耐重金屬腸桿菌GL-2 鑒定及對(duì)小麥促生作用的研究

蔡高磊，周 煬，趙昌松，彭宣和，張 振，趙建寧

（1.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全環(huán)境因子控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300191；2.丹江口庫(kù)區(qū)十堰生態(tài)農(nóng)業(yè)研究院，湖北 十堰 442000；3.農(nóng)業(yè)農(nóng)村部環(huán)境保護(hù)科研監(jiān)測(cè)所，天津 300191）

近年來(lái)，土壤重金屬污染對(duì)生態(tài)系統(tǒng)和人類健康都構(gòu)成嚴(yán)重威脅，日益成為嚴(yán)重的全球性環(huán)境問(wèn)題。工業(yè)生產(chǎn)、采礦活動(dòng)、農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中肥料和農(nóng)藥的使用、廢水灌溉和廢棄物的不當(dāng)處理等人類活動(dòng)都與土壤中的重金屬污染有關(guān)［1-4］。重金屬是土壤中的常見污染物，也是植物和動(dòng)物代謝過(guò)程中的非必需元素，特別是土壤污染中的鎘（Cd）被認(rèn)為是重金屬中最具毒性的污染物之一，因此它具有高遷移率和低允許暴露限值［5，6］。傳統(tǒng)的重金屬處理方法如土壤沖刷、穩(wěn)定劑、酸淋洗、離子交換或電化學(xué)處理對(duì)土壤修復(fù)來(lái)說(shuō)既昂貴效率又低，并且往往對(duì)土壤生態(tài)系統(tǒng)造成負(fù)面影響［7，8］。除了重金屬毒性外，植物的生長(zhǎng)還可能受到干旱、鹽堿化和養(yǎng)分缺乏等不良環(huán)境脅迫，克服環(huán)境壓力并促進(jìn)植物生長(zhǎng)對(duì)植物發(fā)揮自身性能必不可少。植物根系周圍存在大量植物根際促生菌（Plant growth-promoting rhizobacteria，PGPR），它們是一群可以產(chǎn)生與植物生長(zhǎng)相關(guān)物質(zhì)，例如嗜鐵素、吲哚3-乙酸（IAA）和1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸合成酶（1-aminocyclopropane-1-carboxylate，ACC）等來(lái)提高植物對(duì)重金屬毒性的耐受性和促進(jìn)植物生物量的有益根際細(xì)菌［9-11］。研究報(bào)道，與植物相關(guān)的PGPR 通過(guò)降低土壤中的重金屬生物利用度來(lái)幫助植物生長(zhǎng)和提高植物對(duì)重金屬的耐受性，并減少重金屬的吸收或轉(zhuǎn)移到植物的上半部分［12-15］。Madhaiyan 等［16］報(bào)道，接種內(nèi)生細(xì)菌Magnaporthe oryzae和Burkholderiaspp.可以增加植株生長(zhǎng)，減少番茄根和芽中Ni 和Cd的積累，同樣也減少了土壤中Ni 和Cd的有效性，是PGPR 菌株對(duì)重金屬的吸附和生物積累的結(jié)果。此外，細(xì)菌還可以直接與重金屬等污染物相互作用，以降低其毒性或調(diào)節(jié)其生物利用率［17］。因此，PGPR的應(yīng)用是減少土壤中重金屬積累和植物生長(zhǎng)效率的有效途徑。

本研究通過(guò)從土壤中分離一種PGPR 菌株，離體條件下篩選出具有耐重金屬和嗜鐵素活性，測(cè)定了該菌株對(duì)重金屬的最低抑制濃度，并研究了其對(duì)小麥幼苗生長(zhǎng)性狀的影響，為該菌株在土壤中保護(hù)作物生長(zhǎng)及應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)土壤取自湖北省十堰市一處小麥種植地，取樣時(shí)小心將小麥拔出并收集小麥根際的土壤置于無(wú)菌袋中，注明采樣時(shí)間和地點(diǎn)，置于冰箱4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

LB 培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，瓊脂15 g，定容至1 000 mL，pH 為7.0，121 ℃滅菌20 min。

嗜鐵素培養(yǎng)基［18］：CAS（鉻天青）60.5 g，10 mL 三價(jià)鐵溶液（1 mmol/L FeCl3·6H2O），HDTMA（十六烷基三甲基溴化胺）72.9 g，瓊脂18 g，定容至1 000 mL，121 ℃滅菌20 min。

PDA 培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂15 g，定容至1 000 mL，pH為7.0，121 ℃滅菌20 min。

Murashige 和Skoog（MS）培養(yǎng)基［19］。

小麥品種：鄂麥DH16，為本實(shí)驗(yàn)室保存品種。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 耐CdCl2的PGPR 菌株的篩選 為了獲得耐重金屬細(xì)菌，稱量10 g 根際土壤放入90 mL 無(wú)菌水中，搖床于28 ℃下180 r/min 振蕩30 min，用稀釋平板法連續(xù)將土壤混懸液稀釋成10-1～10-3g/mL，并加入含有20 mg/L CdCl2的LB 培養(yǎng)基中涂抹均勻，放置在恒溫培養(yǎng)箱中25 ℃下培養(yǎng)5 d。將生長(zhǎng)出來(lái)的菌落接入LB 液體培養(yǎng)基中，25 ℃振蕩培養(yǎng)48 h，用離心機(jī)5 000 r/min 離心10 min，收集菌體，再用無(wú)菌水稀釋菌液濃度至1×107cfu/mL 接入嗜鐵素培養(yǎng)基中，28 ℃下恒溫培養(yǎng)5 d。觀察菌落周圍是否產(chǎn)生黃色暈圈，有黃色暈圈的是產(chǎn)生嗜鐵素的PGPR 菌株。根據(jù)下列公式計(jì)算嗜鐵素PGPR 菌株活性。

菌株活性=［（暈圈直徑-菌落直徑）/暈圈直徑］×100%

1.2.2 重金屬最低抑制濃度測(cè)定 為了檢測(cè)分離菌株對(duì)重金屬的抗性水平，選取生長(zhǎng)最快、抗重金屬最強(qiáng)、嗜鐵素活性最高的PGPR 菌株，測(cè)定了PGPR 菌株對(duì)硫酸銅、硫酸鋅、硝酸鉛和氯化鎘的最低抑制濃度（Minimal inhibitory concentration，MIC）。采用平板稀釋法在LB 培養(yǎng)基上添加Cu、Zn、Pb 和Cd 不同濃度的重金屬，以菌株不能生長(zhǎng)的最低重金屬濃度為試驗(yàn)統(tǒng)計(jì)的生長(zhǎng)臨界值，每個(gè)處理3 次重復(fù)。

1.2.3 PGPR 菌株的分子鑒定和生理生化特征 對(duì)篩選出的PGPR 菌株送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公 司進(jìn)行16S rDNA 和gyrB 分 子鑒定，16S rDNA 引物 為5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，5′-GGTTA CCTTGTTACGACTT-3′。16S rDNA PCR 擴(kuò)增條件為：94 ℃3 min；94 ℃45 s，55 ℃30 s，72 ℃2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃停止。gyrB 引物為5′-GAAGTCATCATGACCGTTCTGCAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3′，5′-AGCAGGGTACGGATGTGCGAGCCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3′，gyrB PCR擴(kuò)增條件為：96 ℃5 min，96 ℃1 min，62 ℃1 min，72 ℃ 2 min，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸7 min，4 ℃停止。利用BLASTN 將獲得的序列與GenBank 數(shù)據(jù)庫(kù)中的16S rDNA 和gyrB 核苷酸序列進(jìn)行比較。使用MEGA5.0 軟件進(jìn)行多序列比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 PGPR 對(duì)重金屬處理下植物生長(zhǎng)的影響 挑取PGPR 菌株單菌落放入LB 液體培養(yǎng)基中，28 ℃振蕩培養(yǎng)72 h，用離心機(jī)5 000 r/min 離心10 min，收集菌體，再用無(wú)菌水稀釋菌液濃度至1×108cfu/mL 備用。將鄂麥DH16 種子用75%乙醇消毒8 min，再用無(wú)菌水清洗3 遍，然后用無(wú)菌濾紙吸干種子表面水分，分別放入MS、MS+PGPR、MS+PGPR+Pb、MS+Pb、MS+PGPR+Cd 和MS+Cd 培養(yǎng)基內(nèi)，Pb 和Cd的終濃度均為50 mg/L，用0.22 μm 過(guò)濾器過(guò)濾滅菌后加入MS 培養(yǎng)基中混勻，每瓶5 粒種子，每個(gè)處理3 次重復(fù)，5 d 后調(diào)查各處理下小麥生長(zhǎng)情況。

1.2.5 PGPR 對(duì)植物的促生長(zhǎng)作用 選取健康的小麥種子，先用1.2% NaOCl 溶液消毒5 min，然后用75%乙醇消毒5 min，再用無(wú)菌水清洗3 次，最后將小麥種子放入無(wú)菌濾紙的培養(yǎng)皿中，加入適量無(wú)菌水，25 ℃恒溫培養(yǎng)5 d 進(jìn)行催芽，選取發(fā)芽一致的幼苗備用。每個(gè)花盆（直徑15 cm）裝有1.5 kg 土壤。試驗(yàn)設(shè)計(jì)，處理1：未添加PGPR 菌株的對(duì)照土；處理2：PGPR 活菌（1×108cfu/mL）接種土壤；處理3：PGPR活菌（1×105cfu/mL）接種土壤。每盆播種3 株幼苗，每個(gè)處理重復(fù)3 次，于分蘗期調(diào)查各處理下小麥的生長(zhǎng)狀況。

2 結(jié)果與分析

2.1 PGPR 菌株耐重金屬和嗜鐵素活性

5 株P(guān)GPR 在培養(yǎng)基上出現(xiàn)時(shí)間和嗜鐵素活性不同（表1），GL-1 到GL-5 出現(xiàn)時(shí)間分別為25、20、29、49、46 h，說(shuō)明在LB 培養(yǎng)基上加了重金屬對(duì)PGPR 菌株生長(zhǎng)有一定的抑制作用，5 株P(guān)GPR 嗜鐵素活性從31.55%到65.88%，其中GL-2 活性最高，為65.88%。因此，GL-2是篩選的最合適PGPR菌株。

表1 耐CdCl2的PGPR 菌株的生長(zhǎng)時(shí)間和嗜鐵素活性

2.2 GL-2菌株對(duì)4種重金屬的最低抑制濃度（MIC）

平板試驗(yàn)中（圖1），重金屬硫酸銅、硫酸鋅、硝酸鉛和氯化鎘對(duì)GL-2 菌株表現(xiàn)出不同程度的抑制作用，GL-2 對(duì)添加Cu、Zn、Pb 和Cd的LB 培養(yǎng)基上的最低抑制濃度（MIC）分別為200、150、650 和200 mg/L，說(shuō)明GL-2 菌株對(duì)重金屬離子具有很強(qiáng)的耐受性，特別是對(duì)Pb的MIC 達(dá)650 mg/L。

圖1 GL-2 對(duì)重金屬的最低抑制濃度

2.3 GL-2 鑒定結(jié)果

利用16S rDNA 和gyrB 基因片段進(jìn)行測(cè)序，分別得到長(zhǎng)為1 426 bp 和742 bp的核苷酸序列。系統(tǒng)進(jìn)化樹表明（圖2 和圖3），GL-2 菌株和Enterobacterludwigii聚為一枝，與其他腸桿菌序列的相似性均低于Enterobacter ludwigii。此外，根據(jù)第九版Bergeys細(xì)菌鑒定手冊(cè)，GL-2 菌株的生理生化鑒定結(jié)果（表2）與Enterobacter ludwigii基本一致。因此，GL-2菌株為Enterobacter ludwigii，命名為Enterobacter ludwigiiGL-2。

圖2 GL-2 基于16S rDNA 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

圖3 GL-2 基于gyrB 序列構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

表2 GL-2 菌株的生理生化特征

2.4 GL-2 對(duì)重金屬處理下小麥生長(zhǎng)的影響

小麥生長(zhǎng)情況（圖4）表明，MS+PGPR 處理與MS+PGPR+Pb 處理的根長(zhǎng)差異不顯著；但與添加Cd處理相比，株高、根長(zhǎng)及鮮重差異均達(dá)顯著水平，說(shuō)明重金屬影響了小麥的生長(zhǎng)，加入Enterobacter ludwigiiGL-2 對(duì)小麥生長(zhǎng)具有一定的促進(jìn)作用，可以減輕重金屬對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響，特別是促進(jìn)了小麥根長(zhǎng)和增加了生物量。

圖4 小麥生長(zhǎng)情況

2.5 GL-2 對(duì)盆栽小麥生長(zhǎng)的作用

盆栽試驗(yàn)結(jié)果（表3）表明，3種不同處理下，小麥的株高、根長(zhǎng)和主根數(shù)沒(méi)有明顯差異。然而PGPR活菌（1×108cfu/mL 和1×105cfu/mL）接種小麥后，小麥根鮮重、分蘗數(shù)和根干重與對(duì)照相比具有顯著差異。處理2 小麥根鮮重、分蘗數(shù)和根干重分別比對(duì)照增加了102.80%、93.17%和216.67%。處理3小麥根鮮重、分蘗數(shù)和根干重分別比對(duì)照增加了27.97%、55.28%和53.33%。PGPR 活菌在1×108cfu/mL 濃度下對(duì)小麥生長(zhǎng)具有較強(qiáng)的促生效果。

表3 GL-2 對(duì)小麥的生長(zhǎng)作用

3 討論

腸桿菌在自然界中廣泛存在，PGPR 對(duì)土壤修復(fù)已被證明是促進(jìn)植物生長(zhǎng)和保護(hù)植物免受重金屬毒性的一種經(jīng)濟(jì)有效的方法［20，21］。此外，與植物相關(guān)的PGPR 細(xì)菌可能會(huì)使土壤中的重金屬產(chǎn)生生物球或沉淀，并通過(guò)與陰離子官能團(tuán)結(jié)合而降低重金屬對(duì)生物利用率的毒性，還可以利用細(xì)胞外聚合物（多糖、蛋白質(zhì)、腐殖質(zhì)等）或細(xì)菌產(chǎn)生的鐵載體、有機(jī)酸螯合金屬離子以及熒光假單胞菌Pseudomonas fluorescensACC9、P.fluorescensACC 23、Enterobactersp.NBRI K28 SD1 和Enterobacter ludwigiiNCR3的生理機(jī)制來(lái)促進(jìn)植物生長(zhǎng)和對(duì)重金屬的吸附［1，3，22］。

本研究中，GL-2 屬于Enterobacter ludwigii，具有生長(zhǎng)速度快、嗜鐵素活性強(qiáng)的特性，在重金屬M(fèi)IC 試驗(yàn)中，GL-2 對(duì)4 種不同重金屬具有一定的耐受性，尤其是在含有Pb的培養(yǎng)基中MIC 高達(dá)650 mg/L，在含有50 mg/L 重金屬Pb的MS 培養(yǎng)基中接種GL-2 菌株，小麥的根長(zhǎng)和鮮重的生物量與對(duì)照無(wú)顯著性差異，說(shuō)明GL-2 菌株改善了重金屬下小麥的生長(zhǎng)環(huán)境，提高了小麥的生物量，減少了重金屬對(duì)小麥生長(zhǎng)的影響。盆栽小麥生長(zhǎng)研究表明，Enterobacter ludwigiiGL-2 在1×108cfu/mL 濃度下，小麥根鮮重、分蘗數(shù)和根干重與對(duì)照相比具有顯著差異，分別比對(duì)照增加了102.80%、93.17%和216.67%，對(duì)小麥的生長(zhǎng)發(fā)育起到促生作用，這種明顯的促生作用還有可能與其篩自小麥根際土壤有關(guān)。

綜上，本試驗(yàn)對(duì)篩選、鑒定的PGPR 菌株、抗重金屬能力及其對(duì)小麥?zhǔn)┯眯Ч难芯拷Y(jié)果表明，PGPR 菌 株Enterobacter ludwigiiGL-2對(duì)減輕重金屬影響和小麥生長(zhǎng)具有積極的促進(jìn)作用，對(duì)于制作微生物菌肥具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。另外，植物生長(zhǎng)也受菌株、植物特性和土壤環(huán)境等因素影響，這些都需要進(jìn)一步的研究來(lái)證實(shí)。