枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥的分子機(jī)制

李秋江 房曉敏, 王胤斌, 胡學(xué)華 郭東更, 呂金捍, 蔡利軍,*

1.寧夏醫(yī)科大學(xué)第三臨床醫(yī)學(xué)院(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)，寧夏 銀川 750002 2.西北民族大學(xué)第一臨床醫(yī)學(xué)院(寧夏回族自治區(qū)人民醫(yī)院)，甘肅 蘭州 730000

枸杞子是寧夏枸杞的干燥成熟果實(shí)，最早出現(xiàn)于《神農(nóng)本草經(jīng)》里面，主要的功效是滋補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋健骨。多項(xiàng)研究[1-2]表明枸杞子具有抗氧化、抗癌、抗炎等藥理活性。動物試驗(yàn)[3]證實(shí)枸杞子中的多糖成分能夠增加骨質(zhì)疏松大鼠的骨密度，同時(shí)能夠通過促進(jìn)大鼠中一氧化氮合成酶(NOS)和轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)表達(dá)發(fā)揮調(diào)節(jié)骨代謝的作用。同時(shí)枸杞子也最早被我國“藥食兩用”的名單收錄，既是傳統(tǒng)中藥材同時(shí)也能用作于保健產(chǎn)品[4]。因此，探究枸杞子有效成分治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制具有重要意義和臨床價(jià)值。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)通過利用生物信息學(xué)分析，從藥物活性成分、潛在作用靶點(diǎn)及信號通路等分子水平方面研究藥物藥理學(xué)作用機(jī)制，一定程度上解決了中藥組方成分多樣、研究復(fù)雜的困難[5]。但是關(guān)于枸杞子治療骨質(zhì)疏松疾病的研究僅僅停留在分子水平，未對其有效成分及基因水平的機(jī)制進(jìn)行研究報(bào)道。因此，本研究基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探究枸杞子在治療骨質(zhì)疏松疾病的作用機(jī)制，為枸杞子在治療骨質(zhì)疏松疾病方面的進(jìn)一步研究提供一定的參考。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)庫及軟件資源

本研究所運(yùn)用的數(shù)據(jù)庫及軟件資源見表1。

1.2 方法

1.2.1枸杞子有效成分篩選和靶點(diǎn)預(yù)測：通過TCMSP分析平臺檢索枸杞子藥物的全部化學(xué)成分，利用成分的口服生物利用度(oral bioavailability，OB)和藥物相似度(drug likeness，DL)對枸杞子藥物有效成分進(jìn)行篩選(OB≥30%和DL≥0.18)。采用TCMSP分析平臺對枸杞子相關(guān)有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行預(yù)測。

1.2.2枸杞子有效成分作用靶點(diǎn)的基因名一致化：由于部分藥物潛在靶點(diǎn)不能在UniProt數(shù)據(jù)庫中查詢到，因此本研究需要對不能夠匹配到的基因進(jìn)行剔除，同時(shí)對能夠匹配的基因名進(jìn)行一致化。

1.2.3枸杞子有效成分與作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖：將篩選得到的枸杞子有效成分作用靶點(diǎn)進(jìn)行一致化、去重后獲得枸杞子潛在作用靶點(diǎn)，將靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytospace軟件中構(gòu)建藥物有效成分-靶點(diǎn)作用網(wǎng)絡(luò)圖。

1.2.4尋找骨質(zhì)疏松疾病靶點(diǎn)：分別利用OMIM、Drugbank和Genecards三種數(shù)據(jù)庫，以“osteoporosis(骨質(zhì)疏松)”作為關(guān)鍵詞檢索疾病靶點(diǎn)基因，剔除檢索結(jié)果中重復(fù)的靶點(diǎn)基因，取并集得到骨質(zhì)疏松疾病靶點(diǎn)基因。

1.2.5“枸杞子-骨質(zhì)疏松”藥物疾病交集靶點(diǎn)對應(yīng)的有效成分：通過venn(韋恩)圖確定“枸杞子-骨質(zhì)疏松”藥物疾病交集基因以及對應(yīng)的有效成分，通過SymMap數(shù)據(jù)庫查詢有效成分的CAS號。

1.2.6構(gòu)建交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)：將枸杞子-骨質(zhì)疏松交集作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，種屬選擇人，最低要求互作分值(minimum required interaction score)設(shè)置為0.4，隱藏?zé)o相關(guān)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，最終得到交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interacton，PPI)網(wǎng)絡(luò)。將枸杞子-骨質(zhì)疏松交集作用靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫中，種屬選擇人，最低要求互作分值(minimum required interaction score)設(shè)置為0.4，隱藏?zé)o相關(guān)聯(lián)系的節(jié)點(diǎn)，最終得到交集靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用(protein-protein interacton，PPI)網(wǎng)絡(luò)。

1.2.7“枸杞子-骨質(zhì)疏松”核心靶點(diǎn)基因篩選：將交集靶點(diǎn)的PPI作用網(wǎng)絡(luò)結(jié)果以文本形式導(dǎo)入Cytosapce軟件中，利用cytohubba插件基于MCC、MNC、Degree三種算法計(jì)算節(jié)點(diǎn)分值，分別選取前20位顯著性基因并取并集即可得到核心基因。

1.3 GO和KEGG分析

通過Metasacpe數(shù)據(jù)庫對枸杞子與骨質(zhì)疏松的核心靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體(gene ontology，GO)和京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG)通路富分析。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GO功能分析主要描述核心靶點(diǎn)的功能，KEGG通路富集分析可以得到核心靶點(diǎn)富集的信號通路。而后使用OmicShare云平臺和R語言軟件對上述的富集結(jié)果進(jìn)行可視化繪圖。

2 結(jié)果

2.1 枸杞子主要有效成分篩選結(jié)果

通過TCMSP分析平臺對枸杞子有效成分進(jìn)行篩選和靶點(diǎn)基因預(yù)測，同時(shí)運(yùn)用UniProt數(shù)據(jù)庫對靶點(diǎn)基因一致化，剔除重復(fù)靶點(diǎn)基因信息，共獲得枸杞子中主要有效成分36個(gè)(表2)，潛在靶點(diǎn)163個(gè)。運(yùn)用Cytospace軟件構(gòu)建枸杞子“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖(圖1)。

表2 枸杞子中主要有效成分的基本信息

圖1 枸杞子的成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)圖Fig.1 Composition-target network diagram of Lycii Fructus注：三角代表枸杞子有效成分；橢圓代表枸杞子作用靶點(diǎn)。

2.2 枸杞子靶點(diǎn)基因與骨質(zhì)疏松疾病基因交集

利用OMIM、Drugbank和Genecards三種數(shù)據(jù)庫取并集獲得骨質(zhì)疏松相關(guān)靶點(diǎn)基因4 137個(gè)，通過韋恩圖找到枸杞子與骨質(zhì)疏松的交集靶點(diǎn)基因117個(gè)(圖2)。交集靶點(diǎn)基因所對應(yīng)的枸杞子藥物主要成分見表3。

表3 共同靶點(diǎn)對應(yīng)枸杞子主要有效成分列表(Top 5)

圖2 枸杞子與骨質(zhì)疏松疾病靶點(diǎn)韋恩圖Fig.2 Venn diagram of Lycii Fructus and osteoporosis disease targets

2.3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖構(gòu)建及核心基因篩選

將枸杞子-骨質(zhì)疏松的117個(gè)交集靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING中，得到2 011對相互作用關(guān)系(圖3)，并將結(jié)果以文本形式導(dǎo)出，然后將導(dǎo)出的text文件導(dǎo)入Cytospace軟件中，利用cytohubba插件的MCC、MNC、Degree算法選取前20位關(guān)鍵基因，并取并集繪制venn圖得到16位核心靶點(diǎn)基因，依次為：白介素-6(IL-6)、JUN、腫瘤壞死因子(TNF)、血管內(nèi)皮生長因子A(VEGFA)、絲裂原活化蛋白激酶1(MAPK1)、AKT1、白細(xì)胞介素8(IL-8)、基質(zhì)金屬蛋白酶9(MMP9)、趨化因子配體2(CCL2)等。見圖4。

圖3 枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥共同靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)圖Fig.3 PPI network diagram of the common target of Lycii Fructus in the treatment of osteoporosis

圖4 枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥核心基因Fig.4 Core genes of Lycii Fructus in the treatment of osteoporosis注：A：基于cytohubba插件取MNC、MCC、Degree三種算法Top 20的交集基因；B：枸杞子抗骨質(zhì)疏松核心基因的互作PPI網(wǎng)絡(luò)圖。

2.4 GO功能富集分析

GO功能富集分析中分子功能結(jié)果提示，枸杞子抗骨質(zhì)疏松癥治療可能與影響核心啟動子結(jié)合、細(xì)胞因子受體結(jié)合等有關(guān)；細(xì)胞組成結(jié)果提示，治療可能與影響膜筏、囊泡腔、質(zhì)膜、等有關(guān)。生物進(jìn)程結(jié)果按照重要顯著程度依次為枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥可能與細(xì)胞對脂多糖的反應(yīng)、對氧化應(yīng)激的反應(yīng)、對生長因子的反應(yīng)等有關(guān)。結(jié)果見圖5A～圖5C。

圖5 枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥核心靶點(diǎn)基因GO功能及KEGG信號通路富集分析氣泡圖注：A：GO分子功能富集分析氣泡圖；B：GO細(xì)胞成分富集分析氣泡圖；C：GO生物進(jìn)程富集分析氣泡圖；D：KEGG信號通路富集分析氣泡圖(前20條)。圖形左側(cè)字母代表GO名稱，下面數(shù)字代表富集基因數(shù)目占總數(shù)目的比例，圓圈大小代表該信號通路所富集基因數(shù)目，顏色對應(yīng)著右側(cè)的顏色標(biāo)尺，代表-Log10(P)值，顏色越紅代表基因富集程度越高，對應(yīng)的P值越小。Fig.5 The GO function of the core target gene for treatment of osteoporosis and the enrichment analysis of the KEGG signal pathway in Lycii Fructus

2.5 KEGG信號通路富集分析

通過Metascape數(shù)據(jù)庫對核心靶點(diǎn)進(jìn)行KEGG信號通路富集分析，以P<0.05為顯著性差異，同時(shí)按重要顯著程度選取前20條信號通路(圖5 D)，綜合有關(guān)骨質(zhì)疏松信號通路的文獻(xiàn)，研究發(fā)現(xiàn)枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥可能與影響IL-17、TNF、糖尿病并發(fā)癥中的AGE-RAGE等信號通路密切相關(guān)。運(yùn)用R軟件對KEGG信號通路富集分析結(jié)果中富集基因數(shù)較多、差異較顯著的IL-17和TNF通路進(jìn)行靶標(biāo)-通路分析，結(jié)果見圖6。

圖6 信號通路機(jī)制圖Fig.6 Signal pathway mechanism diagram注：A：IL-17信號通路；B：TNF信號通路；圖中紅色標(biāo)記代表枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥的潛在作用靶點(diǎn)。

3 討論

枸杞子所含有的有效化學(xué)成分主要有槲皮素、黃豆黃素、β-谷固醇、豆甾醇、谷甾醇α1。槲皮素屬于黃酮類化合物，動物試驗(yàn)結(jié)果證實(shí)槲皮素能夠通過調(diào)節(jié)骨組織中的骨保護(hù)素(osteoprotegerin，OPG)和核因子κB受體激活因子配體(receptor activator for NF-κb ligand，RANKL)的表達(dá)來抑制破骨細(xì)胞的形成，從而減少骨吸收[6]。同時(shí)，眾多研究[7-9]發(fā)現(xiàn)，槲皮素還是柞絲子、烏葉花等多種中醫(yī)中藥的主要化學(xué)成分，能夠通過RANK/RANKL/OPG、NRF2等信號通路發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥的作用。體外試驗(yàn)[10]結(jié)果證實(shí)，黃豆黃素能夠有效增加去卵巢的骨質(zhì)疏松模型大鼠股骨骨密度。既往的研究也證實(shí)β-谷固醇、豆甾醇、谷甾醇α1均是抗骨質(zhì)疏松的有效化合物，說明枸杞子治療骨質(zhì)疏松疾病是多成分共同發(fā)揮作用。

由本研究“有效成分-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)圖和PPI結(jié)果表明，枸杞子中多種有效成分作用于不同的靶點(diǎn)基因。Jun屬于AP-1轉(zhuǎn)錄因子家族成員，參與并調(diào)節(jié)關(guān)鍵的細(xì)胞過程，同時(shí)也對骨骼的正常發(fā)育和維持很重要[11]。IL-6是重要的炎性因子，國外學(xué)者[12]對高加索人群236個(gè)家系譜人群調(diào)查研究發(fā)現(xiàn)，IL-6基因中某一序列的差異及位點(diǎn)的遺傳變異可能與骨質(zhì)疏松存在密切聯(lián)系。國外一項(xiàng)RCT試驗(yàn)[13]觀察抗TNF生物制劑服用一年后類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎患者的骨密度和骨強(qiáng)度顯著增加。而這些核心靶點(diǎn)主要與骨代謝或炎性反應(yīng)相關(guān)聯(lián)，因此也可以推測枸杞子各成分主要是通過調(diào)節(jié)上述核心靶點(diǎn)來治療骨質(zhì)疏松疾病。

研究表明，通過抑制MAPK信號通路能夠促進(jìn)LPS誘導(dǎo)的軟骨細(xì)胞損傷。同時(shí)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)能夠調(diào)節(jié)JUK、MAPK等信號通路作用于破骨細(xì)胞[14]。線粒體是活性氧產(chǎn)生的重要來源，當(dāng)機(jī)體雌激素缺乏會進(jìn)一步抑制線粒體β氧化，從而增加氧化應(yīng)激(reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生[15-16]。上述枸杞子治療骨質(zhì)疏松疾病的核心基因調(diào)控成骨細(xì)胞、破骨細(xì)胞涉及細(xì)胞增殖、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路等多種生物學(xué)功能，與GO富集結(jié)果一致。

KEGG信號通路富集結(jié)果顯示，枸杞子抗骨質(zhì)疏松核心靶點(diǎn)基因參與了多條成骨細(xì)胞或破骨相關(guān)的信號通路，其中IL-17、TNF等信號通路富集的核心基因較多，可能是枸杞子抗骨質(zhì)疏松疾病的關(guān)鍵信號通路。IL-17A能夠通過誘導(dǎo)膠原酶及其抑制物的表達(dá)與其他促炎細(xì)胞因子發(fā)揮協(xié)同作用[17]。TNF-α通過MAPK信號抑制成骨細(xì)胞分化，提示TNF-α抑制劑可能是炎癥性骨丟失的潛在治療靶點(diǎn)[18]。Kim等[19]發(fā)現(xiàn)干燥枸杞的水提取物(lycii radicis cortex，LRC)能夠通過減少破骨細(xì)胞生成標(biāo)志物(RANK、TRAP)的合成分泌來抑制RANKL誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化。同樣，Park等[20]發(fā)現(xiàn)枸杞水提取物干預(yù)能夠通過誘導(dǎo)OPG/RANKL比例增加抑制成骨細(xì)胞激活，發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松癥的作用。此外，動物試驗(yàn)研究[21]也證實(shí)，枸杞能夠通過調(diào)節(jié)OPG/RANKL通路、抑制炎性因子的產(chǎn)生來抑制小鼠顱骨骨溶解。RANKL與破骨細(xì)胞標(biāo)志物RANK的結(jié)合能夠雙向調(diào)控NF-κb信號通路作用于破骨細(xì)胞的分化[22-24]。由此可見，RANKL/RANK信號通路參與成骨細(xì)胞與破骨細(xì)胞的分化與NF-κb信號通路和TNF信號通路關(guān)系密切，也印證了枸杞子防治骨質(zhì)疏松疾病的信號通路相互作用、相互聯(lián)系。

綜上所述，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對枸杞子治療骨質(zhì)疏松癥的作用機(jī)制進(jìn)行了深入分析，并在分子層面提供新的研究方向和思路。但由于網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)庫有著一定的局限性，因此具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去驗(yàn)證。