不同米蛋白組分與鉛的結(jié)合規(guī)律

馮 偉， 范大明， 董田田， 李克強，倪雙雙， 王 濤， 張 昊， 王韌*

（1. 糧食發(fā)酵工藝與技術(shù)國家工程實驗室， 江南大學(xué)， 江蘇無錫 214122； 2. 江南大學(xué)食品學(xué)院， 江蘇無錫 214122）

大米是我國重要的主糧，近年來大米重金屬污染事件頻發(fā)，對國民健康造成了潛在危害[1]。 鉛（Pb2+）是大米重金屬污染中最典型的元素之一，Pb2+由工業(yè)“三廢”排放、礦藏開采等途徑進入土壤和水源，隨著水稻生長富集，再通過飲食進入人體，人體中血鉛超標易引起貧血， 損害人體神經(jīng)、 血液、骨骼、消化、生殖等系統(tǒng)[2]。

Pb2+主要與大米中的蛋白質(zhì)組分相結(jié)合[3]。 現(xiàn)有研究工作主要側(cè)重于Pb2+在稻米中的分布規(guī)律、檢測技術(shù)、脫除方法、健康風(fēng)險評估等方面[4-6]，例如張園園等采用氣浴振蕩輔助檸檬酸法脫除稻谷中的Pb2+，在優(yōu)化條件下Pb2+脫除率達34.27%[6]，但從理論層面探索Pb2+與蛋白質(zhì)的結(jié)合特征、 結(jié)合機理的報道卻鮮有見聞。 根據(jù)在不同溶劑中溶解度的差異，米蛋白各組分分為清蛋白、球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白，其中清蛋白水溶性好，且主要分布于米糠中[7]，研究其與Pb2+的結(jié)合代表性不強。

作者以3 種水不溶性米蛋白組分 （球蛋白、醇溶蛋白和谷蛋白）為研究對象，通過建立動力學(xué)模型和等溫吸附模型探究各組分與Pb2+的結(jié)合機制，并通過X 射線光電子能譜（XPS）和掃描電鏡（SEM）對與Pb2+結(jié)合后的醇溶蛋白進行表征， 進一步探討蛋白質(zhì)與Pb2+的結(jié)合位點及蛋白質(zhì)微觀結(jié)構(gòu)變化，以期為大米除鉛技術(shù)的開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米：稻米品種為南粳9108，泰州市和平米業(yè)有限公司提供，采用衢州市庫米賽諾糧食機械制造有限公司的高性能節(jié)能砂帶碾米機 （KMSNMNMD65-B）經(jīng)4 道碾磨加工制備而成；硝酸鉛、氫氧化鈉、鹽酸、硫酸、氯化鈉、氯化鐵、氯化鈣、乙醇、溴化鉀、乙二胺四乙酸二鈉、檸檬酸三鈉、醋酸鈉、焦磷酸鈉（分析純）、硝酸（優(yōu)級純）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

Avanti J-26 XP 高速離心機： 美國貝克曼公司產(chǎn)品；透析袋（截留相對分子質(zhì)量50 000）：上海哈靈生物科技公司產(chǎn)品；Beta 2-8 L Dplus 型凍干機：德國Marin Christ 公司產(chǎn)品；X-射線光電子能譜分析儀250 XI： 日本島津公司產(chǎn)品；Quanta 200 型掃描電子顯微鏡： 美國FEI 公司產(chǎn)品；WX-6000 型微波消解儀： 上海屹堯儀器科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品；AA-220/220Z 原子吸收分光光度計：美國瓦里安公司產(chǎn)品；Millipore-Q 型超純水系統(tǒng)： 美國Millipore公司產(chǎn)品；RV10 型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：德國IKA 公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 米蛋白組分的制備3 種水不溶性米蛋白的制備參照傳統(tǒng)Osborne 法并加以改良[8]，如下：將大米粉碎后過80 目篩， 按固液比1 g∶8 mL 混合大米粉和去離子水，用1.0 mol/L NaOH 調(diào)節(jié)pH 至12.0，攪拌提取4 h 后5 000 g 離心10 min 收集上清液。用1.0 mol/L HCl 調(diào)節(jié)上清液pH 至4.5，5 000 g 離心10 min 收集沉淀，即為米蛋白組分混合物。 將此蛋白質(zhì)混合物依次用去離子水、4 g/dL NaCl、 體積分數(shù)70%的乙醇、0.1 mol/L NaOH 連續(xù)提取， 各攪拌1 h 后5 000 g 離心10 min，棄去水提上清液，收集其余步驟上清液。 用0.1 mol/L HCl 調(diào)節(jié)鹽提、堿提上清液pH 分別至4.3 和4.8，5 000 g 離心10 min收集相應(yīng)沉淀。 醇提上清液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃蒸發(fā)濃縮至原體積的10%， 加入10 倍去離子水混勻，5 000 g 離心10 min 收集沉淀。將上述3 種沉淀分別用去離子水調(diào)成pH 6.0 的溶液，置于透析袋中透析24 h，每4 h 更換去離子水。透析結(jié)束進行冷凍干燥，得到球蛋白、谷蛋白和醇溶蛋白，樣品放置于－22 ℃冰箱備用。

1.3.2 米蛋白與Pb2+的結(jié)合反應(yīng)準確稱取0.06 g米蛋白，加入10 mL 超純水，水浴振蕩分散1 h，按照設(shè)定的Pb2+質(zhì)量濃度，加入一定體積硝酸鉛溶液，用超純水補至20 mL， 在30 ℃水浴中以150 r/min振蕩反應(yīng)一定時間，反應(yīng)結(jié)束后8 000 g 離心3 min取上清液，采用火焰原子吸收分光光度計測定吸附前后溶液中Pb2+質(zhì)量濃度。 米蛋白的Pb2+結(jié)合量（q）可參照下方公式計算。

式中：q 為米蛋白的Pb2+結(jié)合量，mg/g；c0為溶液中Pb2+的初始質(zhì)量濃度，mg/L；c1為反應(yīng)后溶液中Pb2+質(zhì)量濃度，mg/L；m 為米蛋白質(zhì)量，g；v 為溶液體積，L。

1.3.3 理化指標測定

1） Pb2+質(zhì)量濃度的測定 參照GB 5009.12—2017《食品安全國家標準食品中鉛的測定》中第三法火焰原子吸收光譜法。

2） 蛋白質(zhì)的測定 參照GB 5009.5—2016《食品安全國家標準食品中蛋白質(zhì)的測定》中第一法凱式定氮法，氮轉(zhuǎn)化系數(shù)為5.95。

1.3.4 動力學(xué)模型建立參照1.3.2 所述方法，設(shè)定Pb2+初始質(zhì)量濃度為100 mg/L，pH 6.0，反應(yīng)溫度30 ℃， 在反應(yīng)時間分別為2、5、10、30、60、120 min時測定溶液中Pb2+質(zhì)量濃度， 得到q 隨時間的變化曲線，采用準一級動力學(xué)模型（公式2）、準二級動力學(xué)模型（公式3）以及Elovich 動力學(xué)模型（公式4）對數(shù)據(jù)進行擬合[9]。

式中：qe為平衡吸附量，mg/g；t 為反應(yīng)時間，min；k1為準一級動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)，min-1；k2為準二級動力學(xué)反應(yīng)速率常數(shù)，g/（mg·min）；a，b 為反應(yīng)常數(shù)。

1.3.5 等溫吸附模型的建立參照1.3.2 所述方法， 設(shè)定Pb2+初始質(zhì)量濃度分別為10、20、40、60、80、100、120、140 mg/L，pH 6.0， 反應(yīng)時間120 min，并分別在15、30、45 ℃下進行反應(yīng)， 繪制等溫吸附曲線，采用Langmuir 模型（公式5）和Freundlich 模型（公式6）進行擬合[10]，其線性化方程如下：

式中：qe為平衡吸附量，mg/g；qmax為飽和吸附量，mg/g；ce為平衡質(zhì)量濃度，mg/L；KL為與吸附強度有關(guān)的L模型吸附平衡常數(shù)；KF為與吸附容量有關(guān)的F 模型吸附平衡常數(shù)；n 為與吸附強度有關(guān)的F 模型常數(shù)。

參照文獻[11-12]， 熱力學(xué)參數(shù)吉布斯自由能ΔG°（kJ/mol）、焓變ΔH°（kJ/mol）和熵變ΔS°（J/mol）的計算采用以下公式：

式中：KL為L 模型吸附平衡常數(shù)；R 為理想氣體常數(shù)，8.314 J/（mol·K）；T 為開爾文溫度，K。

1.3.6 X 射線光電子能譜分析（XPS）醇溶蛋白在Pb2+初始質(zhì)量濃度100 mg/L， 溫度30 ℃，pH 6.0 條件下反應(yīng)2 h，反應(yīng)結(jié)束后離心取沉淀，水洗2 次，然后進行冷凍干燥。 將干燥的醇溶蛋白和醇溶蛋白-Pb2+結(jié)合物用于XPS 分析。 使用Al-KαX 射線源， 能譜掃描范圍為1～1 300 eV， 用結(jié)合能為285.0 eV 的C1s 校準光譜進行校正。

1.3.7 表觀形態(tài)分析將上述干燥后的醇溶蛋白和醇溶蛋白-Pb2+結(jié)合物固定于導(dǎo)電膠表面，在真空環(huán)境中噴涂鉑金（厚度約30 nm），使用Quanta-200掃描電子顯微鏡（SEM）觀察拍攝。

1.4 數(shù)據(jù)處理

利用SPSS 17.0 和Excel 軟件進行數(shù)據(jù)處理及統(tǒng)計分析。利用Origin 9.0 軟件進行圖形繪制。數(shù)據(jù)以平均值±標準差的方式表示。 每次實驗重復(fù)3 次。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同米蛋白樣品的蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)

采用改良Osborne 法提取得到的3 種米蛋白質(zhì)量分數(shù)見表1，其中球蛋白與谷蛋白達到94%以上，醇溶蛋白達到88%，質(zhì)量分數(shù)較高。 傳統(tǒng)方法中蛋白質(zhì)質(zhì)量分數(shù)較低，主要雜質(zhì)是淀粉及多糖，而作者采取的方法在第一步總蛋白的提取中已除去了大量的雜質(zhì)，且經(jīng)過水洗、透析等步驟，純度得到很大提高。

表1 3 種米蛋白的質(zhì)量分數(shù)分析Table 1 Mass ratio analysis of different rice protein

2.2 不同米蛋白與Pb2+結(jié)合的動力學(xué)

如圖1 所示，球蛋白、醇溶蛋白、谷蛋白3 種蛋白質(zhì)與Pb2+的結(jié)合均在較短時間內(nèi)達到了平衡，在前10 min 內(nèi)反應(yīng)迅速，之后反應(yīng)速度變慢并逐漸達到飽和，30 min 后q 基本不再增加。 這可能是因為蛋白質(zhì)表面可結(jié)合Pb2+的位點數(shù)有限， 反應(yīng)開始時大量Pb2+急速涌向結(jié)合位點，導(dǎo)致q 快速升高；隨著Pb2+逐漸結(jié)合到蛋白質(zhì)上， 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的致密性增加，結(jié)合位點被占據(jù)殆盡，q 增速越來越緩慢[13]，并逐漸達到平衡狀態(tài)。 醇溶蛋白、球蛋白、谷蛋白的平衡結(jié)合量依次為20.54、12.00、3.32 mg/g， 可見醇溶蛋白對Pb2+的吸附能力最強。

圖1 不同米蛋白與Pb2+的結(jié)合量（q）隨時間的變化曲線Fig. 1 Adsorption quantity (q) of different rice protein to Pb2+at the different time

如表2 所示，采用準一級動力學(xué)模型、準二級動力學(xué)模型以及Elovich 動力學(xué)模型來描述3 種米蛋白與Pb2+的結(jié)合過程。 準一級動力學(xué)模型假設(shè)吸附速率與有效吸附位點數(shù)成正比， 即為物理吸附；準二級動力學(xué)模型假設(shè)吸附速率與有效吸附位點數(shù)的平方成正比，吸附質(zhì)與吸附劑表面的官能團之間發(fā)生了電子共享或者交換，即為化學(xué)吸附[14-15]；Elovich 動力學(xué)模型綜合了準一級和準二級動力學(xué)模型的邊界條件范圍，即同時存在物理吸附與化學(xué)吸附[16]。表2 中Elovich 動力學(xué)模型和準一級動力學(xué)模型擬合得到的線性相關(guān)系數(shù)R2較低，準二級動力學(xué)模型的擬合參數(shù)R2均達到0.99 以上， 且擬合得到的該反應(yīng)條件下的理論平衡吸附量（qe）與前文中的實測值十分接近，說明準二級動力學(xué)模型可以更好地擬合3 種米蛋白與Pb2+的結(jié)合過程， 此結(jié)合反應(yīng)以化學(xué)吸附為主。

表2 不同米蛋白與Pb2+結(jié)合的動力學(xué)參數(shù)Table 2 Kinetic adsorption parameters of Pb2+to different proteins

2.3 不同米蛋白與Pb2+結(jié)合的等溫吸附模型及熱力學(xué)分析

圖2 顯示了在不同初始質(zhì)量濃度、 不同溫度下，Pb2+平衡質(zhì)量濃度與各蛋白質(zhì)組分qe的關(guān)系。當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度較低時，qe增長較快， 尤其是醇溶蛋白；而當(dāng)Pb2+質(zhì)量濃度較高時，qe的增長逐漸變緩并趨穩(wěn)。 這可能是因為蛋白質(zhì)表面可與Pb2+結(jié)合的位點數(shù)量一定， 低初始質(zhì)量濃度時Pb2+可結(jié)合的位點充足，結(jié)合迅速[17]；隨著Pb2+質(zhì)量濃度的增加，蛋白質(zhì)表面未被占據(jù)的結(jié)合位點逐漸減少， 同時高Pb2+質(zhì)量濃度導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，比表面積減小[18]，結(jié)合位點總量進一步減少，促進反應(yīng)趨向平衡。除Pb2+初始質(zhì)量濃度的影響之外， 溫度對蛋白質(zhì)與Pb2+的結(jié)合也有重要影響，3 種米蛋白均呈現(xiàn)出溫度升高利于吸附的現(xiàn)象， 這與Liu 關(guān)于大豆微球蛋白對Pb2+吸附的研究結(jié)論一致[19]。 在一定范圍內(nèi)溫度上升，一方面可促進蛋白質(zhì)溶脹，使肽鏈伸展，進而比表面積增大，基團暴露，有利于吸附的進行；另一方面也可能是由于各蛋白質(zhì)組分與Pb2+的結(jié)合過程為吸熱反應(yīng)，適當(dāng)升溫提高了反應(yīng)的平衡常數(shù)。

圖2 不同米蛋白與Pb2+結(jié)合的等溫吸附線Fig. 2 Isothermal adsorption line of Pb2+binding to different proteins

采用Langmuir 模型和Freundlich 模型對3 種米蛋白在不同溫度下的吸附數(shù)據(jù)進行擬合，見表3。相比于Freundlich 模型，Langmuir 模型的R2較高，可以更好地擬合蛋白質(zhì)與Pb2+的結(jié)合過程。Langmuir 模型主要適用于發(fā)生在吸附基質(zhì)表面的單分子層吸附過程，該模型假定吸附基質(zhì)表面均勻分布著活性位點且不發(fā)生相互作用[20]。 這說明3 種米蛋白與Pb2+的結(jié)合均是以均勻的單分子層吸附為主，這也解釋了圖1 中q 隨時間變化快速達到平衡的原因。 此外，表3 中3 種米蛋白的最大吸附量qmax均隨著溫度的升高而增大。 吸附反應(yīng)過程一般同時存在物理吸附和化學(xué)吸附，物理吸附是以范德華力為作用力的單分子層或多分子層吸附，此類吸附不穩(wěn)定、易解吸、不受溫度影響；化學(xué)吸附則是以化學(xué)鍵為作用力的單分子層吸附，溫度升高可加快吸附速率，一定范圍內(nèi)可提高吸附量[21]。由此推斷3 種米蛋白組分與Pb2+的結(jié)合主要為化學(xué)吸附， 這與前文中動力學(xué)分析的結(jié)論一致。

由表3 中的熱力學(xué)數(shù)據(jù)可知，3 種米蛋白的ΔG°均為負值， 表明3 種米蛋白與Pb2+的結(jié)合是自發(fā)反應(yīng)；ΔS°、ΔH°均為正值，說明此結(jié)合過程是熵驅(qū)動的吸熱反應(yīng)，進一步證實了前文中關(guān)于隨溫度升高qmax增大原因的推測。 從數(shù)值來看，3 種米蛋白與Pb2+結(jié)合的ΔH°較小，且為正值，ΔS°為正值，這說明可能是疏水作用在吸附過程中起到了重要作用[22]。醇溶蛋白的ΔS°、ΔH°數(shù)值均高于其他兩種蛋白質(zhì)，說明醇溶蛋白對Pb2+有較強的吸附性能[23]。

表3 不同米蛋白與Pb2+結(jié)合的等溫吸附模型及熱力學(xué)參數(shù)Table 3 Isothermal adsorption models fitting parameters and adsorption thermodynamic parameters of Pb2+ to different proteins

2.4 醇溶蛋白與Pb2+結(jié)合的基團變化

采用X 射線光電子能譜技術(shù)（XPS）對醇溶蛋白與Pb2+結(jié)合后的基團變化進行表征。 如圖3 （a）所示，在140 eV 附近觀察到Pb4f 結(jié)合能的特征峰[24]，說明Pb2+與醇溶蛋白之間發(fā)生了化學(xué)結(jié)合。 S 原子的峰發(fā)生了明顯的重疊現(xiàn)象，故采用Peakfit 軟件通過高斯擬合進行分峰處理，獲取單峰信息。 圖3（c）顯示， 醇溶蛋白O1s 在532.3 eV 附近有顯著的峰值，且峰位移較小、峰強度減弱，這個位置對應(yīng)于醚基團（主要是羧基）[11，25]。醇溶蛋白N1s 結(jié)合Pb2+后在399.9 eV 處出峰，結(jié)合能未發(fā)生轉(zhuǎn)移但強度顯著降低（P<0.05），說明含N 基團與Pb2+發(fā)生了結(jié)合[26]。 醇溶蛋白S2p 分別在159.8、163.8 eV 和167.9 eV 附近出峰，代表硫醚基（—S—）、巰基（—SH）和磺酸基（—SO3）[27]，這些基團結(jié)合能的移動或強度變化均說明了含硫基團與Pb2+發(fā)生結(jié)合作用。Takashi 等在研究中發(fā)現(xiàn)，大米醇溶蛋白中含硫的氨基酸含量較高，這正是醇溶蛋白對Pb2+吸附能力強的原因[28]。

圖3 醇溶蛋白結(jié)合Pb2+前后的XPS 及峰型高斯擬合圖Fig. 3 XPS spectra of prolamin before and after binding with Pb2+

2.5 醇溶蛋白與Pb2+結(jié)合的表觀形態(tài)變化

醇溶蛋白結(jié)合Pb2+前后的掃描電子顯微鏡形貌觀察見圖4， 未結(jié)合Pb2+的醇溶蛋白原本呈現(xiàn)出片層連接結(jié)構(gòu)； 在結(jié)合Pb2+之后， 蛋白質(zhì)顆粒發(fā)生聚集，并形成了更加致密的團塊狀結(jié)構(gòu)。

圖4 醇溶蛋白結(jié)合Pb2+前后的SEM 圖Fig. 4 SEM image of prolamin before and after binding Pb2+

這證實了前文中關(guān)于Pb2+導(dǎo)致蛋白質(zhì)發(fā)生聚集，引起比表面積減小、結(jié)合位點總量減少的猜測。此聚集現(xiàn)象主要是由于Pb2+所帶正電荷與蛋白質(zhì)表面帶負電荷的基團形成化學(xué)鍵引起[18]，與等溫吸附模型的解釋一致。

3 結(jié) 語

通過對3 種水不溶性米蛋白組分與鉛的結(jié)合能力進行分析，得到如下結(jié)論：3 種蛋白質(zhì)對鉛的結(jié)合均是以在蛋白質(zhì)表面的單分子層形式發(fā)生化學(xué)吸附為主，是熵驅(qū)動的自發(fā)吸熱反應(yīng)過程，結(jié)合過程符合準二級動力學(xué)模型、Langmuir 等溫吸附模型。 3 種蛋白質(zhì)中醇溶蛋白對鉛的吸附能力最強，XPS 譜圖表明醇溶蛋白與鉛發(fā)生結(jié)合的基團主要是含氮、含硫基團，蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)由未結(jié)合時的片層狀轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)合后的聚集團塊狀， 結(jié)構(gòu)更加致密，引起結(jié)合位點總量減少，可加快反應(yīng)平衡的速度。