基于傾向性評分匹配探討miR-145-5p表達(dá)水平與小兒難治性癲癇的關(guān)系

龍?zhí)O蘋，范嘉佳，樊軍，舒怡，劉麗娟

本研究價值：

難治性癲癇的形成過程十分復(fù)雜，涉及多種基因和不同轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，而miR-145-5p在此過程中占據(jù)重要地位。隨著對miR-145-5p的深入研究，miR-145-5p作用靶點以及信號通路會更加明確，作用于這些靶點的藥物或可從根本上控制難治性癲癇的發(fā)作，減輕難治性癲癇引起的一系列病理生理變化，這將更好地造福癲癇患兒。

全世界有5 000多萬人受到癲癇的影響，抗癲癇藥物（antiepileptics，AEDs）雖然可控制癲癇發(fā)作，但仍有1/3患兒出現(xiàn)耐藥性，即發(fā)生難治性癲癇[1]。難治性癲癇通常需要幾年的長期治療后才能最終診斷，在此期間，反復(fù)發(fā)作不僅可能加重患兒的腦功能損傷程度，還可能導(dǎo)致延誤包括手術(shù)在內(nèi)的綜合治療的最佳時機。關(guān)于難治性癲癇的發(fā)生機制，目前轉(zhuǎn)運蛋白假說是被最廣泛接受和研究的理論之一，難治性癲癇的發(fā)生與多態(tài)轉(zhuǎn)運蛋白如P-糖蛋白（P-glycoprotein，P-gp）〔由多藥耐藥基因1（multidrug resistant 1，MDR1）及其ATP結(jié)合盒式表達(dá)蛋白B1（ATP-bindingcassette transporter B1，ABCB1）編碼〕、乳腺癌耐藥蛋白（breast cancer resistance protein，BCRP）〔由ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白C2（ATP-bindingcassette transporter C2，ABCC2） 編碼〕和多藥耐藥蛋白2（multidrug resistance-associated protein 2，MRP2）（由ABCC2編碼）有關(guān)[2]。

近年來，微小核糖核酸（microRNAs，miRNAs）在神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展中的作用成為一個快速擴展的研究領(lǐng)域[3]。此前已有研究觀察到，癲癇患兒血漿miRNA-137、miRNA-181a水平等發(fā)生了變化；作為一個單鏈、小的非編碼RNA家族，miRNAs可能會通過降低mRNA分子的穩(wěn)定性和抑制翻譯兩種方式參與靶基因表達(dá)的調(diào)控，從而抑制多種蛋白質(zhì)的表達(dá)，這一過程可能為難治性癲癇提供一個關(guān)鍵的調(diào)節(jié)機制和治療靶點[4]。KONG等[5]揭示了miR-145-5p可上調(diào)P-gp的表達(dá)。也有證據(jù)表明，經(jīng)雙熒光素酶報告基因檢測和方差分析顯示，MDR1/ABCB1與miR-145-5p間存在相互作用[6]。鑒于miR-145-5p可能通過轉(zhuǎn)運蛋白參與難治性癲癇的發(fā)生發(fā)展，本研究通過傾向性評分匹配探討miR-145-5p表達(dá)水平與小兒難治性癲癇間的關(guān)系，旨在為難治性癲癇患兒的臨床治療提供理論依據(jù)。

1 對象與方法

1.1 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）符合《臨床診療指南：癲癇病分冊（2015修訂版）》[7]中的癲癇診斷標(biāo)準(zhǔn)，難治性癲癇則為經(jīng)兩種及以上AEDs的足量、足療程的合理治療后，癲癇發(fā)作仍未能得到完全控制；（2）年齡1個月～12歲；（3）臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）繼發(fā)性癲癇發(fā)作者；（2）合并嚴(yán)重的器質(zhì)性病變者；（3）存在先天性代謝異常者；（4）合并其他腦神經(jīng)系統(tǒng)疾病者。

1.2 研究對象 前瞻性選取2019年1月至2021年4月四川省婦幼保健院收治的癲癇患兒291例為研究對象。根據(jù)患兒是否為難治性癲癇，將其分為難治組（難治性癲癇，72例）和可控組（非難治性癲癇，219例）。本研究經(jīng)四川省婦幼保健院倫理委員會批準(zhǔn)，患兒家屬均簽訂了知情同意書。

1.3 研究方法

1.3.1 基線資料收集 收集患兒基線資料，包括年齡、性別、病程、體質(zhì)指數(shù)、癲癇家族史、癲癇發(fā)作類型（局灶性發(fā)作、全身性發(fā)作）、既往史（熱性驚厥史、腦炎史、新生兒缺氧缺血性腦病史）。

1.3.2 臨床資料收集 收集患兒臨床資料，包括發(fā)病年齡、每次發(fā)作持續(xù)時間、初次治療前發(fā)作次數(shù)、初始腦電圖情況（正常、慢波活動、癲癇波、其他）、病因（特發(fā)性癲癇、隱源性癲癇、癥狀性癲癇）、是否存在影像學(xué)改變〔包括發(fā)育畸形（腦回發(fā)育不良、灰質(zhì)異位癥、腦裂畸形、結(jié)節(jié)性硬化癥、胼胝體發(fā)育不良）、海馬硬化（海馬信號增高、海馬萎縮或顳角擴大）、軟化灶（有中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病史，如中樞神經(jīng)系統(tǒng)感染、創(chuàng)傷、腦血管疾病及手術(shù)史）、腫瘤、腦血管畸形（海綿狀血管瘤、動靜脈畸形）和其他異常（如腦萎縮、缺血灶、囊腫、腦室形態(tài)異常/腦積水、散在脫髓鞘、鞍區(qū)病變等）〕、首次AEDs治療反應(yīng)、實驗室檢查指標(biāo)〔神經(jīng)節(jié)苷脂抗體（antibodies to GM1 ganglioside，GM1-A）、谷氨酸脫羧酶抗體（glutamic acid decarboxylase antibody，GADA）、miR-145-5p表達(dá)水平〕。GM1-A、GADA表達(dá)水平檢測方法：抽取患兒晨起空腹靜脈血4 ml，3 000 r/min離心5 min（離心半徑30 cm），取血清，于-80 ℃冰箱保存待測；利用全自動酶聯(lián)免疫分析儀（型號：BIO-RAD），采用ELISA檢測GM1-A、GADA表達(dá)水平。miR-145-5p表達(dá)水平檢測方法：抽取患兒空腹靜脈血6 ml，以3 000 r/min離心5 min（離心半徑30 cm），取血清，于-80 ℃冰箱保存待測；利用Biomics公司設(shè)計提供的人外周血DNA提取試劑盒，采用NanoDrop檢測基因組DNA濃度，進行PCR。PCR反應(yīng)體系：2.5 μl模板DNA、2.00 μl緩沖劑、0.25 μl脫氧核苷三磷酸、1.6 μl熒光定量PCR參比染料50×ROX Reference Dye（北京金百特生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)）、0.25 μl Taq DNA聚合酶和上、下游引物各0.25 μl，最后加入焦碳酸二乙酯（diethyl oxydiformate，DEPC）H2O將整個反應(yīng)體系補充至12.5 μl；PCR條件：95 ℃預(yù)變性6 min、95 ℃變性10 s、55 ℃退火10 s、72 ℃延伸30 s，共50個循環(huán)。合成PCR引物由生工生物工程（上海）股份有限公司提供，miR-145-5p正向引物為5'-GTCCAGTTTTCCC AGGAAT-3'、反向引物為5'-TGCGTGTCGTGGAGTCG-3'，內(nèi)參U6的正向引物為5'-GTAGCTGTAGCTGTGACTC-3'、反向引物為5'-ATGCTGATGCTGAGCTGAC-3'。采用2-ΔΔCt法計算miR-145-5p表達(dá)水平。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用EpiData軟件對數(shù)據(jù)進行平行雙錄入，保證數(shù)據(jù)輸入準(zhǔn)確無誤。使用SPSS 22.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行數(shù)據(jù)分析。計數(shù)資料以相對數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗；計量資料以（±s）表示，組間比較采用兩獨立樣本t檢驗。利用傾向性評分匹配擴展程序?qū)€資料進行傾向性評分匹配：以是否為難治性癲癇為因變量，各基線資料為自變量，通過多因素Logistic回歸分析估計各變量的傾向性評分，卡鉗值設(shè)置為0.02以保證匹配結(jié)果的優(yōu)良性，采用1∶1臨近匹配法對可控組與難治組進行匹配，并使用R軟件繪制傾向性評分分布圖，然后比較兩組間各變量的標(biāo)準(zhǔn)差異在匹配前后的改變，匹配后的標(biāo)準(zhǔn)差異越接近于0，匹配結(jié)果越滿意，當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)差異絕對值＜0.1時，認(rèn)為組間變量的均衡性較好。采用多因素Logistic回歸分析探討難治性癲癇的影響因素。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 匹配前兩組患兒基線資料比較 匹配前，兩組患兒年齡、體質(zhì)指數(shù)、癲癇發(fā)作類型及有熱性驚厥史、腦炎史、新生兒缺氧缺血性腦病史者占比比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；匹配前，兩組患兒性別、病程、癲癇家族史比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

表1 匹配前兩組患兒基線資料比較Table 1 Comparison of baseline data between the two groups before matching

2.2 匹配后兩組患兒基線資料比較 經(jīng)傾向性評分匹配后，共有61對患兒配對成功，匹配前后兩組患兒傾向性評分分布見圖1。匹配后，兩組患兒年齡、性別、病程、體質(zhì)指數(shù)、癲癇家族史、癲癇發(fā)作類型、熱性驚厥史、腦炎史、新生兒缺氧缺血性腦病史比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表2。

圖1 匹配前后兩組患兒傾向性評分分布圖Figure 1 Distribution of propensity scores of the two groups before and after matching

表2 匹配后兩組患兒基線資料比較Table 2 Comparison of baseline data between the two groups after matching

2.3 匹配后兩組患兒臨床資料比較 匹配后，難治組患兒發(fā)病年齡小于可控組，每次發(fā)作持續(xù)時間長于可控組，首次AEDs治療反應(yīng)佳者所占比例、miR-145-5p表達(dá)水平低于可控組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；匹配后，兩組患兒初次治療前發(fā)作次數(shù)、初始腦電圖、病因、影像學(xué)改變情況及GM1-A、GADA表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表3。

表3 匹配后兩組患兒臨床資料比較Table 3 Comparison of clinical data between the two groups after matching

2.4 難治性癲癇影響因素的多因素Logistic回歸分析以是否為難治性癲癇為因變量（是=1，否=0），發(fā)病年齡（賦值：實測值）、每次發(fā)作持續(xù)時間（賦值：實測值）、首次AEDs治療反應(yīng)（賦值：不佳=1，佳=0）、miR-145-5p表達(dá)水平（賦值：實測值）為自變量，進行多因素Logistic回歸分析，結(jié)果顯示，發(fā)病年齡、每次發(fā)作持續(xù)時間、首次AEDs治療反應(yīng)、miR-145-5p表達(dá)水平是難治性癲癇的影響因素（P＜0.05），見表4。

表4 難治性癲癇影響因素的多因素Logistic回歸分析Table 4 Multivariate Logistic regression analysis on influencing factors of refractory epilepsy

3 討論

小兒難治性癲癇是一個世界性的難題，以癲癇長期反復(fù)發(fā)作、不能被AEDs有效控制為主要特征，與成年人不同的是，小兒大腦處于生長發(fā)育階段，癲癇反復(fù)發(fā)作所致腦損傷可通過釋放多種細(xì)胞遞質(zhì)，導(dǎo)致一系列復(fù)雜的免疫反應(yīng)、炎性反應(yīng)的激活，這些過程誘導(dǎo)趨化因子和黏附小分子，進而動員免疫細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可加重疾病進展[8]。癲癇患兒腦內(nèi)基因表達(dá)有所改變，但其具體機制尚不明確，近年來有研究表明，miRNAs作為多種疾病的新型生物標(biāo)志物，在炎性反應(yīng)、神經(jīng)元死亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生、突觸重塑等方面發(fā)揮著重要作用[9]，且全基因組miRNAs表達(dá)譜研究已經(jīng)確定了癲癇與動物模型中100多種不同miRNAs表達(dá)水平變化有關(guān)[10]。另有研究顯示，miR-145-5p直接靶向絲裂原活化蛋白激酶4，并且廣泛抑制腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）觸發(fā)的基質(zhì)降解酶的產(chǎn)生，進而參與炎性反應(yīng)過程[11]。這一點讓miR-145-5p的作用逐步受到重視。本研究通過傾向性評分匹配探討miR-145-5p表達(dá)水平與小兒難治性癲癇間的關(guān)系，旨在為難治性癲癇患兒的臨床治療提供理論依據(jù)。

關(guān)于難治性癲癇與發(fā)病年齡的關(guān)系，目前的研究持不同意見，其中CAMFIELD等[12]指出，2歲以內(nèi)發(fā)病患兒較多見，1歲以前為發(fā)病高峰期，認(rèn)為1歲前發(fā)病患兒多為先天性腦發(fā)育異常及圍生期腦損傷引起，且部分患兒存在影像學(xué)異常表現(xiàn)。但GIMéNEZ DEGEORGE等[13]研究顯示，發(fā)病年齡在進入回歸方程時被排除在外，認(rèn)為發(fā)病年齡＜1歲僅為兒童癲癇的混雜危險因素，并不具備獨立參考性，HUNTER等[14]的研究也支持該結(jié)論。而本研究結(jié)果顯示，難治組患兒發(fā)病年齡小于可控組，且多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，發(fā)病年齡大是難治性癲癇的保護因素，但本研究所選患兒的發(fā)病年齡為1個月～12歲，并未按照生理發(fā)育特點進行分層研究，故發(fā)病年齡與難治性癲癇的關(guān)系仍需進一步研究。

在難治性癲癇病情進展的高危因素中，癲癇發(fā)作持續(xù)時間被認(rèn)為是重要的影響因素，既往研究顯示，病初即存在癲癇持續(xù)狀態(tài)或叢集性發(fā)作者易發(fā)展為難治性癲癇[15]，隨后的研究也顯示，疾病發(fā)作越頻繁，癲癇患兒預(yù)后越差[16]；PADIYAR等[17]亦表示，病初發(fā)作頻繁很大程度上預(yù)示了癲癇的難控性。本研究結(jié)果顯示，難治組患兒每次發(fā)作持續(xù)時間長于可控組，且多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，每次發(fā)作持續(xù)時間是難治性癲癇的影響因素，與PADIYAR等[17]的研究結(jié)果一致。

本研究結(jié)果亦顯示，難治組患兒首次AEDs治療反應(yīng)佳者所占比例低于可控組，且多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，首次AEDs治療反應(yīng)是難治性癲癇的影響因素。在AEDs的療效上，AEDs通過與相應(yīng)靶點結(jié)合來發(fā)揮抗癲癇作用，但并非所有患兒在應(yīng)用第1種AEDs后可控制癲癇發(fā)作，部分患兒需換用第2種、第3種AEDs，甚至多種AEDs仍不能達(dá)到良好預(yù)后。ARFMAN等[18]研究顯示，60.9%的患兒應(yīng)用第1種AEDs即可控制癲癇發(fā)作，11.7%的患兒需換用第2種AEDs，9.8%的患兒則需要應(yīng)用第3種AEDs，甚至17.6%的患兒連續(xù)換3種及以上AEDs才能控制癲癇發(fā)作，至隨訪結(jié)束，4組患兒中癲癇發(fā)作得到良好控制者分別占95.5%、53.3%、32%和4.4%。由此可見，首次AEDs治療即可控制癲癇發(fā)作的患兒預(yù)后最好，隨無效藥物數(shù)量的增多，癲癇有效控制率逐漸降低，AEDs尤其是首次治療藥物的療效與癲癇患兒預(yù)后相關(guān)。

miRNAs由于在血清中的穩(wěn)定性好，且可調(diào)節(jié)基因表達(dá)和蛋白質(zhì)合成并參與基本的生物過程，已被提議作為癌癥[19]、衰老[20]、神經(jīng)系統(tǒng)疾病[21]等的生物標(biāo)志物。此外，幾項靶標(biāo)研究和全基因組miRNAs表達(dá)譜研究表明，miRNAs在癲癇中存在差異表達(dá)[22-23]；一些功能性的研究已經(jīng)表明，miRNAs可以通過調(diào)節(jié)癲癇患者體內(nèi)的炎性反應(yīng)調(diào)控細(xì)胞分化、生長、凋亡、代謝等功能[24]。有研究已經(jīng)確定視網(wǎng)膜內(nèi)皮細(xì)胞中的miR-145-5p是凋亡、氧化應(yīng)激和炎性細(xì)胞因子分泌的新調(diào)節(jié)因子，其也被認(rèn)為與癲癇有關(guān)[25]。同樣，LIU等[26]認(rèn)為，miR-145-5p參與細(xì)胞有絲分裂活動，并隨后在TNF-α介導(dǎo)的炎癥損傷的背景下影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤的存活。本研究結(jié)果顯示，難治組患兒miR-145-5p表達(dá)水平低于可控組，且多因素Logistic回歸分析結(jié)果顯示，miR-145-5p表達(dá)水平是難治性癲癇的影響因素，這可能反映了miR-145-5p可通過其靶基因參與癲癇神經(jīng)生物學(xué)相關(guān)的病理生理過程。

miR-145-5p可參與調(diào)控神經(jīng)元凋亡、膠質(zhì)細(xì)胞增生、神經(jīng)元微結(jié)構(gòu)、炎性反應(yīng)等過程，而這些病理過程與難治性癲癇的發(fā)病機制密切相關(guān)，故miR-145-5p表達(dá)水平或可為難治性癲癇患兒的診斷及治療提供理論依據(jù)。然而，本研究也存在一定不足：（1）由于各種客觀原因的條件限制，未持續(xù)追蹤患兒各生化指標(biāo)和miR-145-5p表達(dá)水平，且未能進一步分析病情發(fā)展過程中miR-145-5p表達(dá)水平的變化；（2）本研究樣本量較小且為單中心研究，在一定程度上存在地域局限性；（3）本研究對象為難治性癲癇患兒，不能代表成年難治性癲癇患者。因而后續(xù)仍需更詳細(xì)的研究來闡明miR-145-5p表達(dá)水平與難治性癲癇間關(guān)系的機制。

綜上所述，miR-145-5p表達(dá)水平升高是小兒難治性癲癇的保護因素，其可作為難治性癲癇患兒潛在的治療靶點和診斷及病情評估的生物標(biāo)志物。

作者貢獻(xiàn)：龍?zhí)O蘋進行文章的構(gòu)思與設(shè)計，文章的可行性分析，撰寫論文，負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校，并對文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；龍?zhí)O蘋、范嘉佳進行論文的修訂；范嘉佳、樊軍、舒怡、劉麗娟進行文獻(xiàn)/資料收集、整理。

本文無利益沖突。