齊墩果酸局部給藥對(duì)去卵巢小鼠骨折愈合的影響

程韶 楊駿杰 王晶 趙永見1,2, 唐德志1,2, 張巖1,2, 趙東峰1,2, 孫悅禮1,2, 趙世天1,2, 陶渝仁1,2, 施杞1,2, 舒冰1,2,* 王擁軍2,*

1. 上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院，上海 200032 2. 上海中醫(yī)藥大學(xué)，上海市中醫(yī)藥研究院脊柱病研究所，上海 200032 3. 教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(筋骨理論與治法)，上海 200032

骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)是以骨量低下和骨微結(jié)構(gòu)破壞為特征的全身性代謝性骨病[1]，骨質(zhì)疏松性骨折(osteoporotic fractures，OPF)是OP患者最為嚴(yán)重的并發(fā)癥[2]，由于患者具有骨質(zhì)疏松的病理基礎(chǔ)，導(dǎo)致骨折后愈合時(shí)間延長、愈合質(zhì)量變差、骨形成能力降低[3-4]。預(yù)計(jì)2050年全球骨質(zhì)疏松性髖部骨折將有一半發(fā)生在亞洲，而中國將有599萬例OPF發(fā)生，醫(yī)療衛(wèi)生支出將超過25.4億美金，給我國醫(yī)療衛(wèi)生事業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)[5]。OPF患者多為中老年人，常合并其他器官或系統(tǒng)疾病，全身狀況差，易發(fā)生并發(fā)癥，導(dǎo)致更高的致殘率和死亡率[1]。因此，尋求能夠促進(jìn)骨質(zhì)疏松性骨折愈合、縮短療程、減少并發(fā)癥的有效藥物具有重要的臨床意義。

根據(jù)中醫(yī)“腎主骨”理論，補(bǔ)腎中藥是中醫(yī)臨床治療OPF的常用藥物，取得了良好的臨床療效[6-7]。齊墩果酸(oleanic acid，OA)是補(bǔ)腎中藥女貞子、墨旱蓮等的主要有效組分之一[8-9]，前期研究[10]發(fā)現(xiàn)OA可以呈劑量依賴性的抑制Notch信號(hào)通路活性，促進(jìn)間充質(zhì)干細(xì)胞的早期成骨分化，異位成骨實(shí)驗(yàn)也證明了OA可顯著增加異位骨內(nèi)骨基質(zhì)的比例，促進(jìn)成骨。為了進(jìn)一步驗(yàn)證OA是否具有促進(jìn)OPF愈合的潛在能力，也為了進(jìn)行給藥方式的優(yōu)化，避免長期口服服藥的多種局限性，使OA在骨折局部能夠集中持續(xù)地釋放，本研究采用微型滲透泵局部緩釋OA的方式，對(duì)去卵巢骨折小鼠進(jìn)行干預(yù)，從而觀察OA局部緩釋對(duì)OPF愈合的作用，以期為中藥治療OPF提供新的應(yīng)用途徑。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)材料與儀器：Alzet植入式滲透泵(#1002、#1004，美國Alzet公司，可持續(xù)釋放藥物時(shí)間分別為14 d和28 d)；齊墩果酸(#O5504，美國Sigma公司)；雌二醇ELISA檢測(cè)試劑盒(#ab108667，abcam上海公司)；RNA提取試劑盒(#74104，德國QIAGEN公司)；反轉(zhuǎn)錄試劑盒(#RR0371A，日本Takara公司)、QPCR試劑盒(#RR820A，日本Takara公司)；阿爾辛藍(lán)染液(#A5268-25 G，Sigma上海公司);橙黃G(#O3756-25 G，Sigma上海公司);Micro-CT掃描分析系統(tǒng)(μCT80，瑞士Scanco Medical公司)；TreadScan被動(dòng)步態(tài)分析儀(GaitScan，美國CleverSys Inc公司)。

1.1.2實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：采用3月齡雌性C57BL/6小鼠，45只，每只體重20 g左右，由上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司提供，飼養(yǎng)于上海中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(倫理編號(hào)：PZSHUTCM18121414)。采用隨機(jī)數(shù)字表法，將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和OA組，每組各15只。

1.2 方法

1.2.1模型制備：模型組和OA組小鼠行雙側(cè)卵巢切除術(shù)(OVX)，假手術(shù)組僅切除卵巢周圍脂肪組織。術(shù)后3個(gè)月建立左側(cè)脛骨中段骨折模型，小鼠以4 %濃度的異氟烷誘導(dǎo)吸入麻醉，待小鼠進(jìn)入深度麻醉后，將異氟烷濃度改為2 %維持麻醉。將小鼠側(cè)臥位置于操作臺(tái)，左后肢備皮，并沿小鼠左側(cè)脛骨外側(cè)前緣作一約1 cm的縱行切口，分離脛骨周圍筋膜、肌肉，暴露脛骨中段。將1 mL一次性注射器針頭從脛骨平臺(tái)前外側(cè)沿脛骨長軸刺入脛骨約1.5 cm，把注射器針頭稍退回后剪斷針頭，用迷你電鋸鋸斷脛骨中段，將注射器針頭完全插入脛骨內(nèi)進(jìn)行髓內(nèi)固定，并沿脛骨插入輸藥管釋出端，使輸藥管出口抵達(dá)骨折斷端部位。另在小鼠左側(cè)肋骨下緣切開表皮，制備長約0.6 cm左右的橫行切口，用血管鉗由切口處皮下沿肋骨向脊柱方向鈍性分離皮下筋膜，撐出1.5 cm×0.8 cm左右膠囊大小的空間。OA組將含有OA工作液的植入式滲透泵植入制備的皮下空間，裁剪輸藥管輸入端并與釋藥棒連接，縫合切口，隔日觀察小鼠飲食和活動(dòng)情況。通過檢測(cè)骨折后小鼠腰椎骨密度和血清雌二醇水平判斷OVX造模是否成功[11]。

1.2.2藥物干預(yù)：根據(jù)前期研究[10]，20 μmmol/L的OA溶液具有較好的促進(jìn)骨形成作用，且無細(xì)胞毒性，因此取OA粉末9.13 μg溶于1 mL的0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液中，配置成濃度為20 μmmol/L的OA工作液，在OA組小鼠的每個(gè)滲透泵中注入100 μLOA工作液。假手術(shù)組、模型組小鼠的滲透泵內(nèi)僅注入100 μL的0.5 %羧甲基纖維素鈉溶液。

1.2.3取材、樣本處理：以術(shù)后14、28 d作為實(shí)驗(yàn)終點(diǎn)，采用二氧化碳吸入麻醉聯(lián)合頸椎脫臼法處死小鼠。常規(guī)眼球取血，分離并收集血清。剪開左側(cè)脛前皮膚，分離肌肉和筋膜，剪斷肌腱分離脛骨，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要將左側(cè)脛骨組織、肝臟組織、腎臟組織置入50 mL離心管，10 %中性緩沖甲醛固定液中固定24 h后流水沖洗，之后放于75 %酒精中保存，以備Micro-CT掃描?；?qū)⑷〔牡淖髠?cè)脛骨組織置入1.5 mL EP管液氮中凍存，于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4觀察指標(biāo)

1.2.4.1血清雌二醇檢測(cè)：設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔和待測(cè)樣品孔，分別加入標(biāo)準(zhǔn)品和待測(cè)血清25 μL后再加入200 μL Estradiol-HRP，37 ℃孵育2 h。孵育完成后，吸凈孔內(nèi)液體，并用300 μL洗滌液，洗滌三次，每孔加入100 μL TMB底物液，室溫中避光孵育30 min，每孔加入100 μL終止液，混勻后，用酶標(biāo)儀檢測(cè)450 nm的吸光度測(cè)得數(shù)值。

1.2.4.2小鼠步態(tài)功能分析：將小鼠放入被動(dòng)步態(tài)分析儀管道，打開跑道開關(guān)以10 cm/s的速度運(yùn)行跑步機(jī)，當(dāng)小鼠在跑道內(nèi)穩(wěn)定跑步時(shí)，按記錄鍵開始記錄，使小鼠被動(dòng)跑步20 s，采集整個(gè)時(shí)期后自動(dòng)停止。使用步態(tài)掃描儀軟件“TreadScanTM2.0”分析小鼠左后肢(骨折側(cè))與右后肢(健側(cè))的平均步態(tài)長度和平均邁步時(shí)間。

1.2.4.3小鼠脛骨組織、腰椎的Micro-CT掃描進(jìn)行骨密度測(cè)定：取出在75 %酒精中保存的脛骨組織標(biāo)本放入Micro-CT(μCT80，瑞士Scanco Medical公司)儀檢測(cè)艙，以55 kV電壓、72 μA電流、300 ms/幀速率、10 μm橫斷面厚度斷層成像掃描左側(cè)脛骨(脛骨平臺(tái)至踝關(guān)節(jié)之間的部位)和整個(gè)第五腰椎標(biāo)本，對(duì)所得圖像進(jìn)行三維重建，采用Micro-CT評(píng)估程序V6.6分析3 D腰椎的骨密度( bone mineral density, BMD)參數(shù)。

1.2.4.4小鼠脛骨組織形態(tài)學(xué)觀察：脛骨組織完成Micro-CT檢測(cè)后，放入14 %EDTA溶液中，在搖床上脫鈣21 d，每3天更換EDTA脫鈣液。標(biāo)本完成脫鈣后經(jīng)常規(guī)脫水、石蠟包埋、切片進(jìn)行Alcian Blue/Orange G染色，觀察骨痂組織病理學(xué)改變。

1.2.4.5骨痂組織成骨相關(guān)基因及Notch信號(hào)通路靶基因的表達(dá)：取出-80 ℃冰箱中的脛骨組織，截取脛骨骨痂組織，研磨后加入Trizol裂解，加入氯仿分層后，加入異丙醇吹打混勻，離心后取沉淀，用75 %酒精洗滌，自然晾干沉淀后以DEPC水溶解沉淀，測(cè)定RNA溶液濃度。將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)靶基因的表達(dá)水平。各基因特異性引物序列見表1。

表1 PCR引物序列Table 1 Sequence of PCR primer

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用SPASS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。對(duì)滿足正態(tài)性、方差性檢驗(yàn)的多組間數(shù)據(jù)比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)；兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 小鼠骨折后腰椎BMD與血清雌二醇的比較

與假手術(shù)組相比，術(shù)后14 d模型組和OA組的腰椎BMD降低(P<0.05)，與假手術(shù)組相比，術(shù)后28 d模型組血清雌二醇含量下降(P<0.05)，與模型組相比，OA組血清雌二醇含量升高(P<0.05)，表明OVX導(dǎo)致的小鼠骨質(zhì)疏松模型成立，OA組局部給藥能夠提高OVX后小鼠血清雌二醇含量(表2、圖1)。

表2 各組小鼠骨折后腰椎BMD、血清雌二醇的比較

圖1 各組小鼠骨折后腰椎BMD、血清雌二醇的比較Fig.1 Lumbar BMD and serum estradiol were compared in each group after fracture注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.2 各組小鼠左側(cè)脛骨組織三維重建情況

骨折后14 d，左側(cè)脛骨三維重建結(jié)果如圖2所示，假手術(shù)組骨折線模糊，骨折端有大量骨痂形成，模型組仍有部分骨折線，OA組骨折線模糊；28 d時(shí)，假手術(shù)組骨折已基本愈合，骨痂較少，模型組骨折部位仍有較大的骨痂，OA組骨折部位骨痂較少。

圖2 各組小鼠骨折后左側(cè)脛骨三維重建Fig.2 3D reconstruction of the left tibia of mice in each group after fracture

2.3 各組小鼠骨折后脛骨Alcian blue/Orange G染色結(jié)果

各組小鼠骨折術(shù)后14、28 d脛骨組織Alcian blue/Orange G染色結(jié)果如圖3所示。假手術(shù)組骨折端可見大量骨痂和新生軟骨細(xì)胞形成，模型組14 d有少量骨痂且骨痂稀疏，骨痂組織中多見脂肪細(xì)胞。OA組可見含有軟骨組織的骨痂，且已有大量骨小梁形成。28 d時(shí)，假手術(shù)組骨折已基本愈合，與假手術(shù)組相比模型組仍有較大骨痂，骨折尚未愈合，OA組骨痂體積較小，骨折已接近完成骨痂塑形過程。

圖3 各組小鼠骨折后Alcian blue/Orange G染色結(jié)果(×100)Fig.3 Alcian blue/Orange G staining of tibia in each group mice after fracture(×100)

2.4 各組小鼠骨痂組織中Notch信號(hào)通路靶基因Hes1和成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況

由于前期研究中，OA具有抑制Notch信號(hào)通路，促進(jìn)骨形成的作用，因此本研究進(jìn)一步檢測(cè)了各組小鼠骨痂組織中Notch信號(hào)通路下游靶基因和成骨相關(guān)基因的表達(dá)水平。

如圖4所示，術(shù)后14 d時(shí)，與假手術(shù)組相比，模型組小鼠骨痂組織中Notch信號(hào)通路靶基因Hes1 mRNA表達(dá)水平升高(P<0.05)；OA組Hes1 mRNA表達(dá)水平低于模型組(P<0.05)。28 d時(shí)各組小鼠骨痂組織中Hes1 mRNA表達(dá)水平比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 各組小鼠骨痂組織中Notch信號(hào)通路靶基因Hes1表達(dá)情況Fig.4 Notch signaling pathway target gene Hes1 in bone callus tissue of mice in each group注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

如圖5所示，骨折術(shù)后14 d，與假手術(shù)組相比，模型組骨痂組織中成骨相關(guān)基因Runx 2、OCN、ALP的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。OA組骨痂組織中Runx 2、OCN的mRNA表達(dá)水平均高于模型組(P<0.05)。相較于模型組，OA組骨痂組織中ALP的mRNA表達(dá)水平有升高趨勢(shì)，比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。骨折后28 d，與假手術(shù)組相比，模型組骨痂組織中Runx 2、ALP和OCN的mRNA表達(dá)水平降低(P<0.05)。OA組骨痂組織OCN的mRNA表達(dá)水平高于模型組(P<0.05)，但Runx 2、ALP mRNA表達(dá)水平與模型組比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖5 各組小鼠骨痂組織中成骨相關(guān)基因的表達(dá)情況Fig.5 Expression of osteogenic related genes in callus tissue of mice in each group注：與假手術(shù)組相比，*P<0.05；與模型組相比，#P<0.05。

2.5 各組小鼠骨折后步態(tài)分析

根據(jù)上述結(jié)果，OA局部緩釋對(duì)骨折后14 d時(shí)Notch信號(hào)通路及成骨相關(guān)基因的作用較為顯著，對(duì)骨折后14 d時(shí)骨痂的愈合過程具有較顯著的促進(jìn)作用。因此，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了14 d時(shí)模型組與OA組小鼠進(jìn)行了后肢步態(tài)分析。如圖6所示，骨折術(shù)后14 d時(shí)，模型組與OA組小鼠左后肢(骨折側(cè))與右后肢(健側(cè))平均步態(tài)長度比較差異均沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。模型組小鼠左后肢平均邁步時(shí)間顯著高于右后肢(P<0.05)，OA組小鼠左后肢平均邁步時(shí)間低于模型組小鼠(P<0.05)，且與右后肢比較差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。見表3。

圖6 各組小鼠骨折后步態(tài)分析Fig.6 Analysis of gait of mice in each group after fracture注：與模型組右后肢相比，*P<0.05；與模型組左后肢相比，#P<0.05。

表3 各組小鼠骨折后平均邁步時(shí)間

2.6 滲透泵藥物釋放時(shí)間及OA的肝腎毒性補(bǔ)充結(jié)果

如圖7所示，將吲哚青綠注入滲透泵，并將滲透泵移植至骨折小鼠，近紅外觀察吲哚青綠通過輸藥管向骨折局部滲透的時(shí)間。結(jié)果表明：滲透泵植入72 h后，泵中的液體可到達(dá)骨折局部。

圖7 近紅外觀察吲哚青綠在滲透泵中釋放的時(shí)間Fig.7 The release time of indolecyan green in pump was observed by NIR

假手術(shù)組和OA組小鼠骨折后28 d時(shí)肝臟和腎臟組織HE染色結(jié)果表明OA局部給藥無明顯肝腎毒性，見圖8。

圖8 各組小鼠骨折后肝臟、腎臟HE染色(×100)Fig.8 HE staining of liver and kidney of mice in each group after fracture(×100)

3 討論

齊墩果酸是中藥女貞子、墨旱蓮的主要有效組分之一，其在抗骨質(zhì)疏松、骨保護(hù)方面的作用已被證實(shí)[12]。課題組前期體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究表明[13]，OA能夠呈劑量依賴性抑制RANKL介導(dǎo)的破骨形成和功能，抑制OVX導(dǎo)致的小鼠骨丟失。此外，有研究[14-15]表明OA口服能夠促進(jìn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells, BMSCs)的成骨分化，提高OVX小鼠的骨密度，改善骨微結(jié)構(gòu)，減少骨丟失。然而目前，中藥治療OPF大多以口服給藥方式為主，其中胃腸道反應(yīng)是較常見的不良反應(yīng)，并且還存在長期使用依從性差的問題。其次，口服后藥物進(jìn)入全身大多數(shù)組織器官，不能集中作用于骨修復(fù)局部。因此，針對(duì)這一問題，本研究采用了Alzet公司的植入式滲透泵作為給藥載體，這是一種可植入實(shí)驗(yàn)動(dòng)物皮下或腹腔內(nèi)的滲透壓泵，通過導(dǎo)管以恒定的速度持續(xù)準(zhǔn)確地輸注測(cè)試藥劑，該設(shè)備在動(dòng)物細(xì)胞給藥、動(dòng)物模型建構(gòu)、藥物及分子篩選、藥理藥代藥效等眾多領(lǐng)域有著廣泛應(yīng)用[16-17]。通過吲哚青綠近紅外顯影方式，筆者觀察到滲透泵植入72 h后，滲透泵內(nèi)的液體可以到達(dá)骨折局部(圖7)。因此，本研究采用此給藥方式，探討局部緩釋OA對(duì)卵巢切除小鼠骨折愈合的作用。

總體來說，OA局部緩釋能夠促進(jìn)OPF愈合，且相較于28 d，OA干預(yù)14 d后的作用更顯著，這可能是因?yàn)樾∈蠊钦坌g(shù)后28 d骨痂已接近塑形晚期，此時(shí)破骨細(xì)胞的塑形作用更為顯著，且這也與前期體外研究的發(fā)現(xiàn)，即OA促進(jìn)早期骨形成的結(jié)論相吻合[10]。從預(yù)后功能角度，步態(tài)分析顯示，干預(yù)14 d后，OA組小鼠左后肢(骨折側(cè))的平均邁步時(shí)間顯著低于模型組，說明相同距離內(nèi)OA組小鼠骨折肢體的接觸地面的次數(shù)顯著增加，可以推斷局部給予OA干預(yù)14 d時(shí)，已經(jīng)可以改善骨折后肢體的功能活動(dòng)受限或疼痛感，從而改善去卵巢小鼠骨折肢體的功能恢復(fù)。此外，本研究進(jìn)一步檢測(cè)了OA局部緩釋干預(yù)28 d后，小鼠肝臟和腎臟組織的組織學(xué)變化，未見明顯異常(圖8)。

Notch信號(hào)通路是一種在物種進(jìn)化過程中高度保守的信號(hào)通路[18-19]，研究發(fā)現(xiàn)阻斷BMSCs中的Notch信號(hào)，會(huì)導(dǎo)致小鼠骨折延遲愈合或骨不連，但在成骨細(xì)胞或軟骨細(xì)胞中阻斷Notch信號(hào)，則不會(huì)出現(xiàn)骨不連，這提示Notch信號(hào)通路的激活對(duì)于骨折早期BMSCs具有重要作用，而對(duì)于骨折中晚期BMSCs成骨、成軟骨分化后沒有顯著作用[20]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在間充質(zhì)干細(xì)胞或者軟骨-骨前體細(xì)胞中激活Notch信號(hào)通路，可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，維持其干細(xì)胞特性，抑制細(xì)胞分化[21-22]；而在間充質(zhì)干細(xì)胞中抑制Notch信號(hào)通路，則可以促進(jìn)干細(xì)胞的分化，進(jìn)入成骨或成軟骨狀態(tài)[23-24]，由于BMSCs在骨折愈合中扮演者重要的角色，其介導(dǎo)的骨形成亦是骨折愈合過程中的重要病理環(huán)節(jié)[25-26]。因此，結(jié)合骨折愈合的病理過程規(guī)律和Notch信號(hào)通路的作用特點(diǎn)，在骨折早期階段，需激活BMSCs中的Notch信號(hào)通路，從而促進(jìn)BMSCs的增殖；而在骨折急性期后，需要抑制BMSCs中的Notch信號(hào)通路，從而促進(jìn)BMSCs的分化和骨形成。

Hes1是Notch信號(hào)通路的重要靶基因之一[27]。本研究顯示，與模型組相比，OA局部緩釋14 d后，可以顯著降低骨痂組織中Hes1 mRNA的表達(dá)，提高骨形成相關(guān)基因的表達(dá)水平。前期體外研究已經(jīng)證明，OA可以通過抑制Notch信號(hào)通路促進(jìn)BMSCs的成骨分化，本研究從體內(nèi)實(shí)驗(yàn)的角度驗(yàn)證了OA能夠抑制去卵巢小鼠骨折14 d時(shí)Notch信號(hào)通路下游靶基因Hes1的表達(dá)，促進(jìn)骨形成相關(guān)基因的表達(dá)。而在骨折28 d時(shí)，假手術(shù)與模型組骨痂組織中Hes1 mRNA的表達(dá)水平未見顯著差異，這再次驗(yàn)證了Notch信號(hào)通路的激活對(duì)于骨折早期BMSCs具有重要作用，對(duì)BMSCs成骨、成軟骨分化后作用并不顯著。而OA局部干預(yù)28 d時(shí)，其對(duì)Notch信號(hào)通路作用不顯著，同時(shí)對(duì)成骨相關(guān)基因表達(dá)水平的增強(qiáng)作用亦有所減弱。因此，OA局部緩釋可能通過抑制骨折愈合早中期局部BMSCs中的Notch信號(hào)通路，促進(jìn)BMSCs的成骨分化，加速去卵巢小鼠的骨折愈合。而當(dāng)BMSCs分化為成熟的成骨或成軟骨細(xì)胞，骨折愈合接近末期，由于Notch信號(hào)通路活性較低，OA對(duì)Notch信號(hào)通路也無顯著抑制作用。

綜上所述，OA局部緩釋能夠促進(jìn)去卵巢小鼠的骨折愈合，這可能與其抑制骨折愈合早中期BMSCs中Notch信號(hào)通路、上調(diào)成骨相關(guān)基因表達(dá)的作用有關(guān)，同時(shí)該研究也為中藥治療OPF提供了新的應(yīng)用途徑和理論依據(jù)。此外，OA還具有抗氧化、抗炎調(diào)節(jié)免疫等多種作用[9]，活性氧、炎癥等均是影響骨代謝的重要因素[28-29]，因此OA局部緩釋促進(jìn)小鼠骨質(zhì)疏松性骨折的愈合，是否與其抗氧化、調(diào)節(jié)免疫等作用有關(guān)，仍需今后進(jìn)一步研究探索。