種于LB營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，37℃搖床中培養(yǎng)過夜。將該菌液1∶1 000接種于新鮮培養(yǎng)基，將培養(yǎng)基置于37℃搖床中，每隔1 h取出，吸取100μL，用酶標(biāo)儀測定OD600nm，設(shè)置3個(gè)重復(fù)，繪制細(xì)菌的生長曲線。

1.6 藥敏試驗(yàn)

采用K-B藥敏紙片擴(kuò)散法進(jìn)行細(xì)菌藥敏試驗(yàn)，挑取單菌落于LB肉湯培養(yǎng)基中，37℃搖床培養(yǎng)過夜。第二天1∶100接種于新鮮培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)至OD為0.6時(shí)，制備細(xì)菌懸液，并均勻涂布于LB營養(yǎng)瓊脂平板中，將藥敏紙片貼于平板表面，重復(fù)3個(gè)平行，37℃培養(yǎng)18～24 h，測量抑菌圈大小。

2 結(jié)果與分析

2.1 分離菌株的培養(yǎng)特性

由圖1可知，菌落在麥康凱瓊脂培養(yǎng)基上呈現(xiàn)出粉紅色圓形菌落、邊緣整齊、表面光滑濕潤。

圖1 分離菌株在麥康凱培養(yǎng)基的培養(yǎng)結(jié)果

革蘭氏染色鏡檢顯示為單個(gè)或成對存在，無芽孢，有菌毛，粉紅色的兩端鈍圓短小桿菌，該細(xì)菌為革蘭氏陰性桿菌，呈無規(guī)則雜亂排列（圖2）。

圖2 分離菌株的革蘭氏染色結(jié)果

2.2 PCR鑒定結(jié)果

從平板挑取菌落接入LB肉湯培養(yǎng)基中，提取菌株DNA作為模板，分別用大腸桿菌K88、K99、987P引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析后，分離菌株用K88引物擴(kuò)增出目的條帶，且與預(yù)期片段大小相符，其他引物擴(kuò)增結(jié)果均為陰性（圖3）。BLAST序列比對結(jié)果表明，分離菌株序列與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌同源性最高。利用產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌毛保守基因進(jìn)行了進(jìn)化樹分析，表明分離菌株K88-HB202001與產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88同源性在98.05%～99.51%，表明所分離菌株為產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88，命名為K88-HB202001（圖4）。

圖3 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

圖4 分離菌株基因進(jìn)化樹

2.3 生長曲線

從圖5可以看出，分離株產(chǎn)腸毒素大腸桿菌K88-HB202001在10 h后進(jìn)入生長平臺(tái)期，細(xì)菌濃度趨于穩(wěn)定，與對照菌株ETECK88生長趨勢一致。

圖5 生長曲線結(jié)果

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)，結(jié)果表明，菌株K88-HB202001，敏感藥物主要為喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類，占比38%，尤其對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定敏感；中度敏感藥物主要是多肽類、硝基呋喃類、氨基糖苷類，占比31%，主要為恩諾沙星、氧氟沙星、新霉素、多粘菌素B、呋喃唑酮等；耐藥藥物主要為青霉素類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類，占比31%，主要有阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑等（表2）。

表2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 小結(jié)與討論

在自然界中，大腸桿菌廣泛存在于人和動(dòng)物腸道、呼吸道以及土壤、水、農(nóng)產(chǎn)品中，是一類重要的人畜共患病原菌［4-9］。當(dāng)人或動(dòng)物機(jī)體抵抗力下降或當(dāng)攜帶某些毒力因子的大腸桿菌侵入腸道和呼吸道外組織或其他器官時(shí)，就會(huì)引起感染。其中產(chǎn)腸毒素大腸桿菌是引起新生和斷奶仔豬腹瀉的最重要的病原之一，所引起的動(dòng)物腹瀉類疾病嚴(yán)重影響畜牧業(yè)生產(chǎn)和發(fā)展［10-13］。本研究采集臨床腹瀉仔豬的腸道，通過選擇性培養(yǎng)基、菌落形態(tài)、革蘭氏染色及PCR擴(kuò)增與測序等方法對細(xì)菌進(jìn)行了鑒定，表明分離菌株為產(chǎn)腸毒素型大腸桿菌K88。

近年來，抗生素的不規(guī)范使用，不斷有新耐藥菌株產(chǎn)生的報(bào)道，且多重耐藥現(xiàn)象也愈來愈嚴(yán)重，嚴(yán)重危害畜產(chǎn)品安全和人類健康，對中國畜牧業(yè)的發(fā)展和公共衛(wèi)生安全造成一定的影響。吳翠蓉等［14］通過對四川、廣西、貴州等地區(qū)的調(diào)查，發(fā)現(xiàn)大腸埃希菌呈現(xiàn)出耐藥性強(qiáng)、耐藥譜廣的現(xiàn)象，對四環(huán)素的耐藥率甚至高達(dá)100%，分析可能與四環(huán)素類藥物在中國使用時(shí)間較長、應(yīng)用范圍較廣有關(guān)。湯景元等［16］對規(guī)模養(yǎng)豬場分離的480株大腸桿菌進(jìn)行19種抗菌藥物的藥敏試驗(yàn)，50%的菌株耐13種抗生素，14株對19種抗生素全部耐藥。于阿芳［17］利用24種常用抗生素對山東省分離的76株大腸桿菌進(jìn)行了耐藥性研究，發(fā)現(xiàn)菌株對AM耐藥性最強(qiáng)，其次是TE、FFC、KAN、GM，對頭孢類藥物比較敏感。本研究選用16種常見抗生素對所分離菌株K88-HB202001進(jìn)行了藥物敏感性試驗(yàn)，結(jié)果顯示分離菌株K88-HB202001對阿莫西林、氨芐西林、氟苯尼考、四環(huán)素、多西環(huán)素、磺胺異惡唑等青霉素類、四環(huán)素類、氯霉素類、磺胺類藥物耐藥，對環(huán)丙沙星、諾氟沙星、卡那霉素、慶大霉素、頭孢拉定等喹諾酮類、氨基糖苷類、頭孢類藥物敏感，為豬場選取精準(zhǔn)藥物進(jìn)行疫病治療提供了依據(jù)［18-20］。