探討Rab27蛋白家族在三陰性乳腺癌細胞耐藥機制中的作用

王 麗，嚴志銳，黃丹菊，夏耀雄

昆明醫(yī)科大學第三附屬醫(yī)院，云南省腫瘤醫(yī)院 放射治療科，云南昆明 650118

乳腺癌為女性癌癥死亡的第一大原因[1]。三陰性乳腺癌(triple negative breast cancer，TNBC)約占所有乳腺癌發(fā)病率的15%[2]。由于分子表達模式的原因，TNBC不能用激素或Her-2靶向治療，目前化療和免疫治療是唯一可用的全身治療策略。但并非所有患者都能從化療中獲益[3]。多藥耐藥(multi-drug resistance，MDR)的出現(xiàn)是化療失敗的主要原因。有研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌細胞可以通過外泌體將化療藥物阿霉素排出到細胞外培養(yǎng)基[4]。還有大量研究表明，膜轉(zhuǎn)運蛋白ABC超家族編碼的重要藥物轉(zhuǎn)運體P-gp蛋白可通過外泌體從腫瘤耐藥細胞轉(zhuǎn)移到敏感細胞，導致敏感細胞獲得性耐藥[5-6]。外泌體還能通過介導某些功能蛋白或miRNA的轉(zhuǎn)移對細胞耐藥進行間接調(diào)控[7]；轉(zhuǎn)移耐藥細胞的某些促細胞增殖、遷移和抗凋亡的信號分子至受體細胞[8-9]；轉(zhuǎn)移藥物代謝酶誘導藥物失活[10]。眾所周知，Rab家族控制了幾乎所有的膜轉(zhuǎn)運過程，包括囊泡出芽、外泌體釋放以及與受體膜的對接和融合[11]。其中，Rab27家族與外泌體的釋放密切相關，包括Rab27a和Rab27b這兩個不同的分子[12]。已有研究表明Rab27a和Rab27b能夠控制包括乳腺癌細胞在內(nèi)的多種不同類型腫瘤細胞的外泌體分泌[13-14]。但另外一項對乳腺癌細胞4T1和TS/A的研究表明，Rab27a才是外泌體分泌所必需的，而非Rab27b[15]。本研究通過靶向與外泌體分泌密切相關的Rab27家族，探究該家族在三陰性乳腺癌細胞MDR過程中的具體作用，期望為因MDR導致化療失敗的TNBC患者提供可能的分子治療方案。

材料與方法

1 主要試劑與儀器 三陰性乳腺癌細胞系MDAMB-231購自中國科學院昆明動物所細胞庫；DMEM高糖培養(yǎng)基、外泌體去除胎牛血清(fetal calf serum，F(xiàn)BS)購自美國Gibco公司；外泌體提取試劑盒購自美國Life公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑、Opti-MEM培養(yǎng)基以及本研究中用到的siRNA均購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白濃度測定試劑盒、細胞凋亡與壞死檢測試劑盒均購自碧云天生物技術有限公司；Trizol購自寶生物工程(大連)有限公司；熒光定量分析試劑盒購自ABI公司；RIPA裂解液購自北京索萊寶生物科技有限公司；Rab27A、Rab27B、CD9、MHCⅡ和GAPDH蛋白抗體均購自美國Abcam公司；順鉑、阿霉素和紫杉醇均購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司；熒光定量PCR儀(ABI)；全自動酶標儀(TECAN)；光學顯微鏡(奧林巴斯)；二氧化碳細胞培養(yǎng)箱(Thermo熱電)；NanoDrop 2000超微量分光光度計(Thermo熱電)；流 式細胞儀(BD)。

2 細胞培養(yǎng)及外泌體的提取 MDA-MB-231細胞使用含10% FBS、1%雙抗的DMEM高糖培養(yǎng)基置于37℃、5% CO2條件的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每2 d換液。收取對數(shù)生長期細胞生長狀態(tài)良好、匯合程度達到70% ～80%時的細胞上清液，采用外泌體提取試劑盒分離提取外泌體，隨后使用NanoDrop測定外泌體蛋白質(zhì)濃度后進行后續(xù)實驗。如果無法立即進行后續(xù)實驗，提取出的外泌體 重懸在PBS緩沖液中，保存于-80℃冰箱。

3 Rab27a和Rab27b siRNA轉(zhuǎn)染 按照Lipofectamine RNAi-MAX轉(zhuǎn)染試劑盒說明書，添加10 nmol/L siRNA轉(zhuǎn)染細胞，24 h后收集細胞檢測干擾效率。關于siRNA的詳細信息可通過ID號登陸https://www.thermofisher.cn/cn/zh/home.html搜索查詢，Rab27A siRNA ID號為HSS108985，Rab27B siRNA的ID號為HSS184177，陰性對照N C siRNA的ID號為D-001810-10。

4 Western blot檢測Rab27家族蛋白的表達以及外泌體分泌的定量 使用RIPA裂解液提取細胞和組織中的總蛋白，用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測所得總蛋白濃度后，取等量總蛋白進行SDSPAGE凝膠電泳分離不同大小蛋白，隨后將目的蛋白采用半干轉(zhuǎn)膜法轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，一抗標記目的蛋白，二抗與一抗結(jié)合顯色，洗凈后用化學發(fā)光成像儀檢測蛋白條帶，以條帶的深淺反映Rab27a和Rab27b蛋白表達量的變化。外泌體分泌的定量方法與上述方法基本一致，樣本使用提取出的外泌體，最后通過用圖像分析軟件Image J對外泌體標志蛋白CD9和MHC Ⅱ及內(nèi)參蛋白(GAPDH)條帶進行灰度值測試，以CD9和MHCⅡ /內(nèi)參灰度值比值表示外泌體的相對分泌量。

5 CCK-8檢測不同濃度藥物處理細胞增殖情況 待轉(zhuǎn)染后的各組細胞生長到對數(shù)期并且匯合程度達到70% ～80%時，消化重懸細胞并進行細胞計數(shù)后，每組設5復孔，共設18個不同藥物濃度處理組和1個不含藥物的完全培養(yǎng)基對照組，按104/孔的細胞密度重懸細胞鋪板于96孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h后按CCK-8試劑盒說明書加入CCK-8試劑孵育細胞，隨后直接使用酶標儀檢測OD450的數(shù)值表示各組細胞的增殖情況。18個不同藥物濃度處理組的設置：分別含0.03 μg/mL、0.3 μg/mL、3 μg/mL、7.5 μg/mL、15 μg/mL和30 μg/mL順鉑的完全培養(yǎng)基6組；分別含0.1 μg/mL、0.5 μg/mL、1 μg/mL、2.5 μg/mL、10 μg/mL和25 μg/mL阿霉素的完全培養(yǎng)基6組；以及分別含2.67 μg/L、5.34 μg/L、10.67 μg/L、21.35 μg/L、42.70 μg/L和8 5.39 μg/L紫杉醇的完全培養(yǎng)基6組。

6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 待轉(zhuǎn)染后的各組細胞生長到對數(shù)期并且匯合程度達到70% ～80%時，消化重懸細胞并進行細胞計數(shù)后，每組設3復孔，分別用含7.5 μg/mL順鉑、2.5 μg/mL阿霉素、10.67 μg/L紫杉醇的完全培養(yǎng)基，以及不含藥物的完全培養(yǎng)基，按105/孔的細胞密度重懸細胞鋪板于6孔板內(nèi)，每組設3復孔，培養(yǎng)24 h后按照細胞凋亡與壞死試劑盒說明書收集細胞染色孵育，隨后使用流式細胞儀檢測處理好的細胞，以處于特定象限內(nèi)的細胞比率表示各組細胞的凋亡 率。

7 qPCR檢測耐藥相關基因的表達 Trizol法提取細胞中的總RNA，參照ABI High capacity cDNA reverse transcription反轉(zhuǎn)錄試劑盒進行cDNA的合成。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，按照ABI公司的熒光定量分析試劑盒(SYBR Select Master Mix)進行實時熒光定量PCR反應。反應體系：SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(2×) 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板2 μL，RNase-free water 6 μL，總體積20 μL。反應結(jié)束后，以GAPDH為內(nèi)參使用2-ΔΔCt法分別計算IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6基因 mRNA 相對表達量。內(nèi)參基因G APDH和其他4個基因的引物序列見表1。

表1 實時熒光定量PCR所用引物Tab. 1 Real-time quantity of PCR primers

8 統(tǒng)計學方法 數(shù)據(jù)用統(tǒng)計軟件SPSS22.0進行分析。計量數(shù)據(jù)(均為正態(tài)或輕微偏態(tài))以± s表示，兩組間的差異采用獨立樣本t檢驗進行分析。結(jié)果用軟件Graphpad Prism 6作圖。P＜ 0.05為差異有統(tǒng)計意義。

結(jié) 果

1 抑制Rab27家族對MDA-MB-231細胞外泌體分泌的影響 熒光定量PCR和Western blot檢測siRNA干預細胞24 h后，結(jié)果顯示siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b序列在基因(圖1A)和蛋白(圖1B)表達水平上均能夠有效抑制Rab27a和Rab27b表達。隨后對外泌體含量進行分析，發(fā)現(xiàn)抑制Rab27a表達后，MDA-MB-231細胞的外泌體分泌量與對照組、siRNA-RAB27b組比較均降低(P＜ 0.05)；但抑制Rab27b表達后，MDA-MB-231細胞外泌體分泌量與對照組相比差異不大，CD9的相對表達量差異無統(tǒng)計學意義(P＞ 0.05)，MHC Ⅱ的相對表達量降低(P＜ 0.05)。提示siRNA-RAB27a有效抑制了MDA-MB-231細胞的外泌體分泌，而siRNA-RAB27b對MDA-MB-231細胞的外泌體分泌雖然有抑制作用，但作用較小。見圖2。

圖1 siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b轉(zhuǎn)染MDA-MB-231細胞后對Rab27a和Rab27b基因和蛋白表達的影響(aP ＜ 0.05，vs對照組)A：轉(zhuǎn)染siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b后對MDA-MB-231細胞Rab27a和Rab27b蛋白表達的影響(n=6)；B：轉(zhuǎn)染siRNA-RAB27a和siRNA-RAB27b后對MDA-MB-231細胞Rab27a和Rab27b基因mRNA表達的影響(n=9)Fig.1 Effects of siRNA-RAB27a and siRNA-RAB27b on the expression level of Rab27a and Rab27b genes and proteins after transfection of MDA-MB-231 cells (bP ＜ 0.05, vs control)A: Effects of transfection of siRNA-RAB27a and siRNARAB27b on the protein expression of Rab27a and Rab27b in MDA-MB-231 cells (n=6); B: Effects of transfection of siRNA-RAB27a and siRNA-RAB27b on the mRNA expression of Rab27a and Rab27b genes in MDA-MB-231 cells(n=9)

圖2 抑制Rab27a和Rab27b表達后對MDA-MB-231細胞外泌體分泌量的影響(aP ＜ 0.05，vs對照組；bP ＜ 0.05，vs si-RAB27a組。n=6)Fig.2 Effect of inhibiting Rab27a and Rab27b expression on exosome secretion of MDA-MB-231 cells (aP ＜ 0.05, vs EXOControl;bP ＜ 0.05, vs EXOsi-RAB27a. n=6)

2 抑制Rab27家族對MDA-MB-231細胞耐藥的影響 分別用不同濃度的順鉑、阿霉素和紫杉醇處理MDA-MB-231細胞并分別抑制Rab27a和Rab27b的MDA-MB-231細胞48 h后，用CCK-8法檢測細胞的生長情況，發(fā)現(xiàn)藥物濃度為0時，抑制Rab27a后MDA-MB-231細胞增殖能力會受到一定影響，而抑制Rab27b對細胞增殖能力無影響。隨著三組藥物濃度的升高，可以看出Rab27b被抑制后的MDA-MB-231細胞對藥物更加敏感，而抑制Rab27a后的MDA-MB-231細胞增殖情況受到藥物濃度升高的影響，但影響程度小于抑制Rab27b組。尤其在三組藥物的最高濃度組可以明顯看到，抑制Rab27b組的細胞受藥物干預后的增殖能力低于抑制Rab27a組，說明抑制Rab27家族使三陰性乳腺癌細胞對順鉑、阿霉素和紫杉醇的藥物耐受程度降低，并且抑制Rab27b對三陰性乳腺癌細胞藥物耐受程度的降低作用強于抑制Rab27a。見圖3。

圖3 抑制Rab27a和Rab27b表達后對MDA-MB-231細胞耐藥的影響(n=9)A：抑制Rab27a和Rab27b表達后對MDA-MB-231細胞在不同濃度順鉑處理下細胞增殖能力的影響；B：抑制Rab27a和Rab27b表達后對MDA-MB-231細胞在不同濃度阿霉素處理下細胞增殖能力的影響；C：抑制Rab27a和Rab27b表達后對MDA-MB-231細胞在不同濃度紫杉醇處理下細胞增殖能力的影響Fig.3 Effect of inhibition of Rab27a and Rab27b expression on drug resistance of MDA-MB-231cells (n=9)A: Effects of inhibiting the expression of Rab27A and Rab27B on the proliferation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of cisplatin; B: Effects of inhibiting the expression of Rab27A and Rab27B on the proliferation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of Dox; C: Effects of inhibiting the expression of Rab27A and Rab27B on the proliferation ability of MDA-MB-231 cells treated with different concentrations of PTX

3 抑制Rab27家族對不同藥物處理下MDA-MB-231細胞凋亡的影響 流式細胞術檢測顯示用順鉑處理的MDA-MB-231細胞抑制Rab27a和Rab27b后，與正常MDA-MB-231細胞相比，細胞凋亡率均顯著上升(P＜ 0.05)，抑制Rab27b組的細胞凋亡率顯著高于抑制Rab27a組(P＜ 0.05)。使用阿霉素處理細胞后的結(jié)果與順鉑類似，抑制Rab27a組和抑制Rab27b組的細胞凋亡率均顯著高于對照組(P＜ 0.05)，并且抑制Rab27b組的細胞凋亡率同樣顯著高于抑制Rab27a組(P＜ 0.05)。紫杉醇處理細胞后，雖然抑制Rab27a組和抑制Rab27b組的細胞凋亡率與順鉑和阿霉素類似，但抑制Rab27a組與抑制Rab27b組的細胞凋亡率無統(tǒng)計學差異(P＜0 .05)。見圖4。

4 抑制Rab27家族對MDA-MB-231細胞耐藥相關基因表達的影響 qPCR法檢測MDA-MB-231細胞在Rab27a和Rab27b被抑制后的耐藥相關基因IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6 mRNA表達量，發(fā)現(xiàn)si-NC組與對照組無統(tǒng)計學差異，但抑制Rab27家族后IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6 mRNA的表達量與對照組相比均顯著下降(P＜0.05)。抑制Rab27b組IL-6基因的表達顯著低于抑制Rab27a組(P＜ 0.05)，而EGR1基因的表達在兩組間無統(tǒng)計學差異，ABCC3和ABCC6基因在抑制Rab27b組的表達量顯著低于抑制R ab27a組(P＜ 0.05)。見圖5。

圖5 抑制RAB27家族表達對MDA-MB-231細胞耐藥相關基因表達的影響(aP ＜ 0.05，vs對照組；bP ＜ 0.05，vs si-RAB27a組。n=9)Fig.5 Effect of inhibiting the expression of RAB27 family on gene expression related to drug resistance in triple negative breast cancer cells(aP ＜ 0.05, vs control; bP ＜ 0.05, vs si-RAB27a. n=9)

討 論

TNBC 是預后最差的乳腺癌亞型， 目前手術、放療和化療相結(jié)合是治療TNBC 的唯一手段。順鉑(誘導DNA 雙鏈斷裂)、阿霉素(DNA 破壞劑) 和紫杉醇(微管穩(wěn)定藥物) 等抗癌藥物應用于包括TNBC 在內(nèi)的癌癥化療治療策略，然而治療的有效性受到耐藥的嚴重影響[16-18]。已有研究表明，耐藥的癌細胞能夠?qū)⒒熕幬锇谕饷隗w中，并將抗癌藥物從腫瘤細胞中穿梭出來[19]。外泌體還能夠?qū)⑴c腫瘤耐藥性相關的microRNA、mRNA和蛋白質(zhì)運送到癌細胞，由于外泌體在腫瘤微環(huán)境中被用作基因交換的載體，耐藥腫瘤細胞會劫持這一機制，使敏感細胞產(chǎn)生耐藥性[20]。在脊椎動物中，Rab27家族由Rab27a和Rab27b組成[21]。許多研究表明，Rab27a和Rab27b能夠控制包括子宮頸癌細胞、乳腺癌細胞和黑色素瘤細胞在內(nèi)的多種不同類型癌細胞的外泌體分泌[12]。盡管Rab27a和Rab27b具有很高的序列相似性(71%的氨基酸序列同一性)并募集相同的效應蛋白，但之前的研究發(fā)現(xiàn)這兩個Rab27亞型在不同類型的癌細胞中功能不同，即使在同一細胞類型中也發(fā)揮不同的作用[22]。

本研究采用siRNA分別干擾Rab27a和Rab27b在三陰性乳腺癌細胞株中的表達，發(fā)現(xiàn)抑制Rab27a表達后顯著降低了三陰性乳腺癌細胞的外泌體分泌，而抑制Rab27b表達后三陰性乳腺癌細胞外泌體的分泌量沒有受到太大的影響。進一步檢測Rab27a和Rab27b抑制后三陰性乳腺癌細胞對順鉑、阿霉素和紫杉醇的耐受情況，發(fā)現(xiàn)抑制Rab27家族后三陰性乳腺癌細胞對順鉑、阿霉素和紫杉醇的藥物耐受程度降低，抑制Rab27b的效果強于抑制Rab27a，并且在同濃度的順鉑和阿霉素處理條件下檢測細胞凋亡率也發(fā)現(xiàn)了相同的情況。通過對耐藥相關基因表達的檢測也發(fā)現(xiàn)，抑制Rab27b組的IL-6、EGR1、ABCC3和ABCC6四個基因表達量均顯著低于對照組(P＜ 0.05)，除EGR1外其他3個基因的表達量均顯著低于抑制Rab27a組(P＜ 0.05)。有研究證實癌細胞活躍的外泌體分泌能夠刺激IL-6基因表達量上調(diào)[23]。對紫杉醇耐藥乳腺癌細胞株外泌體的microRNA分析表明，其中含有的microRNA能夠調(diào)控EGR1基因的表達從而促進耐藥的發(fā)展[24]。對肝癌細胞的耐藥研究也發(fā)現(xiàn)Rab27b能夠與耐藥蛋白(ABC超家族編碼的P-gp蛋白)相互作用提高腫瘤細胞的耐藥性[25]。因此，我們推測Rab27a導致的三陰性乳腺癌細胞耐藥增強可能是通過促進外泌體的分泌而促成，如通過外泌體直接轉(zhuǎn)運出藥物，或通過外泌體在癌細胞中傳遞耐藥相關的某些功能蛋白、microRNA或mRNA。Rab27b導致的三陰性乳腺癌細胞耐藥增強機制可能與Rab27a不同，其可能不直接影響三陰性乳腺癌細胞外泌體的分泌，但可能對其他耐藥相關基因的表達起到重要的調(diào)控作用，具體的調(diào)控網(wǎng)絡還需要進一步的研究來闡明。

綜上所述，本研究使用siRNA抑制Rab27a和Rab27b后對三陰性乳腺癌細胞株中外泌體的分泌以及耐藥情況進行分析，發(fā)現(xiàn)抑制Rab27a和Rab27b均能夠降低三陰性乳腺癌細胞株耐藥的發(fā)展，進一步分析發(fā)現(xiàn)這兩個蛋白可能涉及不同的耐藥機制，未來深入研究Rab27b背后的耐藥調(diào)控網(wǎng)絡對因MDR導致化療失敗的TNBC患者或許有更大的臨床意義。

作者貢獻：王麗完成本研究大部分的實驗設計和實驗內(nèi)容；嚴志銳和黃丹菊協(xié)助完成部分實驗以及數(shù)據(jù)收集與統(tǒng)計分析；夏耀雄在項目思路、實驗設計以及文章撰寫方面提出了許多指導性的意見和建議。全體作者都閱讀并同意最終的文本。