侵襲性功能性垂體腺瘤患者低氧誘導(dǎo)因子 1α誘導(dǎo)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)及臨床意義

岳成，石文健，劉永亮，李景武，張于，董桂蘭，張歡，董偉

垂體瘤是僅次于膠質(zhì)瘤和腦膜瘤的第三大中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)腫瘤，約占腦腫瘤的15%，且約1/3的垂體瘤具有侵襲性，可向周?chē)M織侵襲[1-2]。功能性垂體腺瘤是垂體瘤的最常見(jiàn)病理亞型，主要包括泌乳素腺瘤、生長(zhǎng)激素腺瘤及促性腺激素腺瘤，其是由激素分泌過(guò)多引起的一系列癥狀，可增加心腦血管疾病、呼吸系統(tǒng)疾病發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，進(jìn)而嚴(yán)重影響人們的生命健康[3]。垂體腺瘤常會(huì)侵襲蝶竇、海綿竇或硬膜上，并表現(xiàn)出較高的侵襲性、增殖率，且短期內(nèi)復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)較高[4]。腫瘤微環(huán)境在實(shí)體腫瘤的發(fā)生發(fā)展及轉(zhuǎn)移過(guò)程中具有重要作用，低氧環(huán)境作為腫瘤微環(huán)境的特征之一，與多種腫瘤侵襲性和預(yù)后不良相關(guān)，原因可能為低氧環(huán)境影響血管生成、基因組不穩(wěn)定和藥物抵抗[5-6]。低氧誘導(dǎo)因子 1α（hypoxia inducible factor 1 alpha，HIF-1α）是腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中的重要調(diào)控因子，具有非氧依賴(lài)調(diào)控通路，可增加血管生成生長(zhǎng)因子的轉(zhuǎn)錄活性及血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）和表皮生長(zhǎng)因子（epidermal growth factor，EGF）的表達(dá)[7-8]。研究表明，大部分垂體腺瘤患者均有HIF-1α表達(dá)且其水平與腫瘤的侵襲性密切相關(guān)[9]。本研究旨在分析侵襲性功能性垂體腺瘤患者HIF-1α誘導(dǎo)血管生成相關(guān)基因的表達(dá)及臨床意義，以期為侵襲性功能性垂體腺瘤的藥物治療提供新的思路和理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2016年1月至2020年9月唐山市人民醫(yī)院神經(jīng)外科門(mén)診收入院并接受手術(shù)治療的功能性垂體腺瘤患者58 例，其中生長(zhǎng)激素腺瘤26例、泌乳素腺瘤32例、促性腺激素腺瘤0例。根據(jù)Hardy-Wilson分級(jí)和Knosp分類(lèi)方法[10-11]將其分為侵襲性組（n=28）和無(wú)侵襲性組（n=30）。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并精神障礙者；（2）妊娠期婦女；（3）近3個(gè)月內(nèi)參加過(guò)其他臨床試驗(yàn)者；（4）合并其他腫瘤者。本研究經(jīng)唐山市人民醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)（批件編號(hào)：RMYY-LLKS-2020-004）。

1.2 診斷標(biāo)準(zhǔn) 功能性垂體腺瘤必須滿足（2）、（4），且（3）中至少一項(xiàng)，具體如下：（1）臨床癥狀和體征：①占位癥狀：頭痛、視力下降、視野缺損。②內(nèi)分泌癥狀。包括內(nèi)分泌亢進(jìn)癥狀：肢端肥大、面容改變、骨質(zhì)疏松、肥厚型心肌病、打鼾或睡眠呼吸暫停、高血壓、糖尿病、高脂血癥；高泌乳素血癥癥狀：男性陽(yáng)痿、性欲下降、不育，女性閉經(jīng)、溢乳；內(nèi)分泌功能低下癥狀；甲狀腺功能低下癥狀：怕冷、黏液性水腫、毛發(fā)粗；腎上腺功能低下癥狀：直立性低血壓，易疲倦；性腺功能低下癥狀：女性停經(jīng)、無(wú)性欲、不孕，男性陽(yáng)痿、性欲下降。（2）影像學(xué)檢查：強(qiáng)化MRI證實(shí)為垂體瘤。（3）內(nèi)分泌功能檢查：①口服葡萄糖耐量試驗(yàn)顯示生長(zhǎng)激素＞1 μg/L；②胰島素樣生長(zhǎng)因子1（insulin-like growth factors 1，IGF-1）高于參考范圍上限（以臨床檢驗(yàn)參考范圍為準(zhǔn)）；③生長(zhǎng)激素＞2 μg/L；④靜息泌乳素（prolactin，PRL）＞150 μg/L。（4）免疫組化染色顯示PIT-1陽(yáng)性，生長(zhǎng)激素陽(yáng)性或PRL陽(yáng)性。并根據(jù)血激素水平、臨床癥狀、PIT-1染色結(jié)果采用Aperio AT2高通量快速掃描系統(tǒng)（徠卡生物系統(tǒng)）掃描玻片成像。

1.3 臨床資料收集 收集所有患者的臨床資料，包括年齡、性別、病理類(lèi)型、有無(wú)頭痛、有無(wú)視野缺損、腫瘤體積、切除程度及腫瘤復(fù)發(fā)情況。

1.4 免疫組化操作方法

1.4.1 免疫組化試劑和抗體 免疫組化染色工作液購(gòu)自德國(guó)徠卡生物系統(tǒng)有限公司，包括脫蠟液（AR9222）、抗原修復(fù)液（AF9640）、 二抗檢測(cè)系統(tǒng)（DS9800）；HIF-1α（兔單克隆抗體，AB263460）、 VEGF-A（兔單克隆抗體，AB52917）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）（ 兔 單 克 隆 抗 體，AB40815）、CD31（兔單克隆抗體，AB134168）及Ki-67（兔單克隆抗體，ab197234）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，均為一抗。

1.4.2 組織芯片構(gòu)建與免疫組化染色 采用3 cm×4 cm規(guī)格的包埋盒，制成25 mm×25 mm×5 mm的空白蠟塊，在該蠟塊中間20 mm×20 mm范圍內(nèi)設(shè)計(jì)6×10點(diǎn)組織微陣列（tissue microarrays，TMA），采用組織芯片儀打孔（1 mm），孔間距為2 mm，制成TMA模塊。從石蠟包埋組織中選取3個(gè)核心組織進(jìn)行活檢（直徑2.0 mm），將所采核心組織轉(zhuǎn)移到TMA。樣本隨機(jī)排序，每例隨機(jī)取3個(gè)區(qū)域打孔，每個(gè)模塊包含侵襲性和無(wú)侵襲性垂體腺瘤各10例，將組織芯片切成4 μm厚度的切片。為了減少抗原損失，芯片載玻片在切割后1周內(nèi)進(jìn)行處理。常規(guī)免疫組化染色：所有標(biāo)本切片事先采用HE染色以評(píng)估腫瘤細(xì)胞含量和質(zhì)量。將載玻片置于徠卡BOND-Ⅲ全自動(dòng)免疫組化染色機(jī)中檢測(cè)抗體HIF-1α、VEGFA、EGFR、CD31及Ki-67表達(dá)情況。

1.4.3 免疫組化評(píng)分 采用徠卡Aperio AT2高通量快速掃描系統(tǒng)掃描玻片成像，根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用徠卡Aperio AT2和數(shù)字切片查看軟件計(jì)算剩余抗體的最優(yōu)效價(jià)。免疫組化評(píng)分=陽(yáng)性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)×染色強(qiáng)度評(píng)分，染色強(qiáng)度陰性記為0分、弱陽(yáng)性記為1分、陽(yáng)性記為2分、強(qiáng)陽(yáng)性記為3分。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（IBM公司）進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。符合正態(tài)分布及近似正態(tài)分布的計(jì)量資料以（±s）表示，組間比較采用成組t檢驗(yàn)；計(jì)數(shù)資料以相對(duì)數(shù)表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者臨床資料比較 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者年齡、性別、病理類(lèi)型及頭痛發(fā)生率比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；侵襲性組患者有視野缺損、腫瘤體積≥6.92 cm3、全切及次全切者所占比例及腫瘤復(fù)發(fā)率高于無(wú)侵襲性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者臨床資料比較Table 1 Comparison of clinical information between the invasive group and the non-invasive group

2.2 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67表達(dá)情況比較 侵襲性組患者中HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67高表達(dá)者所占比例高于無(wú)侵襲性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67表達(dá)情況比較〔n（%）〕Table 2 Comparison of expression of HIF-1α，VEGF-A，EGFR，CD31，Ki-67 between the invasive group and the non-invasive group

2.3 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67免疫組化評(píng)分比較 侵襲性組患者 HIF-1α、EGFR、VEGF-A、CD31、Ki-67免 疫 組化評(píng)分高于無(wú)侵襲性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見(jiàn)表3、圖1。

表3 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67免疫組化評(píng)分比較（±s，分）Table 3 Comparison of immunohistochemical scores of HIF-1α，VEGF-A，EGFR，CD31，Ki-67 between the invasive group and the non-invasive group

表3 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67免疫組化評(píng)分比較（±s，分）Table 3 Comparison of immunohistochemical scores of HIF-1α，VEGF-A，EGFR，CD31，Ki-67 between the invasive group and the non-invasive group

組別 組別 HIF-1α VEGF-A EGFR CD31 Ki-67無(wú)侵襲性組 30 145.3±8.9 192.7±8.3 98.3±10.6 147.1±6.7 5.93±0.58侵襲性組 28 197.3±12.0 240.5±7.8 138.7±5.9 206.9±9.5 1.77±0.10 t值 3.483 4.044 3.304 4.566 7.297 P值 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001 ＜0.001

圖1 侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR、CD31、Ki-67的免疫組化染色結(jié)果（×400）Figure 1 Immunohistochemical results of HIF-1α，VEGF-A，EGFR，CD31，Ki-67 of the invasive group and the non-invasive group

3 討論

垂體腺瘤是一種常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤，其最常見(jiàn)的亞型是功能性垂體腺瘤。WHO指南推薦，垂體腺瘤的治療方法為藥物治療和手術(shù)綜合治療，但手術(shù)切除有難度，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，特別是對(duì)于侵襲性垂體腺瘤，其是目前導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞殘留、術(shù)后復(fù)發(fā)和藥物抵抗的重要因素之一[12-14]。因此，尋找治療存在藥物抵抗的侵襲性功能性垂體腺瘤的方法非常重要。本研究結(jié)果顯示，侵襲性組和無(wú)侵襲性組患者年齡、性別、病理類(lèi)型及頭痛發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但侵襲性組患者有視野缺損、腫瘤體積≥6.92 cm3、全切及次全切者所占比例及腫瘤復(fù)發(fā)率高于無(wú)侵襲性組，但因Hardy-Wilson分級(jí)和Knosp分類(lèi)方法考慮腫瘤體積，故不能完全認(rèn)為腫瘤體積大小與功能性垂體腺瘤的侵襲性有關(guān)，尚有待進(jìn)一步研究。

腫瘤微環(huán)境是由腫瘤細(xì)胞及其浸潤(rùn)周邊的免疫細(xì)胞、新生血管、內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)共同構(gòu)成[15]。ICGC/TCGA全基因組泛癌分析聯(lián)盟量化27類(lèi)1 188種癌癥后發(fā)現(xiàn)，低氧程度與基因突變頻率增加相關(guān)，其在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中起重要作用[16]。HIF-1是兩個(gè)堿性螺旋-環(huán)-螺旋/PAS蛋白的異源二聚體，包括HIF-1α和HIF-1β。HIF-1α是功能亞基，可促進(jìn)血管生成。在正常氧濃度下，HIF-1蛋白在細(xì)胞內(nèi)通過(guò)氧依賴(lài)的泛素蛋白酶降解途徑而快速降解[17]。研究表明，HIF-1α的強(qiáng)制過(guò)表達(dá)足以使哺乳動(dòng)物細(xì)胞周期阻滯在G1期，且HIF-1以與轉(zhuǎn)錄無(wú)關(guān)的方式抑制DNA復(fù)制[18-19]。在癌癥中，HIF-1α是通過(guò)多種信號(hào)通路調(diào)控多種基因轉(zhuǎn)錄，而非依賴(lài)氧氣水平[20]。各種生長(zhǎng)因子通過(guò)多種信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)（即PI3K/PTEN/AKT通路或RAS/RAF/MAPK通路）而調(diào)節(jié)HIF-1α的表達(dá)[21]。與血管豐富的正常腦垂體相比，垂體腺瘤具有較低的血管密度，但腫瘤內(nèi)的缺氧條件仍可激活一些誘導(dǎo)途徑，導(dǎo)致血管密度增加或更有序的微血管幾何形狀，以維持腫瘤生長(zhǎng)[22]。本研究結(jié)果顯示，侵襲性組患者中HIF-1α高表達(dá)者所占比例和HIF-1α免疫組化評(píng)分高于無(wú)侵襲性組，提示侵襲性功能性垂體腺瘤患者存在HIF-1α高表達(dá)情況。

血管重構(gòu)是機(jī)體發(fā)育和適應(yīng)缺氧等不利環(huán)境的基本生理過(guò)程，VEGF可促進(jìn)血管生成和新血管微血管網(wǎng)絡(luò)的重建[14，23]。缺氧可誘導(dǎo)VEGF表達(dá)上調(diào)，其程序如下：由HIF-1α驅(qū)動(dòng)，通過(guò)上調(diào)血管生成因子（如VEGF-A）可增加血管生成的氧氣供應(yīng)[24]。本研究結(jié)果顯示，侵襲性組患者中VEGF-A高表達(dá)者所占比例和VEGF-A免疫組化評(píng)分高于無(wú)侵襲性組，提示侵襲性功能性垂體腺瘤患者存在VEGF-A高表達(dá)情況。

EGFR是一種致癌蛋白，在多種實(shí)體腫瘤中其具有促進(jìn)腫瘤發(fā)生、發(fā)展的作用。EGFR是酪氨酸激酶受體ErbB家族成員之一，EGFR的激活啟動(dòng)了一系列下游信號(hào)通路。生長(zhǎng)因子和EGFR家族的功能激活可發(fā)生于多數(shù)上皮細(xì)胞癌，抑制EGFR信號(hào)可導(dǎo)致癌細(xì)胞周期阻滯和凋亡[25]，故EGFR已成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)[26]。研究表明，表皮生長(zhǎng)因子樣結(jié)構(gòu)域7（epidergrowth factor-like domain 7，EGFL7） 水 平 與EGFR激活程度呈正相關(guān)，而敲低EGFL7可有效抑制GH3和GT1-1細(xì)胞株中EGFR信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)的激活[27]。本研究結(jié)果顯示，侵襲性組患者中EGFR高表達(dá)者所占比例和EGFR免疫組化評(píng)分高于無(wú)侵襲性組，提示侵襲性功能性垂體腺瘤患者存在EGFR高表達(dá)情況。

綜上所述，侵襲性功能性垂體腺瘤患者HIF-1α、VEGF-A、EGFR呈高表達(dá)，其機(jī)制可能為低氧環(huán)境下HIF-1α表達(dá)增加后上調(diào)VEGF-A、EGFR表達(dá)，從而促進(jìn)血管生成，增加腫瘤侵襲性。因此，抑制血管生成治療可能為垂體腫瘤靶點(diǎn)藥物研究提供新的思路。但本研究樣本量較小，所得結(jié)論仍有待大樣本量、更深入的功能學(xué)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證。

作者貢獻(xiàn)：董偉進(jìn)行文章的構(gòu)思與設(shè)計(jì)，并對(duì)文章整體負(fù)責(zé)、監(jiān)督管理；張歡進(jìn)行數(shù)據(jù)收集、整理、分析；張于、董桂蘭進(jìn)行結(jié)果分析與解釋?zhuān)辉莱勺珜?xiě)并修訂論文；石文建、劉永亮、李景武負(fù)責(zé)文章的質(zhì)量控制及審校。

本文無(wú)利益沖突。