基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的核桃防治老年癡呆功能成分及其作用靶點(diǎn)研究

許成梅，陳 丹，徐冬月，趙慶宇婧，林玉萍，趙聲蘭

（1.云南中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，昆明 650500；2.云南省煙草質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)站，昆明 650106；3.昆明海關(guān)技術(shù)中心，昆明 650200）

阿爾茨海默?。ˋlzheimer′s Disease，AD）俗稱老年癡呆（dementia），是一種發(fā)生于中老年的以進(jìn)行性認(rèn)知障礙和記憶能力下降為主的退行性神經(jīng)病變，是繼心腦血管疾病和惡性腫瘤之后，老年人致殘、致死的第三大疾病。中國(guó)60歲以上的人口中，70%～80%伴有不同程度的健忘和癡呆，是世界上患者人數(shù)最多的國(guó)家［1］，嚴(yán)重危害和影響國(guó)人健康。AD的發(fā)病機(jī)制至今尚不明確，中醫(yī)理論認(rèn)為“以腎虛髓虧為本，痰瘀阻滯為標(biāo)，五臟失調(diào)，腦髓失用”為老年癡呆之病機(jī)［2］。傳統(tǒng)健腦藥食同源核桃（Jug?lansregiaL.）仁營(yíng)養(yǎng)豐富，古典記載“胡桃仁頗類其狀”［3］，藥典收載的功能為“補(bǔ)腎，溫肺，潤(rùn)腸，用于腎陽(yáng)不足、腰膝酸軟、陽(yáng)痿遺精、虛寒喘嗽、腸燥便秘”［4］，可用于防治老年癡呆［5-7］。核桃成分復(fù)雜多樣，本研究通過(guò)網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析核桃防治AD的作用成分及其靶點(diǎn)和機(jī)制，為核桃仁用于老年病癡呆防治提供更多的科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 核桃活性成分及潛在靶點(diǎn)的篩選

通過(guò)TCMSP（Traditional Chinese Medicine Sys?tems Pharmacology）（http：//tcmspw.com/tcmsp.php）數(shù)據(jù)庫(kù)［8］和相關(guān)文獻(xiàn)獲得核桃的化學(xué)成分及相應(yīng)潛在靶點(diǎn)?？诜锢枚龋∣B）反映藥物口服進(jìn)入體循環(huán)的比例［9］，類藥性（DL）是根據(jù)混合物的結(jié)構(gòu)和性質(zhì)表征成藥特性，用于藥物發(fā)現(xiàn)早期的初篩［10］。通常以O(shè)B≥15%和DL≥0.18作為篩選標(biāo)準(zhǔn)。此外，血腦屏障（BBB）是大腦與身體其他部位之間的高度選擇性物理屏障，但它也阻止了許多治療藥物進(jìn)入大腦參與反應(yīng)，從而使疾病的治療很困難。因此，它也是藥物選擇的重要參數(shù)。但隨著年齡的增長(zhǎng)以及神經(jīng)血管和神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生，血腦屏障的通透性會(huì)有所增加［11］。

1.2 AD靶點(diǎn)搜集

使 用GeneCards（https：//www.genecards.org/）、TTD（Therapeutic Target Database）（https：//db.idrblab.org/ttd/）和OMIM（https：//omim.org/）3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)［12］，以“Alzheimer′s Disease”和“dementia”為關(guān)鍵詞搜索老年癡呆相關(guān)靶點(diǎn)，將3個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的靶點(diǎn)進(jìn)行歸并得到老年癡呆的靶點(diǎn)，以評(píng)分≥5為篩選條件，獲得AD相關(guān)靶點(diǎn)。

1.3 潛在靶點(diǎn)分析

將核桃的潛在靶點(diǎn)與AD相關(guān)的靶點(diǎn)通過(guò)R3.6.2軟件取交集，即為核桃作用于AD的潛在靶標(biāo)。

1.4 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

將交集靶點(diǎn)信息整理成Excel軟件中的格式導(dǎo)入網(wǎng)絡(luò)可視化軟件Cytoscape3.7.2（http：//cytoscape.org/，v3.7.2）構(gòu)建核桃“活性成分-藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖，并運(yùn)用Meta-analysis和Network Analyzer插件分析網(wǎng)絡(luò)拓?fù)鋮?shù)：選取節(jié)點(diǎn)度（Degree）前三位的活性成分為主要活性成分［13］，進(jìn)一步了解核桃活性成分與AD相關(guān)靶點(diǎn)的相互作用關(guān)系。目前，STRING（Search Tool for Recurring Instances of Neigh?bouring Genes）是蛋白質(zhì)相互作用覆蓋種類最多的數(shù)據(jù)庫(kù)［14］，將交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING（https：//stringdb.org/）在線分析平臺(tái)以獲得蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)（Protein Protein Interaction Network，PPI）。蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用評(píng)分的置信度設(shè)置為0.900，并隱藏?zé)o相互作用的蛋白。將獲得的PPI數(shù)據(jù)導(dǎo)出為T(mén)SV文件格式并導(dǎo)入到Cystoscape 3.7.2軟件繪制網(wǎng)絡(luò)圖，利用Metascape和CytoNCA插件對(duì)其進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，包括度中心性（DC）、特征向量（EC）、中介中心性（BC）、接近中心性（CC），各值越大代表該點(diǎn)在網(wǎng)絡(luò)圖中越重要，取DC、EC、BC、CC值大于其2倍中位數(shù)進(jìn)行關(guān)鍵靶點(diǎn)篩選［15］。

1.5 GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析

使用DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO功能富集和KEGG信號(hào)通路分析。主要進(jìn)行細(xì)胞、分子和生物三方面功能富集分析，以統(tǒng)計(jì)學(xué)超幾何分布定量（P）評(píng)估相關(guān)性，設(shè)置P<0.01。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃活性成分篩選結(jié)果

以O(shè)B%≥15%，DL≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)獲得核桃活性成分14種。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道核桃中許多其他成分可改善記憶衰退，預(yù)防AD，如芥子酸（Sinapic acid）、咖啡酸（Caffeic acid）、兒茶素（Catechin）、褪黑素（Melatonin）、丁香酸（Syringic acid）、槲皮素（Quercetin）、α-亞麻酸（alpha-Linolenic acid）、香豆酸（Coumaric acid）、亞油酸（Linoleic acid）、阿魏酸（Ferulic acid）、油酸（Oleic acid）、沒(méi)食子酸（Gallic acid）、維生素E（Vitamin E）、綠原酸（Chlorogenic acid）和蘆?。≧utin）（OB：64.15%、54.97%、54.83%、52.96%、47.78%、46.43%、45.01%、43.29%、41.90%、39.56%、33.13%、31.69%、14.26%、13.61%、3.20%；DL：0.08、0.05、0.24、0.11、0.06、0.28、0.15、0.04、0.14、0.06、0.14、0.04、0.55、0.31、0.68）［16-26］。綜合數(shù)據(jù)庫(kù)搜索和文獻(xiàn)報(bào)道，最終獲得核桃活性成分29種（表1）。

表1 核桃潛在活性成分

2.2 核桃作用于AD的潛在靶點(diǎn)

基于所獲得的29種化合物進(jìn)行搜索，得到鞣花酸、2，2′，3，3′，4，4′-四甲氧基-6，6′-聯(lián)苯二甲酸二甲酯、α-亞麻酸、咖啡酸、兒茶素、綠原酸、香豆酸、阿魏酸、沒(méi)食子酸、亞油酸、褪黑素、油酸、槲皮素、蘆丁、芥子酸、丁香酸和維生素E共17種化合物具有潛在靶點(diǎn)365個(gè)。從GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)獲得2 645個(gè)與AD相關(guān)的靶點(diǎn)基因（評(píng)分≥5）。通過(guò)R3.6.2軟件將AD相關(guān)靶點(diǎn)基因和核桃的成分潛在靶點(diǎn)相交，結(jié)果顯示核桃成分的159個(gè)潛在靶標(biāo)與AD相關(guān)（表2）。

表2 核桃成分中與AD相關(guān)的潛在靶點(diǎn)

2.3 網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建

通過(guò)Cytoscape 3.7.2軟件構(gòu)建核桃“活性成分-藥物-疾病-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖1）。該網(wǎng)絡(luò)包含278個(gè)節(jié)點(diǎn)，核桃活性成分17個(gè)，作用靶點(diǎn)159個(gè)，423條相互作用的邊。作用靶點(diǎn)最多的成分為槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸；受最多化合物作用的靶點(diǎn)為前列腺素過(guò)氧化物合成酶（PTGS1/2）、視黃酸受體（RXRA）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、單胺氧化酶（MAOB）和一氧化氮合酶（NOS3）等。表明核桃通過(guò)多成分、多靶點(diǎn)共同作用來(lái)防治AD。

圖1 核桃活性成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)

續(xù)表2

將159個(gè)靶基因輸入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行分析，獲得靶點(diǎn)蛋白相互作用關(guān)系網(wǎng)絡(luò)（圖2）。關(guān)鍵蛋白為RAC-α絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶（AKT1）、絲裂原激活蛋白激酶1（MAPK1）、轉(zhuǎn)錄因子AP-1（JUN）、轉(zhuǎn)錄因子p65（RELA）、白介素-6（IL6）等（圖2）。這些蛋白可能在核桃防治AD中起關(guān)鍵作用。

圖2 蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用（PPI）網(wǎng)絡(luò)圖（上）和關(guān)鍵蛋白排序（下）

2.4 GO功能富集分析

采用DAVID數(shù)據(jù)庫(kù)，對(duì)核桃的159個(gè)AD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行細(xì)胞、分子和生物3個(gè)方面功能進(jìn)行富集分析（P<0.01）（圖3）。其中，細(xì)胞成分主要涉及細(xì)胞外間隙（P=2.19E-24）、胞外區(qū)（P=3.01E-12）、細(xì)胞溶質(zhì)（P=9.45E-09）、質(zhì)膜（P=7.85E-07）和小窩（P=1.47E-06）等；分子功能主要涉及酶結(jié)合（P=5.03E-19）、相同的蛋白質(zhì)結(jié)合（P=2.20E-16）、蛋白質(zhì)同二聚化活性（P=3.22E-14）、蛋白質(zhì)異二聚化活性（P=1.00E-11）和蛋白質(zhì)結(jié)合（P=4.88E-11）等；生物過(guò)程主要包括對(duì)藥物的反應(yīng)（P=1.91E-23）、老化（P=4.10E-18）、對(duì)缺氧的反應(yīng)（P=1.62E-16）、細(xì)胞增殖的正調(diào)控（P=4.15E-16）和凋亡過(guò)程的負(fù)調(diào)控（P=4.15E-16）等，表明相關(guān)靶點(diǎn)通過(guò)調(diào)控不同生物學(xué)功能作用于AD。

圖3 GO功能富集結(jié)果

2.5 KEGG通路分析

對(duì)核桃的159個(gè)AD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG通路富集分析（P<0.01），篩選得到160條相關(guān)通路，前30條重要通路見(jiàn)圖4。其中，尿病并發(fā)癥中的AGERAGE信號(hào)通路（P=7.88E-25）、流體剪切應(yīng)力與動(dòng)脈粥樣硬化（P=6.40E-22）、PI3K-Akt信號(hào)通路（P=5.93E-16）、白細(xì)胞介素-17信號(hào)通路（P=3.77E-15）、HIF-1信號(hào)通路（P=4.91E-15）、TNF信號(hào)通路（P=8.51E-15）可能為核桃不同成分作用于AD的關(guān)鍵通路。

圖4 KEGG通路分析結(jié)果

3 討論

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)以系統(tǒng)生物學(xué)為基礎(chǔ)，系統(tǒng)闡述藥物成分與機(jī)體相互作用的原理與規(guī)律，可用來(lái)預(yù)測(cè)中藥單體［27］或復(fù)方［28］的各有效成分及其作用靶點(diǎn)和參與的相關(guān)通路，探索藥物與疾病間的關(guān)聯(lián)性，解釋中藥治療疾病的作用機(jī)制。本研究應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法篩選得到核桃17種活性成分具有AD相關(guān)的潛在靶點(diǎn)159個(gè)，主要為酚類、脂肪酸、黃酮類化合物。槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸等顯示出較強(qiáng)的靶向作用，均可改善認(rèn)知，延緩記憶衰退。槲皮素可減輕大鼠記憶障礙，其機(jī)制可能與調(diào)節(jié)海馬和前額葉皮質(zhì)中Copine 6和TREM1/2的BDNF相關(guān)表達(dá)失衡有關(guān)［26］。鞣花酸具有神經(jīng)保護(hù)作用，它可以改善AD相關(guān)的認(rèn)知障礙，可能是由RAC-ine絲氨酸/蘇氨酸-蛋白激酶/糖原合酶激酶3β（AKT1/GSK3β）信號(hào)介導(dǎo)的［22］。本研究獲得的PTGS1/2、RXRA、RELA、MAOB和NOS3可能是AD的關(guān)鍵靶點(diǎn)。RXR是膽固醇合成和代謝的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑，RXRA是核配體激活的轉(zhuǎn)錄因子家族的成員，AD患者的膽固醇代謝會(huì)發(fā)生改變，RXRA基因變異可能通過(guò)影響腦膽固醇代謝而成為AD的危險(xiǎn)因素［29］。在AD的淀粉樣斑塊周圍可觀察到反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞，反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)MAOB異常而產(chǎn)生抑制性膠質(zhì)遞質(zhì)GABA，在AD模型小鼠的齒狀回釋放的GABA通過(guò)作用于突觸前GABA受體而降低顆粒細(xì)胞的刺激率；在AD患者死后，腦中GABA和MAOB顯著上調(diào)，選擇性抑制GABA的合成或釋放可能是治療AD記憶障礙的有效策略［30］。認(rèn)知障礙大鼠白細(xì)胞介素-1（IL-1）、腫瘤壞死因子ɑ（TNF-ɑ），誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）的表達(dá)顯著增加，且炎癥因子水平與Aβ42沉積呈正相關(guān)［31］，所涉及的靶點(diǎn)均為本研究中發(fā)現(xiàn)的AD相關(guān)重要靶點(diǎn)。

KEGG通路分析獲得的一條重要通路為尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE信號(hào)通路，AD與糖尿病關(guān)系密切，具有相似的病理改變，被稱為“第3種糖尿病”［32］。研究表明，糖尿病腦病的特點(diǎn)是認(rèn)知障礙、神經(jīng)化學(xué)和結(jié)構(gòu)異常，可通過(guò)下調(diào)BACE1、抑制AGE/RAGE軸和腦內(nèi)炎癥進(jìn)行改善［33］。PI3K/Akt信號(hào)通路通過(guò)發(fā)揮抗氧化、抗炎和神經(jīng)保護(hù)作用而在調(diào)節(jié)AD中起重要作用［34］。β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積是AD的發(fā)病機(jī)制之一，AD的發(fā)生與缺氧有一定關(guān)系。在分子水平上，缺氧應(yīng)答主要靠HIF-1進(jìn)行調(diào)節(jié)和介導(dǎo)，HIF-1的高表達(dá)可以通過(guò)與BACE1啟動(dòng)子結(jié)合，繼而誘導(dǎo)BACE1的表達(dá)并導(dǎo)致Aβ水平升高［35］。

盡管目前AD的發(fā)病機(jī)制尚不明確，核桃的健腦功能也有待開(kāi)發(fā)，但借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究顯示核桃可從多成分、多靶點(diǎn)、多途徑協(xié)同干預(yù)AD的發(fā)生和發(fā)展，其中作用靶點(diǎn)最多的成分為槲皮素、油酸、鞣花酸、蘆丁和阿魏酸，受最多化合物作用的靶點(diǎn)為前列腺素過(guò)氧化物合成酶、視黃酸受體、轉(zhuǎn)錄因子p65、單胺氧化酶和一氧化氮合酶，為核桃防治AD的功能成分和靶點(diǎn)機(jī)制提供了數(shù)據(jù)和理論支持。