環(huán)丙沙星降解菌的篩選及其降解特性探究

瞿春曉， 溫健竹， 蔡振東， 潘道東，2， 吳 振*

（1. 寧波大學(xué)浙江省動物蛋白食品精深加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江寧波 315211；2. 南京師范大學(xué)食品與制藥工程學(xué)院，江蘇南京 210097）

抗生素是一類具有抑菌活性的化學(xué)物質(zhì)，在預(yù)防和治療細(xì)菌感染疾病上具有良好的效果，但是人們在使用抗生素時卻忽略了抗生素對環(huán)境的污染問題[1]。 隨著醫(yī)療和畜牧養(yǎng)殖業(yè)的蓬勃發(fā)展，抗生素的消費(fèi)量日益增長，然而抗生素的頻繁使用導(dǎo)致環(huán)境污染問題日趨嚴(yán)峻，引起全球?qū)W者的廣泛關(guān)注和高度重視[2]。 氟喹諾酮類是一系列廣譜合成類抗生素，廣泛用作人和獸醫(yī)藥物[3]。 部分氟喹諾酮類藥物通過動物代謝很容易進(jìn)入陸地環(huán)境。 環(huán)丙沙星是應(yīng)用于疾病治療的最為廣泛的處方氟喹諾酮類抗生素[4-7]，然而經(jīng)常在環(huán)境中檢測到高濃度殘留，而且環(huán)丙沙星被證明具有遺傳毒性[8]。 進(jìn)入環(huán)境中的抗生素不僅會誘導(dǎo)環(huán)境中抗性微生物和抗性基因的產(chǎn)生，還會加速抗生素抗性的傳播和擴(kuò)散，所以解決抗生素殘留問題已刻不容緩[9-10]。

目前，控制抗生素的方法主要有非生物法和生物法。 非生物法包括物理方法、化學(xué)方法等，物理方法如原料清洗和特殊材料的吸附作用等；化學(xué)方法如臭氧降解、添加化學(xué)添加劑等，但是運(yùn)用這些方法的高成本和尚不明確的安全性限制了它們的長期應(yīng)用和推廣[11]。 生物法是通過生物的代謝作用改變抗生素的物理化學(xué)性質(zhì)， 即破壞抗生素的結(jié)構(gòu)，使其從復(fù)雜化合物降解成簡單化合物，實(shí)現(xiàn)抗生素的生物轉(zhuǎn)化[12]。相比于非生物法，生物法具有成本低廉、降解過程簡單等優(yōu)點(diǎn)，是目前較為經(jīng)濟(jì)有效的方法[13]。

乳酸菌作為一類發(fā)酵糖類產(chǎn)物為乳酸的益生菌，其特點(diǎn)是革蘭氏染色呈陽性。 目前已知的較多乳酸菌作為腸道內(nèi)的有益微生物，是人類胃腸道中的常駐菌群。 乳酸菌具有較多的益生功能，包括維持腸道菌群的穩(wěn)定性[14]和預(yù)防胃黏膜病變[15]等，在治療消化道疾病上具有良好的效果[16]。 自然界中存在著豐富的乳酸菌。 有研究表明一些乳酸菌有降解抗生素的功能，郝瑩等[17]篩選出一株能降解多種抗生素的乳酸菌，其中對紅霉素、羅紅霉素與螺旋霉素的降解率分別能達(dá)到92.1%、68.9%和82.8%，并且不同菌株的降解能力存在一定差異。 近年來關(guān)于如何降低抗生素污染逐漸成為研究熱點(diǎn)，而國內(nèi)外關(guān)于抗生素的微生物降解研究集中在磺胺類抗生素上[18]。 因此篩選高效降解環(huán)丙沙星的乳酸菌具有重要意義。

作者采用高效液相色譜法篩選高效降解環(huán)丙沙星的菌株， 結(jié)合菌株生理生化特性和16S rDNA基因序列相似性分析，對菌株進(jìn)行鑒定。 此外，探究了乳酸菌降解環(huán)丙沙星的特性，包括致死菌的吸附和活菌的生物降解等。 對今后開發(fā)功能性菌劑，緩解喹諾酮類抗生素的污染奠定基礎(chǔ)，也為微生物治理復(fù)雜環(huán)境的抗生素污染提供參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

Multigene Thermal Cycler PCR 儀： 美國Labnet公司產(chǎn)品；FE28 pH 計(jì)：上海梅特勒-托利多儀器有限公司產(chǎn)品；QHZ-12A 型恒溫振蕩培養(yǎng)箱： 江蘇盛藍(lán)儀器制造有限公司產(chǎn)品；LDZX-50KBS 型高壓滅菌鍋： 上海申安醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；TH-YJ-1450A/B型凈化工作臺： 蘇州華科凈化設(shè)備有限公司產(chǎn)品；Agilent1260 型高效液相色譜儀： 美國Agilent 公司產(chǎn)品；M200 Reader 酶標(biāo)儀： 美國Tecan 公司產(chǎn)品；WH966 漩渦攪拌器：上海康華生化儀器制造有限公司產(chǎn)品；CX21FS1 生物顯微鏡： 日本Olympus 公司產(chǎn)品；E0303 電泳儀： 寧波歐普儀器有限公司產(chǎn)品；GT16-3M 型迷你離心機(jī)：杭州米歐儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 主要試劑和培養(yǎng)基

色譜級乙腈、三乙胺、磷酸、環(huán)丙沙星（純度≥90%）、MRS 培養(yǎng)基： 上海生物工程有限公司產(chǎn)品；細(xì)菌DNA 提取試劑盒：北京全氏金有限公司產(chǎn)品。

環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)儲備液（1 mg/mL）：色譜級環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品溶解在0.03 mol/L NaOH 溶液中以獲得1 mg/mL 環(huán)丙沙星的儲備溶液， 并在-20 ℃下保存在棕色瓶中。

BSM 培養(yǎng)基[19-20]：4 mg/L MgSO4·7H2O、0.1 mg/L CaCl2、4 mg/L KCl、0.01 mg/L FeSO4、0.2 mg/L NaCl、0.5 mg/L KH2PO4、0.5 mg/L K2HPO4；pH 7.0。

CaCO3-MRS 瓊脂培養(yǎng)基： 在MRS 固體培養(yǎng)基基礎(chǔ)上加質(zhì)量分?jǐn)?shù)1%的碳酸鈣。 培養(yǎng)基均在121 ℃下滅菌15 min。

1.3 方法

1.3.1 環(huán)丙沙星降解菌的篩選將純化過的乳酸菌接種至MRS 培養(yǎng)基中，在37 ℃活化菌株6 h，并按體積分?jǐn)?shù)2%接種到BSM 培養(yǎng)基中，添加環(huán)丙沙星至質(zhì)量濃度為4 μg/mL。 將培養(yǎng)基置于轉(zhuǎn)速為150 r/min 的搖床中37 ℃培養(yǎng)48 h，取上清液，用高效液相色譜測定剩余環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度，篩選對環(huán)丙沙星具有較強(qiáng)降解作用的菌株。 同時設(shè)未加入菌體的同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星溶液作為陰性對照。 其中高效液相色譜條件： 采用ZORBAX XDB-C18 色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），檢測波長為278 nm，柱溫為30 ℃，流動相A 為0.05 mol/L 磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH 至2.4），B 為色譜級乙腈，V（乙腈）∶V(0.05 mol/L 磷酸溶液)=87∶13，流量為1.0 mL/min，進(jìn)樣量為20 μL。

分別配制質(zhì)量濃度為1、2、5、10、20、100 μg/mL的環(huán)丙沙星溶液。 進(jìn)樣前將色譜柱平衡10～20 min，取1 mL 工作液按上述方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，空白為1 mL超純水，取3 次平行實(shí)驗(yàn)結(jié)果。 以環(huán)丙沙星的相對峰面積表示縱坐標(biāo)，相對應(yīng)的環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度表示橫坐標(biāo)，將得到的數(shù)據(jù)繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 環(huán)丙沙星降解菌的鑒定對環(huán)丙沙星降解菌進(jìn)行初步鑒定。 菌株活化培養(yǎng)后，用無菌生理鹽水對菌株活化液進(jìn)行梯度稀釋，分別取0.1 mL 稀釋度為10-4、10-5、10-6的培養(yǎng)液， 涂布在CaCO3-MRS瓊脂培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)24 h。 隨后進(jìn)行革蘭氏染色鏡檢和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)[21-23]。

另外， 挑取處于對數(shù)生長期的菌株進(jìn)行16S rDNA 基因序列分析，用細(xì)菌DNA 提取試劑盒提取菌株的基因組DNA。 以下引物用于PCR 擴(kuò)增編碼16S rRNA 的基因：正向引物27F（5′-AGA GTT TGA TTC TGG CTC AG-3′）， 反向引物1492R （5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T -3′）[24]。PCR 反應(yīng)體系如下：50 μL 反應(yīng)體系，其中模板2 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、2×TaqDNA 聚合酶25 μL、ddH2O 1 μL，其中空白對照組用ddH2O 補(bǔ)足。PCR 擴(kuò)增條件：94 ℃預(yù)變性5 min；之后按94 ℃下30 s，55 ℃下30 s，72 ℃下30 s 的條件變性， 共33 個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，4 ℃保溫。 然后進(jìn)行質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證所得PCR 產(chǎn)物， 將1 500 bp 左右的PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物送至上海生工有限公司測序，并登陸NCBI 網(wǎng)站對測序結(jié)果進(jìn)行BLAST 比對，采用鄰接法（neighborhood-joining）進(jìn)行同源性分析，通過MEGA 7.0 軟件用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.3.3 菌體最適生長溫度和pH 的確定菌株活化后， 按體積分?jǐn)?shù)2%接種到6 份MRS 液體培養(yǎng)基中， 分別放置在培養(yǎng)溫度為20、25、30、35、40 ℃和45 ℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h 后取樣，每組3 次平行，酶標(biāo)儀測定OD600。 加入無菌水作為對照實(shí)驗(yàn)。菌株活化后， 按體積分?jǐn)?shù)2%接種到7 份無菌MRS 液體培養(yǎng)基中，調(diào)pH 至5、6、6.5、7、7.5、8 和9培養(yǎng)24 h 后取樣， 每組3 次平行， 酶標(biāo)儀測定OD600。 加入無菌水作為對照實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 菌體活性對實(shí)驗(yàn)菌株降解環(huán)丙沙星的影響分別活化兩份實(shí)驗(yàn)菌，其中一份經(jīng)高溫（121 ℃、20 min）致死。 收集兩份菌體重懸于無菌BSM 培養(yǎng)基中， 調(diào)整菌體濃度和環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度為1×108CFU/mL 和4 μg/mL， 置于轉(zhuǎn)速為150 r/min 的搖床中35 ℃培養(yǎng)48 h，每隔6 h 離心取上清液，用高效液相色譜測定環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度，同時設(shè)未加入菌體的同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星溶液作為陰性對照。

1.3.5 胞內(nèi)外物質(zhì)以及細(xì)胞壁對降解環(huán)丙沙星的影響參考文獻(xiàn)[25]的方法并修改，在100 mL MRS肉湯中活化實(shí)驗(yàn)菌， 收集菌體懸浮于0.01 mol/L 的磷酸鹽緩沖液中，調(diào)整其菌體濃度為1×108CFU/mL，超聲波破碎（350 W，工作8 s 間隔3 s）30 min，并在4 ℃條件下以轉(zhuǎn)速14 000 r/min 離心30 min， 菌株胞內(nèi)物質(zhì)即為離心后的上清液，細(xì)胞壁成分為離心后的沉淀物，另外收集菌活化時的培養(yǎng)液為胞外物質(zhì)，分別將胞內(nèi)外物質(zhì)和細(xì)胞壁與環(huán)丙沙星溶液共培養(yǎng)使其質(zhì)量濃度達(dá)到4 μg/mL，并于35 ℃且轉(zhuǎn)速為150 r/min 的搖床中培養(yǎng)24 h，分別在12、18、24 h離心取上清液，高效液相色譜法測定環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度，同時設(shè)未加入菌體的同質(zhì)量濃度環(huán)丙沙星溶液作為空白對照。

1.3.6 數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次，采用SAS 8.0 軟件中單因素方差（One-way ANOVA）中的鄧肯多重比較（Duncan’s Multiple Range Test）模型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，P<0.05 表示差異顯著。 采用Origin 9.0 軟件進(jìn)行繪圖。 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

2 結(jié)果與討論

2.1 環(huán)丙沙星降解菌的篩選

由圖1（a）和圖1（b）可知，環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)品在13.059 min 有峰值， 且相對峰面積與環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度具有良好的線性關(guān)系。 在前期確定的最優(yōu)色譜條件下，采用高效液相色譜法對環(huán)丙沙星質(zhì)量濃度進(jìn)行測定。 在18 h 時，WQ-Y1 降解率最高可達(dá)70.2%，見圖1（c）。

圖1 環(huán)丙沙星的測定及被菌株WQ-Y1 降解的情況Fig. 1 Determination of ciprofloxacin and its degradation by WQ-Y1

2.2 降解菌的鑒定

菌落外表直徑為1～3 mm， 圓形隆起， 表面光滑，乳白色，符合乳酸菌菌落特征，由革蘭氏染色和過氧化氫酶實(shí)驗(yàn)確定菌株WQ-Y1 鏡檢形態(tài)為革蘭氏陽性，過氧化氫陰性桿菌。 16S rDNA 測序同源性分析見圖2， 菌株WQ-Y1 與羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）處于同一進(jìn)化分支上，兩者核苷酸序列具有99%以上的同源性， 所以菌株WQY1 被鑒定為羅伊氏乳桿菌。保藏于中國微生物菌種保藏中心，其保藏編號為：CGMCC No.17078。

圖2 菌株WQ-Y1 的形態(tài)特征和系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Morphological characteristics and phylogenetic tree of WQ-Y1

2.3 羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 基本生長特性分析

由圖3（a）可知，培養(yǎng)溫度從20 ℃上升到35 ℃過程中，WQ-Y1 的菌密度呈遞增趨勢，35 ℃以后菌密度呈下降趨勢， 說明當(dāng)培養(yǎng)溫度在35 ℃附近時菌體的生長狀況較好。故實(shí)驗(yàn)溫度選擇35 ℃。由圖3（b）可知，培養(yǎng)液最初pH 從5.0 上升到7.0 過程中，WQ-Y1 的菌密度呈遞增趨勢， 在pH 為7.0 以后菌密度呈下降趨勢， 說明培養(yǎng)液pH 在約為7.0時菌體的生長情況是最好的， 故實(shí)驗(yàn)初始pH 選擇7.0。

圖3 不同溫度和pH 下羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 的生長情況Fig. 3 Growth of L. reuteri WQ-Y1 under different temperatures and pH

2.4 菌體活性對羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 降解環(huán)丙沙星的影響

由圖4 可知，相比于致死菌對環(huán)丙沙星的降解作用，活菌對環(huán)丙沙星的降解率明顯較高。 這表明菌株的代謝活性是影響環(huán)丙沙星降解的一個重要因素，而致死菌株對環(huán)丙沙星的去除作用可能是由于菌株細(xì)胞表面具有吸附作用。 初步推斷羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 降解環(huán)丙沙星除了依靠菌體的代謝活性以外，還伴隨著細(xì)胞壁的吸附作用。 前人研究發(fā)現(xiàn)，失活的乳酸菌能夠有效去除黃曲霉毒素，原因是菌株細(xì)胞壁對黃曲霉毒素具有物理吸附作用[26]。由此得出結(jié)論： 羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 依靠物理吸附和生物降解作用共同降解環(huán)丙沙星。

圖4 菌體活性對羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 降解環(huán)丙沙星的影響Fig. 4 Effect of bacterial activity on degradation of ciprofloxacin by L. Reuteri WQ-Y1

2.5 胞內(nèi)外物質(zhì)及細(xì)胞壁對羅伊氏乳桿菌WQY1 降解環(huán)丙沙星的影響

由圖5 可知， 在18 h 時羅伊氏乳桿菌WQ-Y1的胞內(nèi)外物質(zhì)對環(huán)丙沙星的降解率均達(dá)到最高，其中胞外物質(zhì)對環(huán)丙沙星降解率為17.7%， 胞內(nèi)物質(zhì)對環(huán)丙沙星的降解率達(dá)到23.4%， 但隨著時間的增加，降解速率略有下降，并最終趨于穩(wěn)定。 這可能是因?yàn)榫赀_(dá)到對數(shù)期后繼續(xù)培養(yǎng)， 菌株活性降低，降解環(huán)丙沙星的能力減弱。 而細(xì)胞壁對環(huán)丙沙星的降解率在3 個時間段穩(wěn)定保持在37.0%左右。Jia 等研究發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)的乙?；负图?xì)胞色素P450 酶對降解硫酸鹽還原菌污泥系統(tǒng)中的環(huán)丙沙星有促進(jìn)作用[27]。 所以推測WQ-Y1 在降解環(huán)丙沙星時可能伴隨生物酶的促進(jìn)作用。 探究胞外物質(zhì)對環(huán)丙沙星的降解，推測可能存在2 個方面：一方面是由于胞外代謝物存在某些成分能夠與環(huán)丙沙星發(fā)生相互作用，導(dǎo)致環(huán)丙沙星含量下降，另一方面是由于胞外聚合物（EPS）形成過程中聚集了不同的帶電基團(tuán)和非極性基團(tuán)[28]，其中，EPS 中疏水區(qū)域有利于有機(jī)物的吸附[29]。在該研究中，無論是細(xì)胞壁還是胞內(nèi)外物質(zhì)對環(huán)丙沙星的降解率都遠(yuǎn)低于完整羅伊氏乳桿菌的降解率，這進(jìn)一步表明菌株對環(huán)丙沙星的物理吸附作用和菌株體內(nèi)的酶都并非是羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 降解環(huán)丙沙星的單一途徑， 而是依賴于具有活性的完整菌株。

圖5 胞內(nèi)外物質(zhì)及細(xì)胞壁對降解環(huán)丙沙星的影響Fig. 5 Effects of intracellular and extracellular substances and cell walls on the degradation of ciprofloxacin

3 結(jié) 語

利用高效液相色譜法分析菌株降解環(huán)丙沙星的能力，篩選得到一株對環(huán)丙沙星具有高效降解作用的乳酸菌WQ-Y1，降解率達(dá)到70.2%。 通過16S rDNA 基因組分析鑒定WQ-Y1 為羅伊氏乳桿菌。此外， 羅伊氏乳桿菌WQ-Y1 降解環(huán)丙沙星是依靠物理吸附和生物降解的共同作用，而且胞內(nèi)外物質(zhì)和細(xì)胞壁對環(huán)丙沙星的降解率遠(yuǎn)低于完整羅伊氏乳桿菌的降解率，也說明了環(huán)丙沙星降解伴隨著活菌代謝的作用。 為乳酸菌降解抗生素研究提供參考，也為微生物治理復(fù)雜環(huán)境的抗生素污染提供更多選擇。