4種豆科植物根際土壤真菌群落特征與土壤理化因子間相關(guān)性分析

蘇貝貝， 張 英， 道日娜

(青海大學農(nóng)牧學院，三江源區(qū)高寒草地生態(tài)省部共建重點實驗室， 青海 西寧 810016)

豆科牧草是豆科飼用植物的總稱，通過固氮作用對節(jié)約草地氮資源做出貢獻，同時具有良好的飼用價值，極大地促進了草原植被的建立，對我國畜牧業(yè)的發(fā)展十分重要[1]。扁蓿豆為豆科苜蓿屬矩莢苜蓿組的多年生草本植物，廣泛分布于我國北方的典型草原、高山草原和荒漠化草原，具有較強的抗寒、抗旱、耐鹽堿、耐貧瘠等優(yōu)點，同時，富有較高的營養(yǎng)價值[2]。紫花苜蓿號稱“牧草之王”，其根系比較發(fā)達，擁有較好的適應(yīng)能力、能夠防風固沙、改良土壤等多種特性[3]。紅豆草營養(yǎng)豐富，含有大量縮合單寧，牲畜喜食且不得膨脹病，被譽為“牧草皇后”[4]。蠶豆俗稱佛豆、胡豆、寒豆等，屬越年生或一年生豆科野豌豆屬草本植物，富含蛋白質(zhì)、膳食纖維、微量元素等營養(yǎng)物質(zhì)[5]。

土壤是豆科牧草營養(yǎng)吸收和生長發(fā)育的重要場所，土壤質(zhì)量的好壞直接或間接影響牧草品質(zhì)與產(chǎn)量。目前，對豆科植物根際土壤生態(tài)質(zhì)量的研究，主要集中于微生物量、土壤養(yǎng)分、微生物活性及可培養(yǎng)真菌的初步分類等[6-9]方面，但從土壤微生物群落結(jié)構(gòu)角度探討豆科植物的研究相對較少[10]。土壤微生物是土壤生態(tài)環(huán)境中最為重要且對環(huán)境變化極其敏感的生物活性因子，對土壤生態(tài)系統(tǒng)的健康狀況與植被的生長發(fā)育都會產(chǎn)生重要影響[11]。真菌作為微生物區(qū)系的主要成員，具有分解有機質(zhì)，為植物提供養(yǎng)分的功能，是土壤生態(tài)系統(tǒng)是否健康的指示物[12]。近年來，對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)和功能的探究受到了學者們的高度關(guān)注。牟紅霞等[13]研究發(fā)現(xiàn)，隨著種植年限的變化，土壤真菌群落變化表現(xiàn)為先減小后增大的變化趨勢，且與土壤理化性質(zhì)具有顯著相關(guān)關(guān)系，pH值、速效氮和有機碳是影響紫花苜蓿土壤真菌群落組成的主要因子。劉鳳紅[14]研究表明，藍莓系內(nèi)生真菌的群落組成和結(jié)構(gòu)因其品種的不同而存在一定差異，且各菌屬在不同品種藍莓根系內(nèi)的優(yōu)勢度也不同。

高寒地區(qū)的自然條件較為特殊，海拔高，氣候寒冷干旱，生態(tài)環(huán)境脆弱，挖掘極端生境下的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)特征是未來研究的重要方向。前人主要通過探索培養(yǎng)微生物、PCR-DGGE、16S rRNA基因文庫構(gòu)建技術(shù)來了解土壤微生物群落結(jié)構(gòu)[15-16]。這些方法存在通量低、信息量少，并不能全面反應(yīng)出土壤微生物的物種結(jié)構(gòu)及其豐度[17]。因此，本研究采用Illumina HiSeq PE250高通量測序技術(shù)對4種豆科牧草根際土壤進行測序，全面反應(yīng)土壤中真菌的多樣性，探明4種豆科牧草根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)對土壤理化性質(zhì)的響應(yīng)，旨在為高寒地區(qū)豆科牧草根際土壤真菌多樣性的深入研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)理論依據(jù)，對維護高寒草地生態(tài)系統(tǒng)平衡有重要意義。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

試驗地位于青海省牧草良種繁育場(N 35°15′28″，E 100°39′16″)，平均海拔高程3 220 m，年平均氣溫為0.2℃，全年≥0℃的活動積溫為1 503℃，全年無絕對無霜期，年平均降水量為430.0 mm，年平均蒸發(fā)量為1 352.5 mm。該地區(qū)海拔高，冬春干旱，多風而寒冷、夏季涼爽，雨熱同季，適合牧草生長。

1.2 樣地設(shè)置及土樣采集

在2019年4月20日播4種豆科植物草種，種植面積為5 m×8 m，條播，行距為40 cm，每個處理田進行3次重復(fù)，播種量分別為扁蓿豆Medicagoruthenicu(樣品編號TDB)24 kg·hm-2、紫花苜蓿Medicagosativa(樣品編號TDZ)22.5 kg·hm-2、紅豆草Onobrychisviciifolia(樣品編號TDH)30 kg·hm-2、蠶豆Viciafaba(樣品編號TDC)220 kg·hm-2，隨機區(qū)組試驗設(shè)計如圖1所示。土壤樣品采集時間為2019年8月20日，具體采集方法如下：采用5點取樣法取樣，使用土鉆采取0～20 cm植物根系及土壤樣品，抖落根系大塊土壤，收集根上0～5 mm的土壤作為根際土[18]，立即裝入無菌樣品采集袋，所有樣品在低溫條件下帶回實驗室，樣品分為兩份，一份自然風干過2 mm篩用于土壤理化性質(zhì)的測定，另外一份-80℃冰箱保存，用于土壤微生物總DNA提取。

圖1 隨機區(qū)組試驗設(shè)計圖

1.3 測定指標與方法

1.3.1土壤理化指標 土壤理化性質(zhì)的測定方法如下[19]：利用酸度計電位法測定土壤pH值；利用氯化鉀浸提-分光光度計法測定土壤速效氮含量；利用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定土壤速效磷含量；利用醋酸銨浸提-火焰光度計法測定土壤速效鉀含量；利用納氏比色法測定土壤全氮含量的測定采用；利用鉬銻抗比色法測定土壤全磷含量；利用火焰光度計法測定全鉀含量；利用高溫外熱重鉻酸鉀氧化—容量法測定有機質(zhì)含量。

1.3.2土壤總DNA提取及ITS基因擴增 采用OMEGA土壤DNA提取試劑盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取豆科植物根際土壤樣品中的微生物基因組DNA，為了降低實驗誤差，每個樣品重復(fù)3次。采用Illumina HiSeq PE250測序平臺的通用引物對真菌ITS1區(qū)域進行PCR擴增，引物為ITS1F(5′-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3′)和ITS2R(5′-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3′)。PCR擴增條件參照Miao等[20]方法。將電泳檢測合格的PCR產(chǎn)物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

1.4 生物信息學分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴增引物序列從下機數(shù)據(jù)中拆分出各樣品數(shù)據(jù)，截去Barcode和引物序列后對Reads進行拼接[21]得到原始Tags數(shù)據(jù)(Raw Tags)；對原始測序數(shù)據(jù)進行質(zhì)量過濾并去除嵌合體序列，進而得到優(yōu)質(zhì)Tags數(shù)據(jù)；在相似性97%的水平上對序列進行聚類，用Mothur[22]方法與SILVA軟件的SSUrRNA數(shù)據(jù)庫進行物種注釋(閾值0.8～1.0)；采用PyNAST軟件[23]與GreenGene數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)信息進行多序列比對，最后對測序數(shù)據(jù)進行標準化處理，進一步進行α多樣性分析(Alpha Diversity)、β多樣性分析(Beta Diversity)和顯著物種差異分析等來挖掘樣品之間的差異。通過RStudio軟件繪制熱圖，采用非加權(quán)配對平均法進行層次聚類繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.5 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過Excel 2013處理，采用SPSS 21.0軟件對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析(One-way ANOVA)，Duncan新復(fù)極差法進行差異顯著性檢驗(P<0.05)。土壤理化指標與真菌群落之間的關(guān)系，采用Pearson相關(guān)系數(shù)法進行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)

4種不同豆科植物根際土壤理化性特征測定結(jié)果如表1所示，結(jié)果表明4種豆科植物根際土壤的pH值在8.02～8.25之間，其差異顯著(P<0.05)，全氮含量變化范圍為1.1～2.79 g·kg-1，全磷含量范圍在1.96～3.44 g·kg-1之間，全鉀含量范圍為23.85～24.81 g·kg-1，TDC樣品和其他3個樣品全鉀含量差異顯著，速效氮含量范圍為78～187 mg·kg-1，速效磷含量范圍為19.3～75.2 mg·kg-1，速效鉀含量范圍為78～168 mg·kg-1，有機質(zhì)含量范圍為16.39～41.73 g·kg-1，TDB的土壤速效氮、速效磷和速效鉀，以及有機質(zhì)含量均遠遠小于其他3個樣品。

表1 4種豆科植物根際土壤理化因子特征

2.2 土壤真菌群落豐度與Alpha多樣性分析

通過對4個土壤樣品進行高通量測序，共得到267 532條有效序列，序列長度相對集中，平均長度分別為260 bp，256 bp，238 bp，243 bp，聚類共得到966個OTUs。各樣品測序覆蓋度均在99.9%以上，并且趨于平緩的稀釋曲線，說明本研究測序數(shù)據(jù)合具有可靠性，能夠準確提供土壤真菌群落的真實信息(圖2)。如表2所示，各樣品真菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))依次為TDC>TDZ>TDH>TDB，真菌群落多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener)指數(shù)依次為TDC>TDB>TDH>TDZ。在97%的相似度水平下，得到了每個樣品的OTU個數(shù)，如圖3所示，所有樣品中共有OTUs數(shù)目為61個，其中TDB，TDC，TDH，TDZ所特有的OTUs數(shù)目分別為44，50，26和19個。

表2 4種豆科植物根際土壤樣品序列數(shù)統(tǒng)計、豐富度與多樣性指數(shù)

圖2 樣品稀釋曲線

圖3 樣品韋恩圖

2.3 土壤真菌群落分布特征

2.3.1門水平上的組成 如圖4所示，在4種豆科植物根際土壤中，各樣地土壤真菌分屬于9個門，相對豐度>1%的菌群分別為子囊菌門(Ascomycota)、被孢霉門(Mortierellomycota)、擔子菌門(Basidiomycota)、壺菌門(Chytridiomycota)、絲足蟲門(Cercozoa)、油壺菌門(Olpidiomycpta)、球囊菌門(Glomeromycota)、Aphelidiomycota、毛霉門(Mucoromycota)。其中，子囊菌門(Ascomycota)在4組土樣中的相對豐度為39.52%～84.51%，是最優(yōu)勢菌門，遠遠大于次優(yōu)勢菌門——被孢霉門(Mortierellomycota)，相對豐度為6.94%～24.65%；各組土樣在門分類水平上的菌群落豐度分別為：子囊菌門(Ascomycota)在各組土樣中相對豐度高低為TDZ>TDH>TDC>TDB；被孢霉門(Mortierellomycota)在各組土樣中相對豐度高低為TDC>TDB>TDH>TDZ。

圖4 門分類水平下的真菌群落相對豐度

2.3.2屬水平上的組成 如圖5所示，在各樣地中真菌在屬分類水平上，相對豐度>1%的分別為四枝孢屬(Tetracladium)、被孢霉屬(Mortierella)、小不整球殼屬(Plectosphaerella)、毛殼菌屬(Chaetomium)、小畫線殼屬(Monographella)、假裸囊菌屬(Pseudogymnoascus)、線黑粉酵母屬(Filobasidium)、小鬼傘屬(Coprinellus)、油壺菌屬(Olpidium)、鐮刀霉屬(Fusarium)。其中，在TDB土樣中，小不整球殼屬(Plectosphaerella)為最優(yōu)勢屬，相對豐度為23.23%；被孢霉屬(Mortierella)為次優(yōu)勢屬，相對豐度為14.64%。TDC土樣中，被孢霉屬(Mortierella)為最優(yōu)勢屬，相對豐度為23.93%；次優(yōu)勢屬為四枝孢屬(Tetracladium)，相對豐度為4.75%。然而，在TDH土樣中，四枝孢屬(Tetracladium)為最優(yōu)勢屬，相對豐度為42.29%；次優(yōu)勢屬為被孢霉屬(Mortierella)，相對豐度為6.93%。同樣，在TDZ土樣中，四枝孢屬(Tetracladium)為最優(yōu)勢屬，相對豐度為6.86%；次優(yōu)勢屬為被孢霉屬(Mortierella)，相對豐度為6.77%。

圖5 屬分類水平下的真菌群落相對豐度

2.4 Beta多樣性分析

通過以Rstudio軟件的P-heatmap包繪制聚類熱圖，從聚類中可根據(jù)顏色梯度的變化直觀看出兩兩樣品間的差異性。聚類結(jié)果如圖6所示，TDZ樣品和TDC樣品的真菌群落組成及豐度差異最小，而和TDB樣品的真菌群落組成及豐度差異最大。

圖6 豆科牧草根際土壤樣品加權(quán)UniFrac的heatmap圖

基于Beta多樣性分析得到的四種距離矩陣，通過R語言工具采用非加權(quán)配對平均法(UPGMA)對樣品進行層次聚類，以判斷各樣品間物種組成的相似性。從圖7中可以看出TDZ樣品和TDC樣品的真菌組成及豐度相似性較高，而和TDB樣品的真菌群落結(jié)構(gòu)差異較大。

圖7 基于OTU的豆科牧草根際土壤樣品樹狀聚類圖

2.5 土壤理化性質(zhì)與真菌優(yōu)勢類群的相關(guān)性

土壤中微生物物種豐度與土壤理化性質(zhì)關(guān)系密切，門水平豐度較高物種與土壤理化相關(guān)性分析表明(表3)。土壤pH值與子囊菌門呈負相關(guān)，與其他理化因子呈正相關(guān)。土壤全氮、速效磷、有機質(zhì)與子囊菌門、壺菌門、球囊菌門、Aphelidiomycota呈正相關(guān)；與絲足蟲門、油壺菌門、毛霉門呈極顯著負相關(guān)(P<0.01)；與被孢霉門、擔子菌門呈負相關(guān)。土壤全磷與子囊菌門、被孢霉門、壺菌門、球囊菌門、Aphelidiomycota呈正相關(guān)；與油壺菌門呈顯著負相關(guān)(P<0.05)；與擔子菌門、絲足蟲門、毛霉門呈負相關(guān)。土壤全鉀與壺菌門、球囊菌門、Aphelidiomycota呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)；與被孢霉門呈負相關(guān)；與子囊菌門、擔子菌門、絲足蟲門、油壺菌門、毛霉門呈負相關(guān)。土壤速效氮、速效鉀與子囊菌門呈負相關(guān)；與其他理化因子負相關(guān)。

表3 門水平物種與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

2.6 土壤理化性質(zhì)與真菌多樣性的相關(guān)性

對4種豆科植物根際土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明(表4)，土壤真菌群落豐富度Chao1指數(shù)與土壤全磷含量呈極顯著正相關(guān)(P<0.01)，與土壤有機質(zhì)含量呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；土壤真菌群落多樣性指數(shù)Shannon與土壤pH值、全磷、全鉀、有機質(zhì)含量呈正相關(guān)，與土壤全氮、速效氮、速效磷、速效鉀含量呈負相關(guān)。

表4 不同豆科植物根際土壤真菌群落多樣性與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

3 討論

土壤微生物不僅可以調(diào)節(jié)植物群落的結(jié)構(gòu)和多樣性，在一定程度上還影響著植物與微生物群落間的互相適應(yīng)作用[24-25]。真菌能夠?qū)ι鷳B(tài)系統(tǒng)的健康變化做出敏銳反應(yīng)，并且積極促進碳、氮在土壤中的轉(zhuǎn)化利用，尤其是在植物有機體分化的前期過程中，真菌比細菌和放線菌更具活性[26]。

有研究發(fā)現(xiàn)土壤pH值是影響真菌群落結(jié)構(gòu)的重要環(huán)境因子，對真菌的生長和繁殖具有顯著影響[27]。當土壤有機質(zhì)含量超過其所能承受的閾值時，真菌多樣性就會降低[28]。張雪等[29]研究表明，艾比湖濕地6種鹽生植物根際土壤真菌群落多樣性及豐富度存在差異。結(jié)合本研究對同一地區(qū)種植的4種豆科牧草根際土壤真菌進行高通量測序分析，Alpha多樣性分析結(jié)果表明，各樣地真菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))依次為TDC>TDZ>TDH>TDB，真菌群落多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener指數(shù))依次為TDC>TDB>TDH>TDZ。β多樣性分析結(jié)果表明，TDZ樣品和TDC樣品的真菌群落組成及豐度差異最小，而和TDB樣品的真菌群落組成及豐度差異最大。李金前等[30]研究發(fā)現(xiàn)，3種園林植物土壤中的真菌數(shù)量和群落結(jié)構(gòu)差異顯著。這與本研究中同一地區(qū)不同種豆科植物根際土壤真菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著結(jié)果相一致，土壤環(huán)境是造成牧草根際土壤真菌群落多樣性差異的原因。

優(yōu)勢菌是決定微生物群落平衡的重要因素，能夠影響微生物群落的組成和結(jié)構(gòu)。蘇小惠等[31]對同一地區(qū)不同苧麻品種根際微生物多樣性群落結(jié)構(gòu)進行了分析，結(jié)果表明，真菌主要以子囊菌門、接合菌門和擔子菌門為主。趙興麗等[32]對不同品種茶樹根際土壤真菌群落多樣性及結(jié)構(gòu)特征進行研究，試驗結(jié)果顯示，擔子菌門、子囊菌門和接合菌門為優(yōu)勢真菌群。汪焱等[33]對高寒區(qū)不同地域燕麥根際土壤微生物多樣性進行研究，結(jié)果指出，真菌主要以子囊菌門，球灰霉菌門，擔子菌門，壺菌門，油壺菌門，球囊菌門子為主，這與本研究結(jié)果相似，但群落組成相對豐度不同。張俊忠等[34]研究結(jié)果表明，不同草地類型土壤真菌的構(gòu)成相似，但是土壤真菌的數(shù)量、種類、結(jié)構(gòu)組成不同。結(jié)合本研究，4個土壤樣品中的真菌群落在門水平上，主要以子囊菌門最為豐富，其次為被孢霉門、擔子菌門。進一步屬水平上分析，小不整球殼屬(Plectospharella)在TDB土樣中最為豐富，相對豐度為23.23%；TDC土樣中，被孢霉屬為最優(yōu)勢屬，相對豐度為23.93%；四枝孢屬在TDH、TDZ樣地中最豐富，相對豐度分別為42.29%，6.86%。從門和屬分類水平上可以明顯看出同一地區(qū)栽培牧草土壤微生物群落組成基本一致，但4種豆科植物的土壤微生物群落組成豐度存在差異。

真菌對季節(jié)變化、土壤理化性質(zhì)、植被類型等的響應(yīng)各有不同，而土壤環(huán)境因子是影響土壤真菌多樣性的主要因素。Wang等[35]比較了南極洲菲爾德斯Fildes地區(qū)4種不同種類土壤的微生物多樣性和菌群組成，發(fā)現(xiàn)影響土壤微生物菌群結(jié)構(gòu)最顯著的因素為pH值、磷酸鹽、有機碳、有機氮含量。Hazard等[36]研究顯示，土壤有機質(zhì)含量會對土壤真菌群落結(jié)構(gòu)存在重大影響。Jansa等[37]研究表明施磷對提高土壤真菌的多樣性具有一定的作用。李海云等[38]研究發(fā)現(xiàn)土壤速效鉀、全氮、速效氮、有機質(zhì)和有機碳是祁連山不同退化高寒草地土壤真菌群落分布的主要驅(qū)動因子。植物根系的健康狀態(tài)是植物、土壤物理環(huán)境和化學環(huán)境以及土壤中微生物(病原體本身以及其他微生物)之間復(fù)雜的相互作用的結(jié)果[39]。通過分析真菌多樣性與土壤環(huán)境因子的關(guān)系，可以間接反映土壤是否健康，本研究相關(guān)性分析表明，4種豆科植物根際土壤真菌群落多樣性與土壤全磷、速效磷、全氮、全鉀、速效氮、速效鉀、有機質(zhì)的含量及土壤pH值間存在一定的相關(guān)性，其中重要驅(qū)動因素是土壤全氮、全磷、速效磷和有機質(zhì)，這說明真菌對環(huán)境的適應(yīng)能力不同，對環(huán)境因子的改變比較敏感，從而導(dǎo)致真菌群落結(jié)構(gòu)發(fā)生變化。各種環(huán)境因子與土壤微生物的相互作用機制是復(fù)雜的，因此，探究植物根際土壤微生物和土壤理化性質(zhì)之間的關(guān)系對高寒地區(qū)的植物資源利用和經(jīng)濟發(fā)展有重要的意義。

4 結(jié)論

4種豆科植物根際土壤理化性質(zhì)間具有顯著差異，且與扁蓿豆樣地相比，蠶豆、紅豆草、紫花苜蓿3樣地土壤理化性質(zhì)更為相似。通過Illumina HiSeq高通量測序技術(shù)，共得到267 532條有效序列，聚類共得到966個OTUs；4種豆科植物根際土壤真菌群落豐富度指數(shù)(Chao1指數(shù))依次為TDC>TDZ>TDH>TDB，真菌群落多樣性指數(shù)(Shannon-Wiener)指數(shù)依次為TDC>TDB>TDH>TDZ；Beta多樣性分析表明，蠶豆與紫花苜蓿根際土壤真菌多樣性相似度較高，與扁蓿豆差異性較大。通過相關(guān)性分析，土壤全氮、全磷、全鉀、速效磷和有機質(zhì)是土壤真菌群落分布的主要影響因子。