丙戊酸鈉對重度燙傷大鼠肺微血管內(nèi)皮屏障的保護作用和機制研究

張文華，唐富波，胡 森，杜明華解放軍總醫(yī)院醫(yī)學創(chuàng)新部 創(chuàng)傷修復與組織再生研究中心，北京 0085；武警四川總隊醫(yī)院 燒傷科，四川樂山 64000；解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學中心 急診科，北京 0085

嚴重燒傷后，全身炎癥反應和微血管通透性增高引起血管內(nèi)液體向組織中滲漏，是組織水腫和低血容量性休克的主要原因。同時，血管內(nèi)皮屏障受損導致液體復蘇過程中大量血管內(nèi)液體進入組織及空腔臟器，減少血液循環(huán)量，加重組織水腫和臟器功能損傷，導致多器官功能障礙綜合征及高病死率[1-2]。組蛋白的乙酰化修飾是基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)過程中重要的組成部分，在失血性休克條件下，機體去乙酰化增強，導致細胞功能紊亂甚至死亡[2]。組蛋白去乙?；敢种苿?histone deacetylase inhibitors，HDACIs)能夠抑制細胞的高度去乙酰化水平，在分子水平上提高細胞對致死性損傷的耐受能力，并可以減輕缺血缺氧引起的心、腦、腎等重要臟器的損傷[3]。研究發(fā)現(xiàn)HDACIs能提高缺氧損傷心肌細胞拮抗缺氧的能力，應用于嚴重燙傷、膿毒性休克和失血性休克動物模型中，可以提高機體抗炎癥、抗缺氧、抗休克等能力，保護其重要臟器功能[4-5]。血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)是一種高度特異性的血管內(nèi)皮有絲分裂素，其可以特異地作用于血管內(nèi)皮細胞中的受體，在血管內(nèi)皮通透性調(diào)節(jié)中起到重要作用[6-7]。近期研究表明，HDACIs能在動物實驗和體外細胞實驗中抑制VEGF的表達[8]。丙戊酸鈉(valproic acid，VPA)是一種組蛋白去乙?；敢种扑幬?，研究表明在失血性休克和膿毒癥動物實驗中丙戊酸鈉可以修復組蛋白的乙?；剑瑴p少重要臟器損傷，提高動物存活率。近年的動物研究發(fā)現(xiàn)，在嚴重燒燙傷動物模型中，丙戊酸鈉可以保護腦、心臟和腸道等重要臟器的功能，提高存活率[9-11]。本研究將觀察丙戊酸鈉對50% TBSA Ⅲ度燙傷大鼠模型肺微血管內(nèi)皮屏障是否具有保護作用并探討其作用機制。

材料與方法

1 主要試劑和儀器 丙戊酸鈉購自Selleck公司，VEGF、髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)和H3K9 ELISA試劑盒購自北京依科賽公司，甲酰胺購自Sigma公司，分光光度計購自賽默飛公司(NanoDrop Lite)。恒溫干燥箱購自丹泊儀器(昆山)有限公司，全自動酶標儀購自德國Biosys公司 (Bioreader)。

2 動物模型與分組 所有動物實驗均獲得實驗動物委員會的批準并嚴格依照實驗動物委員會的規(guī)定及相關(guān)推薦進行。清潔級雄性SD大鼠64只，購自北京華阜康生物科技股份有限公司，60～70 d齡，體質(zhì)量(250 ± 10) g。適應性飼養(yǎng)2周，實驗前12 h禁食，4 h禁飲。隨機分配為4組：1)NN組(n=16)，假燙后即刻腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液(100 mg/kg)；2)NV組(n=16)，假燙后即刻腹腔內(nèi)注射丙戊酸鈉(300 mg/kg，100 mg/mL 0.9%氯化鈉注射液)；3)SN組(n=16)，燙傷后即刻腹腔內(nèi)注射0.9%氯化鈉注射液(100 mg/kg)；4)SV組(n=16)，燙傷后即刻腹腔內(nèi)注射丙戊酸鈉(300 mg/kg，100 mg/mL 0.9%氯化鈉注射液)。腹腔內(nèi)注射戊巴比妥鈉注射液(50 mg/kg)麻醉滿意后，背、腹部皮膚備皮；燙傷組在100℃水溫下燙傷背部15 s、腹部8 s；假燙組在37℃水溫下浸泡背部15s、腹部8s。燙傷/假燙后立即擦干皮膚水分并予相應治療措施，燙傷后2 h和6 h取材。于各觀察點前30 min麻醉大鼠，頸靜脈注射2%伊文思藍(20 mg/kg，20 mg/mL)，30 min后開胸，自心尖部置入沖洗管并固定，剪開右心耳，灌注37℃保存的1‰肝素鹽水，沖洗至灌出液清亮 后，取肺組織放置于液氮中待測。

3 分光光度法測定肺微血管內(nèi)皮通透性 取沖洗凈血液及殘余EB的肺組織0.2 g，裝入含有2 mL甲酰胺的試管中，放置于37℃恒溫水浴箱中24 h，1 500 g離心30 min，提取上清液，分光光度計于620 nm，1 cm光徑比色皿檢測吸光度值，根 據(jù)標準曲線得出相應EB含量。

4 干濕重法測定肺組織含水率 在吸水紙上吸去肺組織表面水分后，剪取適量新鮮肺組織，稱濕重，置于90℃恒溫干燥箱中，取出標本稱干重( D)。肺組織含水率(%)=(W - D)/W × 100%。

5 分光光度法檢測肺組織MPO活性 準確稱量肺組織，以配好的試劑二溶液為勻漿介質(zhì)，按照重量體積比1∶19加入勻漿介質(zhì)制備成5%的組織勻漿，不需要進行離心；取5%組織勻漿0.9 mL加3號試劑0.1 mL，充分混勻后37℃水浴15 min，取出后待測；混勻，60℃水浴10 min，取出后立即用分光光度計于460 nm處，1 cm光徑比色皿，雙 蒸水調(diào)零，檢測各管吸光度值。

6 ELISA法測定肺組織中VEGF和Ac-H3K9含量 固定時間點取組織后，立即置于液氮中。反復凍融3次后，取0.3 g組織加入0.5 mL組織裂解液，研磨后1 500 g離心5 min，取上清，凍存于-20℃冰箱中待檢測。常溫融化上清和ELISA試劑盒后，按照說明書要求，檢測標準曲線。向試劑盒中加入100 μL上清，蓋上貼紙，在避光 37℃下反應1 h。300 μL洗液洗板5次。加入底物反應液100 μL，避光、室溫、搖床上反應30 min，棄去上清，洗板5次，加入HRP反應液100 μL，反應15 min，酶標儀檢測450 nm處吸光度，并計算樣 品濃度。

7 統(tǒng)計學方法 應用SPSS23.0統(tǒng)計軟件處理，計量資料以±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0 .05為差異有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1 肺組織微血管通透性與含水率 與假燙組相比，大鼠燙傷后2 h即出現(xiàn)肺伊文思藍含量增高(P＜ 0.05)，燙傷后6 h增高更為顯著(P＜ 0.05)；與NS組相比，SV組大鼠肺伊文思藍含量在燙傷后2 h時無明顯差異，在燙傷后6 h時明顯降低(P＜ 0.05)。說明丙戊酸鈉能夠緩解嚴重燙傷引起的肺微血管內(nèi)皮通透性增高。與假燙組大鼠相比，燙傷組大鼠燙傷后2 h肺組織含水率升高(P＜ 0.05)，燙傷6 h顯著升高(P＜ 0.05)。與SN組比較，SV組肺組織含水率在燙傷2 h和燙傷6 h時均有所降低(P均 ＜ 0.05)。說明VPA能夠降低嚴重燙傷引起 的肺組織水腫。見表1。

表1 丙戊酸鈉對燙傷后肺組織微血管通透性和含水率的影響Tab. 1 Effect of sodium valproate on microvascular permeability and water content of lung tissue after scald

2 肺組織VEGF含量、MPO活性和Ac-H3K9表達 與假燙大鼠比較，SN組和SV組大鼠VEGF水平在2 h和6 h時均明顯增高(均P＜ 0.05)。燙傷2 h后，SV組與SN組VEGF水平無統(tǒng)計學差異；燙傷6 h后，SV組大鼠VEGF水平明顯低于SN組大鼠(P＜ 0.05)。說明VPA治療后能夠有效降低嚴重燒傷引起的肺組織VEGF水平增高，進而降低非微血管通透性。與假燙大鼠相比，SN組和SV組大鼠MPO活性在燙傷2 h和6 h時均明顯增高(P均＜ 0.05)。與SN組比較，SV組大鼠肺MPO活性在6 h時明顯降低(P＜ 0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，在燙傷2 h時兩組間無統(tǒng)計學差異。說明VPA能夠緩解嚴重燙傷引起的肺組織MPO活性升高。與NN組比較，燙傷2 h時，SN組Ac-H3K9水平開始下降(P＜ 0.05)，燙傷6 h時下降更為明顯(P＜ 0.05)。SN組大鼠肺組織Ac-H3K9水平在燙傷2 h時即恢復到高于正常水平(P＜ 0.05)，燙傷6 h時增高更為明顯(P＜ 0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。見表2。

表2 VPA對燙傷后肺組織VEGF含量、MPO活性和Ac-H3K9表達的影響Tab. 2 Effect of sodium valproate on VEGF content, MPO activity and Ac-H3K9 expression in lung tissue after scald

討 論

目前燒傷后早期救治工作的重點集中在如何維持組織灌注和保護重要臟器的功能[12]。然而，因燒傷后機體微血管內(nèi)皮屏障受到損傷，即使足量補充液體復蘇，仍可能導致一系列嚴重威脅燒傷患者生命的并發(fā)癥[13-14]。肺通常是嚴重燒傷后首先受到損傷的器官之一，大部分燒傷患者甚至在沒有發(fā)生吸入性損傷和感染的情況下也會發(fā)生急性肺損傷和肺水腫。因此研究對燒傷后肺微血管內(nèi)皮屏障具有保護作用的藥物，對于減輕肺水腫、急性肺損傷及減少燒傷補液需求十分必要[15-17]。

本研究采用50% TBSA Ⅲ度燙傷大鼠模型探討組蛋白去乙?；敢种苿￢PA對燙傷大鼠肺微血管內(nèi)皮屏障的保護作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在嚴重燙傷后，大鼠肺微血管內(nèi)皮屏障被破壞，微血管內(nèi)皮通透性明顯增高，肺組織水腫。VPA治療后能保護燙傷引起的肺微血管內(nèi)皮屏障損傷，降低燙傷大鼠肺微血管內(nèi)皮通透性，減輕組織水腫。

組蛋白的乙?；揎検腔蜣D(zhuǎn)錄調(diào)控的關(guān)鍵機制之一。HATs和HDACs的在生理狀態(tài)下的動態(tài)平衡共同調(diào)節(jié)組蛋白的總體乙酰化水平，稱為“組蛋白的乙酰化平衡”。HDACIs是去乙酰化酶活性抑制藥物，可以降低組蛋白的去乙?；?，從而升高組蛋白的乙酰化水平，保護細胞功能。研究表明，HDACIs能夠抑制失血性、膿毒癥等休克條件下細胞的去乙酰化過程，恢復組蛋白的乙酰化平衡，減輕缺血缺氧引起的心、腦、腎等重要臟器的損傷[3]。丙戊酸鈉是一種HDACIs類藥物[18]。研究表明，在失血性休克和膿毒癥動物實驗中，丙戊酸鈉可以修復組蛋白的乙?；剑瑴p少重要臟器損傷，提高動物生存率[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，正常大鼠腹腔注射丙戊酸鈉后能夠明顯提高肺的組蛋白乙?；剑粻C傷2 h后大鼠肺的組蛋白乙?；郊闯霈F(xiàn)降低，燙傷6 h后乙?；矫黠@降低；燙傷大鼠經(jīng)丙戊酸鈉治療后，在燙傷后2 h和6 h均能顯著提高組蛋白乙?；?。因此猜想丙戊酸鈉可能通過提高組蛋白乙酰化水平改善燙傷大鼠預后。

燒傷引起組織VEGF表達和MPO活性增加。HDACIs類藥物在動物實驗和體外細胞實驗中抑制VEGF表達水平[20]。本研究發(fā)現(xiàn)大鼠嚴重燙傷后肺組織VEGF表達增加，MPO活性增強，同時出現(xiàn)肺微血管內(nèi)皮通透性升高和肺水腫；嚴重燙傷大鼠經(jīng)丙戊酸鈉治療后，其肺組織VEGF表達和MPO活性相對低于燙傷大鼠，同時肺微血管通透性降低，肺水腫減輕。說明丙戊酸鈉通過抑制嚴重燙傷后VEGF的表達和中性粒細胞浸潤，保護肺微血管內(nèi)皮屏障，降低肺微血管通透性和肺水腫。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)嚴重燙傷會導致肺微血管內(nèi)皮屏障的損害，與前人研究類似。丙戊酸鈉能夠?qū)勾瞬±磉^程并保護肺微血管內(nèi)皮屏障，從而改善燙傷后急性肺水腫等并發(fā)癥，其作用機制可能與丙戊酸鈉對VEGF和MPO的抑制作用有關(guān)。