遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理對(duì)對(duì)乙酰氨基酚誘導(dǎo)急性肝損傷小鼠氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)的保護(hù)作用

鄭偉，黨珊，張智勇，萬(wàn)永，劉司南，?；⒘?/p>

（陜西省人民醫(yī)院，陜西 西安 710068，1.肝膽外科，2.老年消化科；3.西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院 肝膽外科，陜西 西安 710061）

近年來(lái)，由對(duì)乙酰氨基酚（acetaminophen，APAP）的不當(dāng)使用所致的重度肝損傷、肝衰竭在臨床上呈上升趨勢(shì)[1]。如何減輕以APAP為代表的急性藥物性肝損傷是現(xiàn)階段肝臟損傷控制領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理（remote ischemic preconditioning，RIPC）即通過(guò)對(duì)一個(gè)組織或器官進(jìn)行一次或數(shù)次非致命性的缺血再灌注處理，可以保護(hù)一個(gè)遠(yuǎn)隔器官免受致命性的缺血再灌注損傷[2]。目前已證實(shí)，RIPC可緩解肝臟缺血再灌注損傷，保護(hù)肝移植受體術(shù)后肝功能[3]。但RIPC對(duì)于APAP誘導(dǎo)的藥物性肝損傷是否有效，鮮有報(bào)道。本研究旨在通過(guò)構(gòu)建APAP誘導(dǎo)的小鼠藥物性肝損傷模型，觀察RIPC對(duì)模型小鼠肝功能、氧化應(yīng)激水平、炎癥因子水平、組織病理學(xué)方面的影響，探討可能的作用機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 主要材料和試劑

6～8周齡、體質(zhì)量22～25 g的C57BL/6雄性小鼠，由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供[許可證號(hào)：SYXK（陜）2016-006]。血紅素加氧酶-1（HO-1）抗體，美國(guó)Abcam公司。Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白-1（Keap1）、核因子E2相關(guān)因子2（Nrf2）抗體，美國(guó)Santa Cruz公司。血清腫瘤壞死因子-α（TNF-α）與白介素-6（IL-6）檢測(cè)試劑盒，深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司。谷胱甘肽酶（GSH）測(cè)試盒、超氧化物歧化酶（SOD）測(cè)試盒和丙二醛（MDA）測(cè)試盒，南京建成生物工程研究所。RIPA裂解液，上海碧云天生物技術(shù)有限公司。APAP溶液的配制：將0.6 g APAP粉劑溶于100 mL生理鹽水中，在40 ℃水浴鍋中晃動(dòng)充分溶解、混勻，按300 mg/kg即50 mL/kg的劑量給藥準(zhǔn)備，每只小鼠約20 g，平均給藥劑量約1 mL。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)分組和模型制作

實(shí)驗(yàn)分組：40 只BALB/c雄性小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法平均分為4組：（1）空白對(duì)照組（C組，不做任何處理）；（2）假手術(shù)組（S組，小鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL生理鹽水）；（3）肝損傷組（A組，腹腔注射1 mL APAP溶液）；（4）遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理組（R組，小鼠遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL APAP溶液）。各組小鼠均在處理后16 h后摘眼取血，脫頸處死后獲取肝組織樣本。

模型制作：（1）首先麻醉小鼠，將25 mg氯胺酮和2.5 mL甲苯噻嗪混合比例配制好麻醉藥，每只小鼠腹腔注射（5 mL/kg）。（2）遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理：于小鼠的右后肢中上部，取無(wú)彈性棉質(zhì)繩帶捆綁結(jié)扎5 min造成肢體缺血后，再松開(kāi)繩帶，讓血液再灌注5 min；重復(fù)上述操作4 個(gè)循環(huán)，完成造模。通過(guò)足部顏色及下肢股動(dòng)脈搏動(dòng)情況來(lái)顯示血液流動(dòng)情況，評(píng)價(jià)遠(yuǎn)端局部缺血的效果。（3）S組為遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL生理鹽水。R組為遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理后，間隔5 min，腹腔注射1 mL APAP溶液。

1.2.2 血清ALT、AST、TNF-a、IL-6水平的測(cè)定：根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。

1.2.3 肝臟活性氧（ROS）含量檢測(cè)：取出分離后的肝臟組織制作冰凍切片，根據(jù)DHE-ROS活性氧檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)行熒光定性分析，藍(lán)色熒光為細(xì)胞核，紅色熒光為ROS陽(yáng)性表達(dá)。

1.2.4 氧化應(yīng)激程度的測(cè)定：根據(jù)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)指示，測(cè)定肝組織MDA、GSH、SOD含量。

1.2.5 Keap1、Nrf2和HO-1蛋白的測(cè)定：根據(jù)RIPA裂解液使用說(shuō)明書(shū)制備肺組織勻漿，肝組織與RIPA裂解液的比例為1 mg∶7.5 μL，用玻璃勻漿器上下、旋轉(zhuǎn)充分碾磨。在冰上裂解25 min后，以12 000 r/min離心20 min，離心半徑7 cm，取上清，利用Western blotting檢測(cè)各組小鼠肝組織Keap1、Nrf2和HO-1表達(dá)的變化，應(yīng)用β-actin作為內(nèi)參校正。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，正態(tài)分布的計(jì)量資料以（）表示，組間比較采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 血清ALT、AST水平變化

與C組血清ALT[（87.85±9.19）U/L]和AST[（50.93±11.94）U/L]、S組血清ALT[（88.26±3.58）U/L]和AST[（51.88±10.94）U/L]比較，A組血清[ALT（5 643.20±688.21）]U/L、AST[（4 479.10±834.46）U/L]水平和R組血清[ALT（3 730.12±599.33）U/L]、AST[（3 592.52±646.13）U/L]水平均明顯升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；R組血清ALT和AST水平低于A組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。具體見(jiàn)圖1。

圖1 RIPC對(duì)APAP誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠血清ALT、AST水平的影響

2.2 血清TNF-α、IL-6水平變化

與C組血清TNF-α[（43.98±5.66）pg/mL]和IL-6[（71.55±9.74）pg/mL]、S組血清TNF-α[（47.80±9.54）pg/mL]和IL-6[（73.88±8.66）pg/mL]比較，A組血清TNF-α[（337.75±48.57）pg/mL]和IL-6[（938.03±160.90）pg/mL]水平均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；R組血清TNF-α[（235.55±65.77）pg/mL]和IL-6[（713.48±87.78）pg/mL]水平明顯高于C組和S組，低于A組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。具體見(jiàn)圖2。

圖2 RIPC對(duì)APAP誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠血清TNF-α和IL-6水平的影響

2.3 肝臟ROS含量變化

熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，與C組和S組對(duì)比，A組可見(jiàn)較多紅色熒光，ROS產(chǎn)生較多。與A組相比，R組紅色熒光明顯減少，ROS產(chǎn)生減少。具體見(jiàn)圖3。

圖3 RIPC對(duì)APAP誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠肝組織ROS的影響（×200）

2.4 肝組織GSH、SOD水平變化

與C組肝組織GSH[（14.30±1.21）mg/g protein]和SOD[（17.06±1.64）U/mg protein]、S組肝組織GSH[（14.19±2.96）mg/g protein]和SOD[（18.27±1.58）U/mg protein]比較，A組肝組織GSH[（7.13±0.89）mg/g protein]和SOD[（8.15±0.65）U/mg protein]活性降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；R組肝組織GSH[（10.36±0.96）mg/g protein]和SOD[（11.14±1.61）U/mg protein]活性較A組明顯升高，但仍低于C組和S組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。具體見(jiàn)圖4。

圖4 RIPC對(duì)APAP誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠肝組織GSH、SOD活性的影響

2.5 肝組織MDA水平變化

與C組肝組織MDA[（2.88±0.87）nmol/g protein]和S組肝組織MDA[（2.70±0.59）nmol/g protein]比較，A組肝組織MDA[（13.20±1.94）nmol/g protein]含量增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）；R組肝組織MDA[（8.50±0.82）nmol/g protein]活性較C組和S組明顯上升，較A組明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。具體見(jiàn)圖5。

圖5 RIPC對(duì)APAP誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠肝組織MDA含量的影響

2.6 肝組織Keap1、Nrf2和HO-1表達(dá)變化

A組肝臟Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為0.75±0.06、0.56±0.04和0.85±0.07，顯著低于C組的1.08±0.09、1.06±0.12和1.07±0.14，以及S組的1.19±0.22、1.16±0.32和1.22±0.24，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。R組肝組織Keap1、Nrf2和HO-1蛋白相對(duì)表達(dá)量分別為1.47±0.26、1.94±0.22和1.66±0.18，較前三組均明顯上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05）。如圖6所示。

圖6 RIPC對(duì)APAP誘導(dǎo)急性藥物性肝損傷小鼠Keap1、Nrf2和HO-1蛋白表達(dá)的影響

3 討論

因APAP濫用而導(dǎo)致的急性肝損傷逐年上升，已成為歐美國(guó)家急性肝衰竭的首要病因[4]。隨著近年來(lái)加速康復(fù)外科理念在國(guó)內(nèi)的廣泛推進(jìn)，APAP等非甾體類藥物在圍術(shù)期疼痛管理中的應(yīng)用也越來(lái)越廣泛[5]。APAP不破壞胃黏膜，對(duì)血小板功能也不產(chǎn)生影響，但其潛在的肝損傷、腎損傷等相關(guān)不良事件日益受到關(guān)注[6]，引發(fā)了研究人員對(duì)非甾體類藥物安全性的擔(dān)憂。對(duì)以APAP為代表的藥物性肝損傷，目前仍缺乏特異性的治療手段，病情嚴(yán)重的患者往往需要進(jìn)行血液灌流、血液透析以及大劑量保肝利膽藥物的應(yīng)用，必要時(shí)還需要進(jìn)行肝移植。對(duì)于如何預(yù)防和治療APAP源性肝損傷已逐漸成為目前國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。

缺血預(yù)處理最早由Murry等[7]于1986 年提出，后經(jīng)Przyklenk等[8]的改進(jìn)，1993年正式提出RIPC的概念。研究人員發(fā)現(xiàn)，對(duì)冠狀動(dòng)脈旋支進(jìn)行短暫的缺血再灌注可以顯著減少冠脈左前降支阻塞引起的心肌梗死面積。在肝損傷方面，Zoltán等[9]在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，RIPC可顯著緩解肝臟缺血再灌注損傷。Jung等[3]發(fā)現(xiàn)，在肢體遠(yuǎn)端行袖帶加壓來(lái)實(shí)現(xiàn)RIPC可顯著降低肝移植受體術(shù)后肝功能的異常增高。RIPC發(fā)揮保護(hù)作用的機(jī)制十分復(fù)雜，有研究認(rèn)為可能是通過(guò)體液通路、神經(jīng)通路及機(jī)體系統(tǒng)性的應(yīng)答來(lái)實(shí)現(xiàn)的[10]。

本研究以APAP誘導(dǎo)的肝損傷小鼠為模型，分別從肝功能水平、氧化應(yīng)激程度、炎癥因子水平等方面進(jìn)行研究，并探討RIPC有效減輕APAP藥物性肝損傷的可能途徑。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，APAP可導(dǎo)致小鼠肝內(nèi)產(chǎn)生大量ROS，抑制抗氧化酶GSH、SOD的活性，造成機(jī)體脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA的異常堆積，釋放TNF-α和IL-6 等炎性因子。而通過(guò)對(duì)APAP肝損傷小鼠進(jìn)行遠(yuǎn)端缺血預(yù)處理，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，RIPC可以顯著改善小鼠血清ALT、AST水平，起到明顯的保護(hù)肝臟的作用。此外，我們通過(guò)ELISA檢測(cè)血清中炎癥因子TNF-α和IL-6的水平發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過(guò)RIPC處理后，小鼠的炎癥因子水平顯著降低，說(shuō)明RIPC可減輕APAP導(dǎo)致的藥物性肝損傷的炎癥過(guò)程及炎性因子的釋放。而對(duì)氧化應(yīng)激產(chǎn)物ROS、MDA和抗氧化系統(tǒng)主要酶類GSH和SOD的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，在RIPC的作用下，ROS含量、MDA水平明顯降低，脂質(zhì)過(guò)氧化程度減輕，抗氧化物質(zhì)GSH、SOD的消耗也明顯減少，證明RIPC可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激過(guò)程，減少體內(nèi)抗氧化物質(zhì)的消耗，對(duì)藥物性肝損傷發(fā)揮保護(hù)性作用。對(duì)于上述改變，本研究通過(guò)Western blotting初步發(fā)現(xiàn)RIPC對(duì)APAP肝損傷的上述保護(hù)作用有Keap1、Nrf2和HO-1的參與。

Keap1-Nrf2信號(hào)通路由于可抵抗內(nèi)外界氧化和化學(xué)物質(zhì)等刺激導(dǎo)致的氧化應(yīng)激反應(yīng)，在機(jī)體應(yīng)對(duì)各種外來(lái)?yè)p傷的防御中起著非常重要的作用，是機(jī)體內(nèi)最重要的內(nèi)源性抗氧化信號(hào)通路[11]。生理狀態(tài)下，Keap1與Nrf2相結(jié)合存在于包漿中，當(dāng)細(xì)胞受到活性氧（ROS）等刺激后，Nrf2與Keap1解偶聯(lián)，活化的Nrf2 轉(zhuǎn)入細(xì)胞核內(nèi)，激活其下游包括HO-1 在內(nèi)的多種靶蛋白的表達(dá)來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體內(nèi)氧化還原平衡，使機(jī)體恢復(fù)到正常的生理狀態(tài)[12]。HO-1作為血紅素降解的限速酶，其廣泛分布于哺乳動(dòng)物的多種組織細(xì)胞中，可由多種刺激因子誘導(dǎo)表達(dá)，如氧化應(yīng)激、內(nèi)毒素等[13]。HO-1的激活，可明顯抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)、炎癥反應(yīng)和腫瘤的生長(zhǎng)[14]，現(xiàn)有研究證實(shí)其在APAP肝損傷中具有保護(hù)作用[15]。本研究中，Western blotting結(jié)果顯示Keap1、Nrf2和HO-1在A組中的蛋白相對(duì)表達(dá)量明顯低于S組和C組，在R組中明顯回升，說(shuō)明Keap1、Nrf2和HO-1分子很可能參與了RIPC的保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，RIPC可通過(guò)減輕氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)對(duì)急性藥物性肝損傷發(fā)揮保護(hù)作用。RIPC在臨床中具有便捷易操作的巨大優(yōu)勢(shì)，其發(fā)揮肝臟保護(hù)功能的調(diào)控機(jī)制值得未來(lái)進(jìn)一步深入研究。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突。