固相萃取-超高效液相色譜法測定魚腥草中的汞

謝慧英，譚洪濤，周鴻

江西省疾病預防控制中心，江西省食源性疾病診斷溯源重點實驗室，江西 南昌 330029

魚腥草為三白草科植物蕺菜（Houttuynia cordataThumb.）的新鮮全草或干燥地上部分，能清熱解毒、消腫療瘡、利尿除濕、濕熱止痢等，具有抗菌、抗病毒、提高機體免疫力、利尿等作用，是常見的藥食同源植物［1］。魚腥草在種植和生產(chǎn)加工過程中可能受到重金屬的外源性污染［2-3］，重金屬通過食物鏈在體內(nèi)代謝緩慢，易蓄積，當人體內(nèi)重金屬含量過量時會導致各種疾病的發(fā)生。如汞中毒對人體的神經(jīng)系統(tǒng)、心血管系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)產(chǎn)生危害，甚至致癌作用［4］。為保障人體健康，開展藥食同源中重金屬的分析研究具有重要意義。

重金屬的主要分析方法有原子熒光法［5］、光度法［6］和電感耦合等離子體質(zhì)譜法［7］。與這些方法相比，高效液相色譜法因具有分離能力強、成本低、檢出限低等優(yōu)點，已成功應(yīng)用于重金屬分析的研究［8-10］。由于藥食同源的重金屬基質(zhì)復雜且含量較低，因此測定前需對重金屬進行提取和凈化等富集前處理過程。固相萃取是常用的富集和凈化方法，而固相萃取吸附劑是固相萃取富集和凈化效果的關(guān)鍵步驟，常用的吸附材料有活性炭、C18、離子印跡聚合物、碳納米管等［11-14］。其中，碳納米管具有化學穩(wěn)定性高、吸附能力強、吸附容量大和價格低廉等優(yōu)點，少量的碳納米管填料能高效富集農(nóng)藥、多環(huán)芳烴、金屬離子等污染物，從而提高分析方法的靈敏度［15-18］。本文采用水浴消解提取魚腥草中的汞，使之與有機試劑絡(luò)合，以多壁碳納米管為填料，制備固相萃取小柱凈化金屬絡(luò)合物，結(jié)合超高效液相色譜建立了魚腥草中汞的測定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

ACQUITY UPLC H-Class 超高壓液相色譜儀（美國Waters 公司）；Milli-Q 超純水系統(tǒng)（美國Millipore 公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京市永光明醫(yī)療儀器有限公司）；MS304S 電子天平（梅特勒-托利多公司）。

汞標準溶液（1 000 μg/mL，國家標準物質(zhì)研究中心）；多壁碳納米管（MWCNTs，純度≥95%，直徑8～15 nm，長度50 μm）購自南京吉倉納米科技有限公司；聚丙烯固相萃取空柱（6 mL，天津博納艾吉爾科技有限公司）；濃硝酸、濃鹽酸（優(yōu)級純，上海國藥集團有限公司）；二乙基二硫代氨基甲酸鈉（DDTC，分析純，上海阿拉丁生化科技有限公司）；甲醇、乙腈、丙酮、乙醇（色譜級，美國Merck 公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 對照品溶液的配制 移取適量的汞標準溶液，用5%硝酸稀釋，配制成3.0 μg/mL 標準儲備液，在4 ℃保存。

1.2.2 樣品前處理 稱取2.0 g 魚腥草樣品于50 mL試管中，加入20 mL 王水（濃硝酸：濃鹽酸=1∶3），置于沸水浴中消解20 min 后，取出消解液，用水定容至100 mL，調(diào)節(jié)溶液pH 至9.0。在標樣和樣品消解液中分別加入0.05 mol/L DDTC 溶液200 μL，反應(yīng)5 min，待凈化。

準確稱取20 mg 多壁碳納米管，裝入6 mL 的聚丙烯固相萃取空柱中，均勻填充后，放置固相萃取柱專用篩板。固相萃取小柱使用前依次用15 mL甲醇和10 mL 純水活化，將待凈化樣液以1 mL/min的速度上樣，棄流出液，用10 mL 水淋洗，棄淋洗液，最后用8 mL 乙腈洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，用1 mL 甲醇溶解，過0.22 μm 濾膜，待測。

1.2.3 色譜條件 色譜條件：色譜柱，Waters BEH C18柱（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫，35 ℃；進樣量，10 μL；流速，0.3 mL/min；波長，280 nm；流動相，乙腈-水（80∶20）。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品溶液pH 的優(yōu)化

樣品的pH 值是影響多壁碳納米管對汞吸附效率的重要因素之一，因而分別用磷酸鹽緩沖溶液調(diào)節(jié)溶液pH 值至5～10，再進行固相萃取實驗，如圖1所示多壁碳納米管對汞的吸附能力隨著pH 值的增大而增大，當pH 值的增大到9 時，多壁碳納米管對汞的吸附量達到最大值，DDTC 在堿性條件下不穩(wěn)定性優(yōu)于酸性條件［19］，本實驗選擇溶液的pH 值為9。

圖1 pH 對萃取回收率的影響

2.2 DDTC 使用量的優(yōu)化

DDTC 能與許多金屬發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，形成穩(wěn)定的絡(luò)合物，是應(yīng)用較為廣泛的金屬螯合劑［20］?？疾霥DTC 的使用量對絡(luò)合反應(yīng)的影響：從圖2 可看出，當DDTC 的使用量由120 μL 增加至200 μL時，目標物的峰響應(yīng)逐漸呈上升趨勢；使用量為200 μL～250 μL 時，目標物峰面積的響應(yīng)逐漸下降，因而實驗最終加入200 μL 的DDTC 溶液與汞形成Hg-DDTC 絡(luò)合物。

圖2 DDTC 使用量的影響

2.3 洗脫溶劑的優(yōu)化

魚腥草消解后有一定的干擾物質(zhì)，為實現(xiàn)最佳凈化效果，考察了甲醇、乙腈、丙酮、乙醇等不同洗脫溶劑對汞回收率的影響，結(jié)果表明，乙腈的洗脫效果更好（見圖3）；為保證固相萃取柱中富集的待測目標物完全洗脫，對比不同體積的乙腈洗脫同一樣品，從4 mL～10 mL 遞增洗脫液測定回收率。結(jié)果表明，當乙腈的體積小于8 mL 時，回收率隨洗脫液體積的增加而提高，當洗脫液的體積大于8 mL 后，隨洗脫液體積的增加回收率趨向穩(wěn)定，因此選擇8 mL的乙腈洗脫。

圖3 不同洗脫液的影響

2.4 專屬性實驗

在本實驗的條件下，K+、Na+、Ca2+、Mg2+、SO42-、CO32-等離子不能與DDTC 形成絡(luò)合物，因而不會干擾實驗；基質(zhì)中加入較低濃度的Ni2+、Cd2+、Cu2+，這三種金屬離子能與DDTC 發(fā)生絡(luò)合反應(yīng)，但可以在最佳優(yōu)化條件下，通過液相色譜條件達到分離，以減少本實驗的干擾，空白溶液在出峰位置無干擾，專屬性良好。見圖4。

圖4 空白溶液(a)、樣品溶液(b)和加標溶液(c)的色譜圖

2.5 工作曲線與檢出限

分別移取0.10 mL、0.50 mL、1.5 mL、3.0 mL、5.0 mL、10.0 mL 汞標準儲備液（3.0 μg/mL）于100 mL容量瓶中，調(diào)節(jié)溶液pH 至9.0，加入DDTC 溶液絡(luò)合，通過多壁碳納米管固相萃取柱凈化。在最佳測定條件下，Hg-DDTC 絡(luò)合物在3.0～300 μg/L 濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，線性方程為Y=11 467X+8 297，相關(guān)系數(shù)（r）大于0.999；Hg-DDTC 絡(luò)合物的檢出限和定量限分別以3 倍和10 倍信噪比（S/N）計算，Hg-DDTC 絡(luò)合物的檢出限為0.15 μg/L，定量限為0.5 μg/L。

2.6 加標回收實驗

精密稱取已測得含量（0.004 6 mg/kg）的同一份魚腥草樣品6 份，每份2 g，分別加入0.20 mL汞標準溶液（0.06 μg/mL），按“1.2.2”項下方法制備供試液，在上述“1.2.3”條件下進行分析測定，計算汞的回收率，測得汞的加標回收率為73.6%～84.8%，RSD 為5.7%，結(jié)果見表1。

表1 加標回收率實驗結(jié)果（n=6）

2.7 樣品的測定

對市售的10 份魚腥草按“1.2.2”項下方法進行平行處理，以“1.2.3”條件下進行分析測定，結(jié)果見表2。10 份魚腥草樣品均未超過國家標準GB 2762-2017 規(guī)定的限量0.01 mg/kg 要求。

表2 樣品的測定結(jié)果（mg/kg）

3 結(jié)論

制備價格低廉、吸附能力強的多壁碳納米管固相萃取柱，通過固相萃取前處理，消除了魚腥草中的基質(zhì)干擾并實現(xiàn)Hg-DDTC 的富集，優(yōu)化了前處理條件，建立固相萃取-超高效液相色譜法測定魚腥草中汞的方法。本方法靈敏、可靠，為藥食同源中的重金屬分析提供借鑒方法。