tRNA來源的非編碼小RNA在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展*

藍(lán)偲樺 屈均池 張世能

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院消化內(nèi)科(510030)

轉(zhuǎn)移核糖核酸(transfer RNA, tRNA)是將核酸的遺傳信息翻譯成蛋白質(zhì)一級結(jié)構(gòu)的重要接頭分子，其特異性識別信使RNA(mRNA)分子中的密碼子，將氨基酸基團(tuán)運(yùn)載至新合成的多肽鏈。tRNA基因由RNA聚合酶Ⅲ轉(zhuǎn)錄形成前體tRNA，然后加工為成熟的tRNA，后者具有典型的三葉草型二級結(jié)構(gòu)，包括氨基酸臂、二氫尿嘧啶環(huán)(D環(huán))、假尿嘧啶環(huán)(TΨC環(huán))、反密碼子環(huán)以及可變環(huán)等。在不同核酸內(nèi)切酶、血管生成蛋白(angiogenin, ANG)等的作用下，可產(chǎn)生兩類tRNA來源的非編碼小RNA(tRNA-derived small non-coding RNAs, tsRNAs)：tRNA衍生片段(tRNA-derived RNA fragments, tRFs)和tRNA半分子(tRNA halves, tiRNAs)。依據(jù)tRNA的酶切位置、大小和功能，前者可分為tRF-1、tRF-2、tRF-3、tRF-5和內(nèi)源性tRF(i-tRF)五個(gè)亞類，長約13～30 nt；后者則可分為5’-tiRNA和3’-tiRNA兩個(gè)亞類，長約30～40 nt[1-2]。近期研究[3]發(fā)現(xiàn)DNA去甲基化酶十-十一易位酶2(ten-eleven translocation 2, TET2)通過tRNA的5-甲基胞嘧啶/5-羥甲基胞嘧啶(m5C/hm5C)化學(xué)修飾間接或直接參與調(diào)控不同類型tsRNAs的生物發(fā)生及其穩(wěn)定性。tsRNAs表達(dá)失調(diào)與人類多種疾病的發(fā)生、發(fā)展關(guān)系密切。本文就tsRNAs的生物學(xué)功能及其在常見消化系統(tǒng)腫瘤中的研究進(jìn)展作一綜述。

一、 tsRNAs的生物學(xué)功能

迄今，大多數(shù)tsRNAs的生物學(xué)功能尚未明確，但已有研究顯示其參與基因表達(dá)、蛋白質(zhì)翻譯、應(yīng)激反應(yīng)以及免疫反應(yīng)等的調(diào)控。在不同類型腫瘤中異常表達(dá)的tsRNAs通過不同機(jī)制扮演癌基因或抑癌基因的角色。

1. 調(diào)控基因表達(dá)：起初，研究者發(fā)現(xiàn)tRFs與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合物(RISC)的效應(yīng)分子argonaute(AGO)蛋白家族可形成穩(wěn)定復(fù)合物，進(jìn)而推測tRFs發(fā)揮類似于微RNA(miRNA)的基因表達(dá)抑制功能[4]。除tRF-1與AGO3和AGO4結(jié)合外，tRF-3、tRF-5均可與4種AGO結(jié)合[5]。Maute等[6]的研究顯示，tRNAGly-GCC來源的tRF-3(亦稱CU1276)具有類似miRNA的一系列特性，包括依賴Dicer酶的產(chǎn)生方式，其在人B細(xì)胞淋巴瘤中低表達(dá)，與AGO結(jié)合后，以類似于miRNA的序列互補(bǔ)作用方式抑制內(nèi)源性復(fù)制蛋白A1(RPA1)表達(dá)，后者參與調(diào)節(jié)DNA復(fù)制和修復(fù)。該研究是首次在哺乳類細(xì)胞中證實(shí)tRF發(fā)揮類似miRNA的功能。

同樣，tRF-5以類似RNA干擾的方式發(fā)揮RNA轉(zhuǎn)錄后沉默效應(yīng)。如在病毒感染人類細(xì)胞時(shí)，tRF-5序列可特異性結(jié)合病毒mRNA的3’非編碼區(qū)(3’UTR)，從而抑制抗病毒靶基因表達(dá)[7]。Goodarzi等[8]的研究證實(shí)，YBX1蛋白在腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，具有穩(wěn)定原癌基因mRNA的作用；而當(dāng)YBX1被5’-tiRNA捕獲后，其與原癌基因mRNA的相互作用被競爭性阻斷，導(dǎo)致原癌基因mRNA穩(wěn)定性降低，從而使癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移受抑。2019年Ren等[9]的研究顯示，根瘤菌衍生的tsRNAs可調(diào)控大豆基因組中的結(jié)瘤基因表達(dá)，促進(jìn)大豆結(jié)瘤，并提高根瘤數(shù)目，開創(chuàng)了研究原核生物小RNA調(diào)控真核生物重要生物學(xué)功能的先河。

2. 調(diào)控蛋白質(zhì)翻譯：近年，有關(guān)tsRNAs參與蛋白質(zhì)翻譯的機(jī)制研究有諸多報(bào)道。含有TOG模序的5’-tiRNAAla和5’-tiRNACys能競爭性地與翻譯起始復(fù)合物真核起始因子4G(eukaryotic initiation factor 4G, eIF4G)和eIF4A結(jié)合，抑制帽依賴性蛋白質(zhì)翻譯起始過程[10]。此外，5’-tiRNA還可與YBX1結(jié)合，通過eIF2α蛋白磷酸化途徑啟動應(yīng)激誘導(dǎo)的翻譯抑制，以增強(qiáng)細(xì)胞的抗壓能力[11]。RNA修飾在5’-tiRNA介導(dǎo)的翻譯調(diào)控中亦起有重要作用，假尿苷酸合酶7(PUS7)在人胚胎干細(xì)胞、造血干細(xì)胞中表達(dá)豐富，且可與不同的tsRNAs結(jié)合，將其第8位上的U轉(zhuǎn)變?yōu)棣?，形成的?-TOG-5’-tiRNA能優(yōu)先與翻譯起始復(fù)合物中心啟動因子PABPC1結(jié)合，導(dǎo)致翻譯抑制[12]。

tRFs參與調(diào)節(jié)核糖體RNA(rRNA)的生物發(fā)生、加工等過程。在低等生物中，tRF-3可與Twi12蛋白(AGO/Piwi家族蛋白)特異性結(jié)合，誘導(dǎo)形成含有核酸外切酶Xrn2的Twi12/Xrn2/Tan1剪接復(fù)合物TXT，參與前體rRNA的加工，從而促進(jìn)rRNA合成[13]。此外Kim等[14]的研究顯示，LeuCAG tsRNA的3’端(LeuCAG3’tsRNA)通過維持核糖體蛋白S28(RPS28)水平調(diào)節(jié)人類核糖體的生物發(fā)生。進(jìn)一步研究[15]證實(shí)，在脊椎動物中，LeuCAG3’tsRNA的目標(biāo)靶點(diǎn)位于保守的RPS28編碼區(qū)，在人類和小鼠中均可通過一種保守的基因調(diào)控機(jī)制調(diào)節(jié)RPS28的起始階段翻譯。因此，tRFs可根據(jù)其亞型、細(xì)胞狀態(tài)以及物種在不同水平調(diào)節(jié)核糖體的生物發(fā)生。

3. 參與應(yīng)激反應(yīng)：研究[16]發(fā)現(xiàn)，在應(yīng)激條件下，如營養(yǎng)缺失、氧化應(yīng)激時(shí)，tsRNAs表達(dá)量增加。營養(yǎng)缺失狀態(tài)下，布氏錐蟲tiRNAs表達(dá)增加，其中3’-tiRNAThr豐度顯著升高，而一旦終止?fàn)I養(yǎng)缺失狀態(tài)，3’-tiRNAThr則能與核糖體和多聚核糖體結(jié)合，促進(jìn)mRNA裝載以增強(qiáng)蛋白質(zhì)翻譯[17]。而在哺乳動物細(xì)胞中，作為核糖核酸酶的ANG，一方面可剪切tRNA形成tiRNA，參與rRNA的生物合成；另一方面可與YBX1結(jié)合，并通過eIF2α蛋白磷酸化途徑增強(qiáng)應(yīng)激顆粒(stress granule, SG)的組裝，共同參與應(yīng)激反應(yīng)[11]。SG是一種細(xì)胞質(zhì)核糖核蛋白，與細(xì)胞凋亡、病毒感染、免疫反應(yīng)等有關(guān)，其形成可暫時(shí)沉默mRNA從而影響轉(zhuǎn)錄，有利于細(xì)胞在應(yīng)激條件下存活。研究[18]表明K-ras基因突變型腫瘤細(xì)胞在應(yīng)激條件下(如化療藥物、活性氧、蛋白毒性)，通過非自主分泌方式上調(diào)SG以進(jìn)一步增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的適應(yīng)性。在亞砷酸鈉應(yīng)激條件下，RNA去甲基化酶AlkB同源物3(ALKBH3)催化tRNA產(chǎn)生1-甲基腺苷和3-甲基胞苷去甲基化，而去甲基化的tRNA有利于ANG切割產(chǎn)生tRF，這些tRF可結(jié)合線粒體釋放的細(xì)胞色素C，阻止細(xì)胞凋亡，從而促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[19-20]。氧化應(yīng)激時(shí)，RNA甲基轉(zhuǎn)移酶NOP2/Sun結(jié)構(gòu)域家族成員2 (NOP2/Sun domain family member 2, NSun2)受抑，tRNA甲基化水平降低，進(jìn)而細(xì)胞內(nèi)tRF產(chǎn)生減少，影響細(xì)胞代謝和蛋白質(zhì)合成[21]。除ANG外，最近有研究[22]顯示ALKBH1亦參與了應(yīng)激誘導(dǎo)的tsRNAs產(chǎn)生。

4. 調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)：對人類呼吸道上皮細(xì)胞的研究[23]發(fā)現(xiàn)，感染呼吸道合胞病毒可導(dǎo)致tRNA在反密碼子部位切割，形成tiRNA，且大多來源于5’端，這些分子與病毒復(fù)制關(guān)系密切，其中tRF-5-GluCTC呈現(xiàn)反式沉默功能，抑制宿主防御基因表達(dá)。隨后的機(jī)制研究[7]表明，tRF-5-GluCTC能與載脂蛋白E受體2(APOER2)mRNA 的3’UTR互補(bǔ)配對結(jié)合，抑制具有抗病毒作用的APOER2表達(dá)，從而有利于病毒復(fù)制。而在HBV和HCV感染的人肝細(xì)胞中，亦出現(xiàn)tRFs豐度增加，誘導(dǎo)Th1樣免疫應(yīng)答，以Toll樣受體3(TLR3)識別模式促進(jìn)干擾素生成[24-25]。另有研究[26]發(fā)現(xiàn)，在宿主防御機(jī)制激活過程中，與非活化的淋巴細(xì)胞相比，活化的T細(xì)胞胞外囊泡中tRFs豐度增加；而一旦抑制胞外囊泡形成，這些tRFs則進(jìn)入多泡體，T細(xì)胞活化受抑；采用反義寡核苷酸抑制這些tRFs可增強(qiáng)T細(xì)胞活化。近年一項(xiàng)應(yīng)用公共數(shù)據(jù)庫結(jié)合生物信息學(xué)方法的研究[27]顯示，乳腺癌tRFs表達(dá)失調(diào)與T細(xì)胞活化之間存在相關(guān)性。上述研究均提示tsRNAs參與機(jī)體免疫反應(yīng)。

二、tsRNAs與消化系統(tǒng)腫瘤的診斷和預(yù)后

近年來測序技術(shù)不斷發(fā)展，應(yīng)用基因組測序技術(shù)等分析腫瘤中的差異表達(dá)tsRNAs，有望為臨床發(fā)掘新的腫瘤生物學(xué)標(biāo)志物。盡管這項(xiàng)工作尚處于初始階段，但已取得了一些進(jìn)展。

1. 胃癌：胃癌患者血漿中存在異常表達(dá)的tsRNAs，提示檢測血漿tsRNAs具有潛在的臨床診斷價(jià)值[28]。有研究[29]顯示，tiRNA-5034-GluTTC-2在胃癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，其在胃癌組織和血漿中的ROC曲線下面積(AUC)分別是0.779和0.835，而組織與血漿聯(lián)合檢測的診斷敏感性、特異性和AUC分別達(dá)到84.7%、92.8%和0.915；且tiRNA-5034-GluTTC-2表達(dá)水平與腫瘤大小和患者總生存率密切相關(guān)。另有研究[30]發(fā)現(xiàn)，與健康對照組相比，胃癌患者血漿tRF-19-3L7L73JD表達(dá)水平降低，術(shù)后則表達(dá)水平升高，且其表達(dá)水平與腫瘤大小呈負(fù)相關(guān)。Gu等[31]的研究中，tRF hsa_tsr016141在胃癌患者腫瘤組織和血清中的表達(dá)顯著上調(diào)，術(shù)后則明顯下降，其表達(dá)水平與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移程度和腫瘤分級呈正相關(guān)；ROC曲線分析提示其血清水平可鑒別胃癌、胃炎和健康受試者。胃癌患者還存在血漿外泌體中tRF-25、tRF-38和tRF-18表達(dá)水平上調(diào)[32]。上述研究表明tsRNAs在胃癌診斷和預(yù)后評估中具有應(yīng)用價(jià)值。

2. 結(jié)直腸癌：研究[33]顯示，在缺氧等腫瘤微環(huán)境應(yīng)激條件下，結(jié)直腸癌細(xì)胞和組織中ANG表達(dá)上調(diào)，并剪切產(chǎn)生更多的5’-tiRNA-Val，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。在缺氧條件下，結(jié)直腸癌細(xì)胞中的tRF-20-M0NK5Y93表達(dá)下調(diào)，并可靶向調(diào)節(jié)緊密連接蛋白-1(claudin-1)，通過抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)抑制結(jié)直腸癌進(jìn)展和轉(zhuǎn)移[34]。5’tiRNA-His-GTG在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)上調(diào)并與腫瘤大小呈正相關(guān)，受缺氧/缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF1α)/ANG軸調(diào)節(jié)，靶向LATS2以抑制Hippo信號通路，從而促進(jìn)癌細(xì)胞促增殖和抗凋亡相關(guān)基因表達(dá)[35]。近期一項(xiàng)研究[36]表明，5’-tRF-GlyGCC在結(jié)直腸癌患者的血漿、結(jié)直腸癌細(xì)胞株、異種移植瘤組織甚至與結(jié)直腸癌細(xì)胞共培養(yǎng)的血細(xì)胞中表達(dá)水平顯著高于正常對照組；單獨(dú)檢測5’-tRF-GlyGCC診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.882，聯(lián)合CEA和CA19-9檢測，AUC則可提高至0.926，提示血漿5’-tRF-GlyGCC有成為診斷結(jié)直腸癌生物學(xué)標(biāo)志物的潛力。

3. 肝細(xì)胞癌：已知HBV或HCV持續(xù)感染是導(dǎo)致肝細(xì)胞癌的主要病因。一項(xiàng)使用高通量測序分析的研究[37]顯示，與肝炎病毒感染的非癌組織相比，5’-tiRNA在肝炎病毒相關(guān)肝細(xì)胞癌組織中總豐度降低，相對豐度發(fā)生改變。另有研究[38]顯示，肝細(xì)胞癌患者血漿外泌體中tRNA-ValTAC-3、tRNA-GlyTCC-5、tRNA-ValAAC-5、tRNA-GluCTC-5表達(dá)水平顯著上調(diào)，提示tsRNAs有望成為診斷肝細(xì)胞癌的生物學(xué)標(biāo)志物。

4. 胰腺癌：胰腺癌確診時(shí)多已處于中晚期，5年總體生存率不到10%，亟需尋找針對早期診斷和預(yù)后評估的新型生物學(xué)標(biāo)志物[39]。Xue等[40]的研究顯示，胰腺導(dǎo)管腺癌患者的血清和腫瘤組織中tsRNA-ValTAC-41表達(dá)顯著增高；相對于單獨(dú)檢測CA19-9，CA19-9聯(lián)合tsRNA-ValTAC-41檢測可將預(yù)測胰腺癌的AUC從0.947提高至0.949，且血清tsRNA-ValTAC-41水平與腫瘤分期顯著相關(guān)，血清水平較高者總生存期較短。Jin等[41]的研究顯示，胰腺癌患者的血清tRF-Pro-AGG-004和tRF-Leu-CAG-002存在差異表達(dá)，腫瘤組織中兩者的原位雜交分析可有效預(yù)測術(shù)后生存時(shí)間。Li等[42]的熒光原位雜交分析顯示，tRF-Pro-CGG(TRF-001391)在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中呈低表達(dá)，并與患者的TNM分期較晚、臨床生存期較短和預(yù)后不良相關(guān)，提示其可作為一個(gè)獨(dú)立的預(yù)后因素。

三、tsRNAs與消化系統(tǒng)腫瘤的治療

作為調(diào)節(jié)性RNA，tsRNAs在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，細(xì)胞增殖和凋亡異常是腫瘤細(xì)胞失控性生長的共同特征。部分異常表達(dá)的tsRNAs有望成為消化系統(tǒng)腫瘤治療新的靶點(diǎn)。

1. 胃癌：tRF-3019、tRF-3017A在胃癌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)，分別通過抑制抑癌基因FBXO47表達(dá)和靶向NELL2發(fā)揮促進(jìn)癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲或促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移的作用[43-44]。而tRF-5026a則在胃癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，通過調(diào)控PTEN/PI3K/AKT通路抑制癌細(xì)胞增殖、遷移[45]。

2. 結(jié)直腸癌：tRF-20-M0NK5Y93、tRF/miR-1280在結(jié)直腸癌細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，分別通過調(diào)控claudin-1和抑制Notch通路發(fā)揮抑制癌細(xì)胞遷移、侵襲或生長、轉(zhuǎn)移的作用[34,46]。而5’tiRNA-His-GTG受缺氧誘導(dǎo)上調(diào)，通過抑制Hippo通路發(fā)揮促結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和抗凋亡作用[35]。

3. 其他消化系統(tǒng)腫瘤：LeuCAG3’tsRNA在肝細(xì)胞癌中高表達(dá)，通過調(diào)控核糖體合成抑制腫瘤細(xì)胞凋亡[14]。TRF-001391在胰腺導(dǎo)管腺癌中低表達(dá)，預(yù)測其可調(diào)控PI3K/AKT通路，但具體生物學(xué)功能尚未明確[42]。

四、結(jié)語和展望

tsRNAs由成熟或前體tRNA在不同位點(diǎn)特異性剪切生成，廣泛存在于原核生物和真核生物轉(zhuǎn)錄組，是一類新的基因表達(dá)調(diào)控分子，具有多種生物學(xué)功能，參與應(yīng)激反應(yīng)、蛋白質(zhì)翻譯、核糖體生物合成以及調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)等多種生理和病理過程。目前，針對tsRNAs的相關(guān)研究雖已取得了一些進(jìn)展，但仍存在較多問題有待解決：如RNA降解常會產(chǎn)生隨機(jī)降解片段，然而tsRNAs的酶切位置卻有其明顯的規(guī)律性，提示tsRNAs是在某些特定機(jī)制作用下形成的；tsRNAs分子的生物發(fā)生機(jī)制尚未完全闡明，是否還有其他類型的tsRNAs？tsRNAs的確切作用機(jī)制還有哪些？tsRNAs表達(dá)異常是導(dǎo)致惡性腫瘤的原始事件，還是腫瘤惡性轉(zhuǎn)化過程中的失調(diào)結(jié)果？鑒于tsRNAs具有作為潛在的非侵入性生物學(xué)標(biāo)志物的價(jià)值，隨著新一代測序技術(shù)的發(fā)展，勢必會有越來越多的tsRNAs被發(fā)現(xiàn)和鑒定，從而為腫瘤臨床診斷和早期篩查提供新的生物學(xué)標(biāo)志物，同時(shí)通過調(diào)控tsRNAs表達(dá)，亦有望為腫瘤治療提供新的策略。