稗子用于微生物源生物除草劑篩選的研究

張志剛，王開梅，吳兆圓，萬中義，方 偉

（湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心/湖北省農(nóng)業(yè)科技創(chuàng)新中心生物農(nóng)藥分中心，武漢 430064）

水稻田稗子［Echinochloa crusgalli（L.）Beauv］是一種難防單子葉雜草，受子粒較大、幼苗生長快、幼苗株型較大、敏感性差等不利因素的影響，在針對單子葉雜草的除草劑篩選中很少被利用。由于微生物源生物除草劑常具有較嚴格的專一性，所以微生物源生物除草劑篩選不宜用模式植物來替代防治目標，必須以目標雜草作為篩選靶標［1，2］。直接使用稗子進行微生物源生物除草劑篩選，可以提高篩選的針對性，減少漏篩［3，4］。由于微生物源生物除草劑使用帶有培養(yǎng)基的活菌發(fā)酵液進行篩選，篩選過程中極易因雜菌污染引起假陽性，而稗子生長快、幼苗株型較大、對雜菌污染不敏感的特點在微生物源生物除草劑篩選中成為優(yōu)點，可以降低假陽性率，并且延長可觀察時間［5，6］。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 稗子種子 水稻田稗子種子由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供，試驗所用種子保存在冷庫中，保存溫度為4℃，該種子在低溫保藏前已經(jīng)過春化處理，發(fā)芽率大于95%；馬唐［Digitaria san?guinalis（L.）Scop.］種子由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心養(yǎng)蟲室提供，試驗所用種子保存在冷庫中，保存溫度為4℃，該種子在低溫保藏前已經(jīng)過春化處理，發(fā)芽率大于70%。

1.1.2 培養(yǎng)基 瓊脂粉由北京鼎國昌盛生物技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)，型號DH010-4。培養(yǎng)土、珍珠巖均為市售。

1.1.3 試劑及標準樣品 用于種子表面處理的試劑有75%乙醇、2%次氯酸鈉溶液；常用溶劑有乙醇、無菌水、吐溫-80，以上試劑均為市售分析純試劑；化學(xué)除草劑標準樣品為硝磺草酮（98%）；微生物源生物除草劑為放線菌H-39、真菌H-76。

1.1.4 發(fā)酵液 放線菌和真菌發(fā)酵液由湖北省生物農(nóng)藥工程研究中心微生物資源研究室提供。培養(yǎng)基配方編號為HB-M-15。

1.1.5 主要儀器、設(shè)備 DH-S10手持式組織勻槳機、旋轉(zhuǎn)振蕩器、電子移液器（MCE8k）、96孔組織培養(yǎng)板（深孔）、手持式噴霧槍（噴頭出口直徑0.5、1.5、2.5 mm）、日光燈管組（光照強度為4 000～10 000 lx可調(diào)）、人工氣候室（光照時間、溫度可調(diào)）、無菌操作臺、游標卡尺、7 cm方形塑料花盆。

1.2 方法

1.2.1 稗子和馬唐種子表面處理及篩選用培養(yǎng)板制備 稱取60 g稗子種子，置于500 mL三角燒瓶中，先用75%乙醇浸泡30 s，再用2%次氯酸鈉溶液浸泡10 min，最后用無菌水反復(fù)振蕩、浸洗3次以上，在無菌操作臺中自然干燥備用［7］。馬唐種子處理方法同稗子種子。把經(jīng)過高壓滅菌后0.7%的瓊脂加入到96孔組織培養(yǎng)板（深孔），每孔加入量0.4 mL，冷卻后備用。把處理過的種子轉(zhuǎn)接到瓊脂表面，稗子接入種子量為6～8粒種子/孔，馬唐接入種子量為10～12粒種子/孔［8，9］。

1.2.2 小型盆栽準備 采用小型盆栽的方法［10］，把培養(yǎng)土和珍珠巖按3∶1的體積比混合均勻，邊攪拌邊加適量水。分裝到7 cm方形塑料花盆中，備用。將“1.2.1”中處理過的種子播種到花盆的四角區(qū)域，馬唐和稗子各占2個角，每個角上播種量均為10粒。噴適量水，覆透光膜培養(yǎng)。培養(yǎng)條件：溫度25℃，相對濕度70%～80%，每日光照12 h，光照強度6 000 lx。培養(yǎng)3 d后揭膜，檢查種子出芽情況，盆中各角只保留7株長勢良好的實生苗，備用。

1.2.3 不同苗齡的盆栽及96孔板準備 按照“1.2.2”的方法，分別在同一花盆中播種2種雜草。每天播種10盆，根據(jù)需要連續(xù)播種數(shù)天，得到不同苗齡的盆栽。按照“1.2.1”的方法，分別在96孔板中接入雜草的種子，每天分別接種3板，連續(xù)播種5 d后，得到0～4 d不同苗齡的96孔組織培養(yǎng)板［11，12］。苗齡定義：播種當天加入試驗樣品，苗齡為0 d；播種1 d后加入試驗樣品，苗齡為1 d；播種2 d后加入試驗樣品，苗齡為2 d。依此類推。

1.2.4 稗子和馬唐在水瓊脂表面涂布法中對除草劑標準樣品的敏感性試驗

1）活性評價指標。根據(jù)活性反應(yīng)的不同，使用分級指標數(shù)（0、3、5、7、9）標記除草活性［13］。

2）對除草劑標準樣品的敏感性試驗。根據(jù)需要把各標準樣品配制成母液，以含0.1%吐溫-80的無菌水稀釋成12個不同的濃度梯度。在組織培養(yǎng)板中加入不同量的各梯度樣品液。各組織培養(yǎng)板中瓊脂表面涂布樣品溶液量為0.060 mL/孔，按“1.2.1”的方法分別接入稗子和馬唐種子。每個濃度設(shè)2個復(fù)孔，重復(fù)試驗3次。培養(yǎng)條件：溫度25℃，相對濕度70%～80%，每天光照9 h，光照強度6 000 lx。7 d后檢查并記錄結(jié)果，計算LC50。

1.2.5 稗子和馬唐在小型盆栽噴霧法篩選中對除草劑標準樣品的敏感性試驗

1）活性評價指標。試驗7 d測量并記錄對照組及試驗組株高，統(tǒng)計抑制率。為了便于持續(xù)觀察與測量，本試驗測量的株高值為植株地上部分的高度，葉片枯死部分長度不計入株高，植物死亡株高記為0。

2）不同苗齡的稗子和馬唐對標準菌株的敏感性試驗［14，15］。由于本次試驗選用的化合物標準樣品引起的作用是葉片黃化，所以對不同苗齡的盆栽噴霧試驗只使用了標準菌株。以標準菌株的發(fā)酵液作為起始濃度，用吐溫-80和無菌水稀釋成適當?shù)臐舛?。根?jù)預(yù)備試驗結(jié)果，放線菌H-39直接使用發(fā)酵液，吐溫-80在樣品中終濃度為0.1%；真菌H-76稀釋到發(fā)酵液的0.4倍（0.4F），吐溫-80在樣品中終濃度為0.1%。噴霧樣品量為1.5 mL/盆。每次試驗設(shè)7株幼苗。重復(fù)試驗3次。培養(yǎng)條件同“1.2.4”。7 d后檢查并記錄結(jié)果，統(tǒng)計平均株高抑制率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同苗齡稗子和馬唐在水瓊脂表面涂布法中對除草劑標準樣品的敏感性

在化學(xué)除草劑篩選和除草劑活性生物測定中，馬唐幼苗因株型較小且生長較慢，是一種被廣泛選用的單子葉雜草模式靶標。由表1可知，就內(nèi)吸性除草劑硝磺草酮而言，隨著苗齡增加，馬唐和稗子的敏感度降低，但降低的幅度有所不同。馬唐在苗齡0、1、2 d時，其LC50基本保持在同一水平，分別為0.000 70、0.000 73、0.000 77 mg/mL，苗齡3、4 d時LC50約為前一苗齡的1倍；稗子在苗齡0、1 d時，LC50保持在同一水平，分別為0.002 80、0.002 70 mg/mL，苗齡2、3、4 d時LC50與0、1 d相比有較大幅度增加，分別約為苗齡0、1 d時的4、8、14倍。稗子苗齡為0 d時，化學(xué)除草劑硝磺草酮LC50為0.002 8 mg/mL，約為相同苗齡馬唐LC50的4倍。就生物除草劑而言，同樣隨著苗齡增長，馬唐和稗子的敏感性都呈下降趨勢。其中對馬唐活性較低的生物除草劑H-39，其最高濃度（發(fā)酵液）對苗齡為0 d的稗子只顯示微弱的活性，無法統(tǒng)計LC50。對馬唐活性較高的生物除草劑H-76，稗子苗齡為0 d時，其LC50為0.470 0 mL/mL，約為相同苗齡馬唐LC50的15倍。由此可見，與馬唐相比較，稗子在水瓊脂表面涂布法篩選中的敏感性低，不宜用于生物除草劑的資源篩選。

表1 除草劑標準樣品對不同苗齡稗子和馬唐的LC50（7 d）

2.2 不同苗齡稗子和馬唐在小型盆栽噴霧法篩選中對生物除草劑標準樣品的敏感性

2.2.1 不同苗齡稗子和馬唐株高和葉片數(shù)的增長特點 單子葉雜草的葉長增長和葉寬增長并不同步，如圖1a、圖1b所示。新葉生長前期，稗子苗齡2～5 d和馬唐苗齡2～4 d，新葉快速伸長引起株高快速增長。新葉生長中期葉長伸長速度變慢，稗子苗齡5～6 d和馬唐苗齡4～5 d，而葉寬快速增長。新葉生長后期，稗子苗齡6～7 d和馬唐苗齡5～7 d，葉長和葉寬增長趨于停止。至下一片新葉長出，新葉又重復(fù)上述長勢。新葉生長初期，葉形細長，對樣品藥液吸附差，噴霧后葉片上藥液附著量少。

圖1 不同苗齡稗子和馬唐株高和葉片數(shù)的增長特點

2.2.2 不同苗齡稗子和馬唐在小型盆栽噴霧法篩選中對生物除草劑標準樣品的敏感性 根據(jù)單子葉雜草株高增加較快的特點，本試驗選擇株高抑制率作為活性評價指標。由圖2可以看出，1～21 d苗齡的稗子和馬唐對生物除草劑標準樣品的敏感性呈規(guī)律性變化。低苗齡的稗子和馬唐對生物除草劑都不敏感。隨著苗齡的增長，稗子和馬唐對生物除草劑的敏感性漸增，達到峰值后開始漸減。且馬唐對生物除草劑標準樣品的敏感期較稗子長。以株高抑制率大于40%的苗齡持續(xù)時間為基準，H39和H76對馬唐的有效天數(shù)分別為16 d和13 d，H39和H76對稗子的有效天數(shù)均為6 d。馬唐對標準樣品的活性反應(yīng)較稗子強，生物除草劑標準樣品對馬唐和稗子的株高抑制率峰值分別約為80%和60%。

圖2 生物除草劑對稗子和馬唐株高的抑制率

3 小結(jié)與討論

由于生物除草劑具有專一性和更強的選擇性，所以生物除草劑的篩選相對于化學(xué)除草劑的篩選，優(yōu)先考慮的是篩選靶標和防治對象的一致性，其次才是選擇具有高敏感性的模式靶標。稗子是中國水稻田最重要的惡性雜草，在田間藥效試驗中是必選的防治對象，但在除草劑資源篩選中卻鮮被選擇。因此，針對稗子的除草劑研究過程缺失了一個重要的環(huán)節(jié)——資源篩選。本試驗結(jié)果表明，與常用除草劑資源篩選的模式靶標馬唐相比，稗子對除草劑的敏感性較低。尤其是在用于除草劑高通量篩選的96孔微孔板法中，生物除草劑對稗子的抑制率約為馬唐LC50的15倍以上。較低的敏感性引起的直接后果是活性樣品檢出率低，造成資源的浪費。但是在小型盆栽噴霧法試驗中，生物除草劑標準樣品對馬唐和稗子的株高抑制率比較接近，抑制率的峰值分別約為80%和60%。應(yīng)用小型盆栽噴霧法，在精準控制苗齡的前提下，稗子在除草劑資源篩選中的敏感性可以達到與常用模式靶標——馬唐的敏感性接近，這是以稗子為防治目標的生物除草劑資源篩選的一個轉(zhuǎn)機。在田間防效試驗中，稗子的敏感性高于馬唐［16，17］。主要與試驗對象的苗齡有關(guān)。在室內(nèi)除草劑資源篩選中，為了提高篩選通量和試驗的可操作性，常選用苗齡較低的雜草進行試驗。由于大于21 d苗齡的稗子株型較大，不適于實驗室操作，所以本試驗選擇的苗齡是1～21 d。21 d苗齡以后，是否還存在對微生物源生物除草劑高敏感的波峰還有待進一步研究。