H-蛋白中Asp-68和Tyr-70定向突變對甘氨酸裂解酶系整體酶活的調(diào)控

張 涵 李宇辰 聶晶磊 任 杰 曾安平,3*

(1.北京化工大學(xué) 軟物質(zhì)科學(xué)與工程高精尖創(chuàng)新中心，北京 100029；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院 植物保護(hù)研究所，北京 100081；3.漢堡工業(yè)大學(xué)，德國漢堡 21073)

引 言

為了順應(yīng)全球綠色低碳發(fā)展的趨勢[1]，我國于2020年明確設(shè)定了“碳達(dá)峰”和“碳中和”的目標(biāo)，并將其納入生態(tài)文明建設(shè)的整體布局之中。實現(xiàn)碳中和的主要方式是碳抵消和發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)[2]，而CO2資源化利用(C1合成)是發(fā)展低碳經(jīng)濟(jì)的重要一環(huán)，其主要通過羧基化或還原途徑將CO2轉(zhuǎn)化成化學(xué)制品或燃料[3-4]，因此，C1合成的研究對于CO2的高效資源化利用具有重要意義。目前，已有多條C1合成途徑被提出，例如絲氨酸途徑[5]、還原甘氨酸途徑[6]、還原乙酰輔酶A途徑[7]以及核酮糖-磷酸途徑[8]等，其中還原甘氨酸途徑由于遠(yuǎn)離中心代謝途徑以及具有合理的高化學(xué)動力而被認(rèn)為是最有前景的C1合成途徑[9]。還原甘氨酸途徑以CO2還原產(chǎn)生的C1化合物——甲酸作為原料，首先，甲酸與輔因子四氫葉酸(THF)相連實現(xiàn)活化，之后被還原生成亞甲基-四氫葉酸(methylene-THF)；進(jìn)一步地，methylene-THF作為C1供體與CO2和NH3聯(lián)合反應(yīng)，并在甘氨酸裂解酶系的催化下生成C2化合物——甘氨酸；此后，甘氨酸繼續(xù)與methylene-THF結(jié)合，生成C3化合物——絲氨酸；最終，絲氨酸會被轉(zhuǎn)化為丙酮酸，進(jìn)入中心代謝網(wǎng)絡(luò)以合成下游化學(xué)品[10-13]。

甘氨酸裂解酶系主導(dǎo)的甘氨酸合成反應(yīng)是還原甘氨酸途徑固碳的關(guān)鍵步驟[14]，該酶系在上世紀(jì)60年代被發(fā)現(xiàn)并在隨后的30年中被深入研究[15-18]。甘氨酸裂解酶系主要包含4種蛋白，分別為H-蛋白、P-蛋白、T-蛋白和L-蛋白。其中，H-蛋白是一種穿梭蛋白[19]，它在共價連接硫辛酸配體后會分別連接其他3種催化蛋白的催化反應(yīng)中心以進(jìn)行循環(huán)反應(yīng)。H-蛋白穿梭在其他三種催化蛋白的活性中心的過程中會與其共價配體形成三種形態(tài)，即氧化態(tài)(Hox)、過渡態(tài)(Hint)和還原態(tài)(Hred)。在氧化態(tài)和還原態(tài)下，H蛋白的共價配體(硫辛酸或二氫硫辛酸)可在水溶液中自由移動[20]。而在過渡態(tài)下，H-蛋白的共價配體(硫辛酰胺)在水溶液中容易發(fā)生水解(氨甲基易被水解生成甲醛)，因此在過渡態(tài)下，H-蛋白會采取一種自保護(hù)機(jī)制將硫辛酰胺配體環(huán)抱在自身空腔內(nèi)部保護(hù)起來[19]。在H-蛋白與T-蛋白反應(yīng)時，T-蛋白會先與H-蛋白接觸以解開H-蛋白的自保護(hù)機(jī)制，此時硫辛酰胺配體被釋放至T-蛋白內(nèi)，從而進(jìn)行下一步催化反應(yīng)[21]。

值得注意的是，還原甘氨酸途徑中核心產(chǎn)物甘氨酸的合成反應(yīng)是可逆的，在甘氨酸裂解酶系的主導(dǎo)下，催化反應(yīng)更趨向于甘氨酸的裂解而非合成[14]。一些研究者試圖闡釋甘氨酸裂解酶系的催化機(jī)制，例如，Gueguen等[22]在1999年提出，H-蛋白中Glu-14對硫辛酰胺臂(硫辛酰胺與H-蛋白Lys-64側(cè)鏈共價形成的分子擺臂)在疏水空腔中的穩(wěn)定存在發(fā)揮著重要作用，將Glu-14突變?yōu)楸彼岷?，疏水空腔被破壞，此時硫辛酰胺臂無法在疏水空腔中穩(wěn)定存在，從而導(dǎo)致甘氨酸裂解酶系的催化效率大大降低。Okamura-Ikeda等[23]在2010年首次結(jié)晶出H-T蛋白復(fù)合物，并發(fā)現(xiàn)T-蛋白中的Arg-292對H-T蛋白復(fù)合物的自組裝發(fā)揮關(guān)鍵作用；將Arg-292突變?yōu)楸彼岷?，H-蛋白和T-蛋白雖然能夠正常表達(dá)，但不能正常組裝，從而導(dǎo)致甘氨酸的合成/裂解反應(yīng)幾乎不能進(jìn)行。然而到目前為止，甘氨酸裂解酶系的蛋白相互作用機(jī)制仍不清楚，且難以實現(xiàn)甘氨酸裂解酶系催化效率的調(diào)控，后者將有助于我們進(jìn)一步在分子層面上理解甘氨酸裂解/合成反應(yīng)，并對于通過蛋白質(zhì)工程提高C1合成效率具有重要的指導(dǎo)意義。

本課題組在前期工作中，采用分子動力學(xué)模擬手段對T-蛋白解開H-蛋白自保護(hù)的行為進(jìn)行了研究[24]。通過分析T-蛋白誘導(dǎo)H-蛋白解開自保護(hù)過程的動力學(xué)軌跡，我們鎖定了硫辛酰胺離開空腔過程中的3個潛在的關(guān)鍵氨基酸殘基：Ser-67、Asp-68和Tyr-70。由于Ser-67主導(dǎo)的這一階段在硫辛酰胺釋放的分子動力學(xué)軌跡中占據(jù)的時間最長，并且通過能量分析發(fā)現(xiàn)這一階段的能壘跨度最大，因此我們對Ser-67進(jìn)行了突變研究，發(fā)現(xiàn)Ser-67位點對甘氨酸裂解酶系的整體酶活有重要影響。然而，另外兩個氨基酸殘基Asp-68和Tyr-70位點如何影響甘氨酸裂解酶系的整體酶活目前仍不清楚。因此，本文進(jìn)一步對Asp-68和Tyr-70進(jìn)行突變，探究Asp-68和Tyr-70位點對甘氨酸裂解酶系整體酶活的影響，并嘗試從分子層面上闡釋酶活的變化機(jī)制。

1 實驗部分

1.1 實驗材料和儀器

1.1.1實驗材料

大腸桿菌(Escherichiacoli)來源的H-蛋白野生型、P-蛋白、T-蛋白和L-蛋白基因的美國國家生物技術(shù)信息中心(NCBI)序列號分別為NP_417380.1、P33195.3、P27248.3和P0A9P0.2，這4種基因的表達(dá)載體均為pET-28a，構(gòu)建出的重組質(zhì)粒由實驗室保存使用；E.coliBL21(DE3)及E.coliTOP10感受態(tài)購自上海唯地生物技術(shù)有限公司；定點突變試劑盒(Mut Express II Fast Mutagenesis Kit V2)購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)相關(guān)試劑、瓊脂糖凝膠電泳相關(guān)試劑購自南京金斯瑞生物科技有限公司；Luria-Bertani(LB)液體培養(yǎng)基、LB固體培養(yǎng)基相關(guān)試劑、氯化鈉、Tris-HCl和咪唑購自索萊寶生物科技有限公司；卡那霉素購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)、硫辛酸購自上海源葉生物科技有限公司。

1.1.2實驗儀器

聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(T100-186109型，BIO-RAD公司)；立式壓力蒸汽滅菌鍋(YXQ.SG41.280型，寧波久興公司)；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(LW1908型，Longyue公司)；多功能組合式搖床(HYG-C3型，蘇州培英實驗設(shè)備有限公司)；高速冷凍離心機(jī)(CR22G型，日本日立公司)；超聲細(xì)胞破碎儀(JY92-II型，寧波新芝公司)；KTA蛋白層析系統(tǒng)(美國GE Healthcare公司)；鎳柱(Ni-NTA Fast Flow column，5 mL，美國GE Healthcare公司)；凝膠成像儀(C30型，Azure Biosystems公司)；酶標(biāo)儀(Enspire型，PerkinElmer公司)；SDS-PAGE電泳儀(Mini-PROTEAN Tetra System型，BIO-RAD公司)；超凈工作臺(CHSD1500型，蘇州博萊爾凈化設(shè)備有限公司)；臺式離心機(jī)(V126716型，Eppendorf公司)；瓊脂糖凝膠電泳儀(Mini-Sub Cell GT型，BIO-RAD公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1質(zhì)粒構(gòu)建

H-蛋白Asp-68位突變體質(zhì)粒和Tyr-70位突變體質(zhì)粒的構(gòu)建參照定點突變試劑盒提供的方法進(jìn)行，具體涉及的引物如表1所示。引物的DNA熔解溫度(Tm)均為(60±1)℃。PCR反應(yīng)體系為：1 μL Phanta? Max Super-Fidelity DNA Polymerase、25 μL 2×Max Buffer、1 μL dNTP、2 μL上游引物、2 μL下游引物、1 μL模板質(zhì)粒、18 μL超純水。PCR擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸4 min，循環(huán)29次，72 ℃終延伸10 min，12 ℃保存。擴(kuò)增結(jié)束后，使用瓊脂糖凝膠電泳(120 V, 30 min, 常溫常壓)對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，所用瓊脂糖的質(zhì)量濃度為10 g/L。然后使用Dpn1消解PCR產(chǎn)物中的模板質(zhì)粒(37 ℃，1 h)。使用該Dpn1消解產(chǎn)物進(jìn)行同源重組(37 ℃，30 min)，完成質(zhì)粒環(huán)化過程。將重組產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至E.coliTOP10感受態(tài)中，經(jīng)復(fù)蘇后涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37 ℃靜置培養(yǎng)12 h，將平板菌落送至蘇州金唯智公司進(jìn)行測序鑒定，將鑒定成功的質(zhì)粒保存?zhèn)溆谩?/p>

表1 引物序列

1.2.2蛋白表達(dá)與純化

通過化學(xué)熱激法將H-蛋白野生型質(zhì)粒和各突變體質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞中，經(jīng)復(fù)蘇后將菌體涂布于含有50 μg/mL卡那霉素的LB平板上，于37 ℃培養(yǎng)12 h。隨后挑取平板菌落中的單克隆菌體至4 mL的LB培養(yǎng)基(含50 μg/mL卡那霉素)中，在37 ℃、220 r/min下振蕩培養(yǎng)。培養(yǎng)3～4 h后，取1 mL菌液接種至100 mL含有50 μg/mL卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，在37 ℃、220 r/min下培養(yǎng)，待菌液在600 nm處的吸光度達(dá)到0.7左右時(約3 h)，添加終濃度為0.2 mmol/L的IPTG溶液。同時，向培養(yǎng)基中加入150 μmol/L硫辛酸對表達(dá)的ecHapo蛋白進(jìn)行酯化，使其形成硫辛酸臂，然后于30 ℃進(jìn)行蛋白誘導(dǎo)表達(dá)12 h。誘導(dǎo)結(jié)束后，通過離心(7 459×g)收集菌體。此外，還對P-蛋白、T-蛋白和L-蛋白進(jìn)行了異源表達(dá)，誘導(dǎo)過程中無需加入硫辛酸，其他操作方法與H-蛋白一致。

蛋白純化均通過鎳柱親和層析法進(jìn)行。使用50 mmol/L的Tris·HCl(pH=7.5)溶液重懸菌體。

將重懸后的菌體進(jìn)行超聲破碎處理10 min(每運(yùn)行5 s停3 s)，然后將破碎液進(jìn)行低溫冷凍離心30 min(4 ℃，7 459×g)，得到的蛋白上清液用于下一步蛋白純化，后續(xù)操作均在KTA蛋白層析系統(tǒng)上進(jìn)行。將含有蛋白的上清液進(jìn)行過膜處理(膜孔徑0.2 μm)，使用Buffer A(500 mmol/L氯化鈉、50 mmol/L Tris-HCl、20 mmol/L咪唑，pH7.4)將蛋白樣品上樣至鎳柱中，然后使用5%的Buffer B(500 mmol/L氯化鈉、50 mmol/L Tris-HCl、500 mmol/L咪唑，pH7.4)洗脫雜蛋白，洗脫體積為10倍柱體積。最后采用線性洗脫方式(6%～100% Buffer B)洗脫目標(biāo)蛋白，洗脫體積為20倍柱體積。使用50 mmol/L的Tris-HCl溶液(pH=7.5)將純化后的目標(biāo)蛋白稀釋至咪唑濃度低于1 mmol/L。使用SDS-PAGE凝膠電泳對純化蛋白進(jìn)行分析(150 V, 60 min，常溫常壓)，所用聚丙烯酰胺的質(zhì)量濃度為100 g/L。使用凝膠成像儀觀察條帶位置并拍照。

1.2.3酶活測定

通過測定還原型輔酶Ⅰ(NADH)在340 nm下的吸光度變化來表征甘氨酸裂解酶系整體裂解方向的催化活性。酶活測定體系為：200 μL體系、1 mmol/L甘氨酸、1 mmol/L NAD+、1 mmol/L四氫葉酸、0.1 mmol/L磷酸吡哆醛、6 μmol/L P-蛋白、13 μmol/L T-蛋白、8 μmol/L L-蛋白、100 mmol/L Tris-HCl(pH=7.5)以及6 μmol/L H-蛋白野生型或突變型，甘氨酸作為整體反應(yīng)的啟動項最后加入。加入甘氨酸后立即將體系置于酶標(biāo)儀中測定NADH的吸光度，每間隔5 s測定一次。整體反應(yīng)溫度設(shè)定為37 ℃，以反應(yīng)5 min內(nèi)初始階段的線性反應(yīng)速率計算酶活。酶活的定義為：每分鐘生成1 μmoL NADH所用H-蛋白的量為一個酶活單位(U)。酶活測定均平行進(jìn)行3次，結(jié)果取平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

統(tǒng)計學(xué)檢驗由R version 3.5.3運(yùn)行獲得。通過方差分析(F檢驗)計算樣本中兩組數(shù)據(jù)之間的P值，P<0.05認(rèn)為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2.4突變體的結(jié)構(gòu)預(yù)測和可視化

H-蛋白68位突變體模型(H-D68R，H-D68G)和70位突變體模型(H-Y70R，H-Y70L)均由Alphafold2構(gòu)建(源代碼：https://github.com/deepmind/alphafold)[25]。每個突變體建模完成之后會產(chǎn)生ranked_{0,1,2,3,4}.pdb共5個模型結(jié)構(gòu)，且這5個模型結(jié)構(gòu)均已經(jīng)過能量優(yōu)化并按照模型置信度的大小排列。其中ranked_0.pdb的置信度最高，本研究均選用ranked_0.pdb作為最終建模結(jié)果，以便從分子層面上對酶活結(jié)果進(jìn)行分析和闡釋。本文中蛋白空腔體積均由在線服務(wù)器3Vee(http://3vee.molmovdb.org/)計算得出，所有蛋白質(zhì)的可視化均由PyMOL軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 H- 蛋白Asp- 68和Tyr- 70位帶正電突變結(jié)果

在H-蛋白Ser-67位點的研究中，我們將空腔內(nèi)關(guān)鍵氨基酸Ser-67突變?yōu)閭?cè)鏈帶正電的氨基酸后，甘氨酸裂解酶系的整體酶活相對野生型均有一定下降[24]。本研究將Asp-68和Tyr-70位點分別突變?yōu)榫彼?Arg)、賴氨酸(Lys)和組氨酸(His)，其中，Asp-68對應(yīng)的突變體分別記為H-D68R、H-D68K和H-D68H，Tyr-70對應(yīng)的突變體分別記為H-Y70R、H-Y70K和H-Y70H，考察突變體相對野生型的甘氨酸裂解酶系的整體酶活變化。

2.1.1蛋白表達(dá)和純化結(jié)果

圖1(a)和1(b)分別為68位帶正電殘基突變體和70位帶正電殘基突變體的SDS-PAGE結(jié)果。通過異源表達(dá)及蛋白純化，野生型H-蛋白(H-wt)、Asp-68位帶正電殘基突變體和Tyr-70位帶正電殘基突變體在SDS-PAGE上均呈現(xiàn)均一條帶，表明成功得到H-蛋白及其突變體的純化蛋白，其純度滿足酶活測定的要求。但是，H-蛋白突變體和野生型H-蛋白的表觀分子量(約25 kDa)和理論分子量(約14 kDa)并不一致，這可能是由于H-蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，在電泳之前的沸水滅活處理并不能使蛋白的三維結(jié)構(gòu)被完全破壞，導(dǎo)致H-蛋白在電泳圖中的條帶位置并不完全由理論分子量決定，從而呈現(xiàn)出條帶位置的差異[26]。此外，我們還對甘氨酸裂解酶系中的P-蛋白(約104 kDa)、T-蛋白(約41 kDa)和L-蛋白(約51 kDa)進(jìn)行了異源表達(dá)及純化實驗，其凝膠電泳結(jié)果如圖1(c)所示，結(jié)果表明成功得到純化蛋白，其純度滿足酶活測定要求，得到的純化蛋白用于后續(xù)甘氨酸裂解酶系的整體酶活測定。

圖1 野生型H-蛋白、H蛋白68位帶正電殘基突變體、H蛋白70位帶正電殘基突變體、P-蛋白、T-蛋白及L-蛋白的SDS-PAGE結(jié)果

2.1.2甘氨酸裂解酶系酶活測定結(jié)果

分別測定野生型H-蛋白以及Asp-68和Tyr-70帶正電殘基突變體的酶活，結(jié)果如圖2所示。圖2(a)中，Asp-68突變體的甘氨酸裂解酶系整體酶活相對野生型均有不同程度的降低，H-D68K、H-D68H和H-D68R的酶活分別降低了44.6%、48.9%和90.2%，表明H-蛋白的Asp-68位點對于甘氨酸裂解酶系的整體酶活具有重要影響。上述Asp-68位帶正電殘基突變體的酶活均降低，這與Ser-67位帶正電殘基突變體的酶活變化趨勢類似(H-S67R、H-S67K和H-S67H的酶活相對野生型H-蛋白分別降低了9.3%、6.5%和3.1%)[24]。Tyr-70位點在甘氨酸裂解酶系的整體酶活中也發(fā)揮了重要作用(圖2(b))，與Ser-67位點和Asp-68位點不同的是，當(dāng)Tyr-70位點突變?yōu)閹д姷陌被釙r，突變體的甘氨酸裂解酶系整體酶活相對野生型均沒有降低，其中H-Y70R突變體的整體酶活相較于野生型提高了75.6%。

*P<0.05，** P<0.01，n.s.表示P>0.05，下同。

2.2 H- 蛋白Asp- 68和Tyr- 70位非極性突變結(jié)果

在前期研究中，我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)H-蛋白空腔內(nèi)的關(guān)鍵氨基酸殘基Ser-67位點突變?yōu)榉菢O性側(cè)鏈氨基酸殘基后，大部分突變體的酶活相較于野生型呈現(xiàn)提高的趨勢[24]。在本研究中我們繼續(xù)開展Asp-68和Tyr-70的非極性突變研究，將Asp-68和Tyr-70分別突變?yōu)楦拾彼?Gly)、纈氨酸(Val)、甲硫氨酸(Met)和亮氨酸(Leu)這4種非極性氨基酸，其中，Asp-68對應(yīng)的突變體分別記為H-D68G、H-D68V、H-D68M和H-D68L，Tyr-70對應(yīng)的突變體分別記為H-Y70G、H-Y70V、H-Y70M和H-Y70L，分析突變前后甘氨酸裂解酶系的整體酶活變化。

2.2.1蛋白表達(dá)與純化結(jié)果

圖3(a)和3(b)分別為68位非極性殘基突變體和70位非極性殘基突變體的SDS-PAGE結(jié)果。通過異源表達(dá)及蛋白純化，野生型H-蛋白、Asp-68位非極性殘基突變體和Tyr-70位非極性殘基突變體均呈現(xiàn)均一條帶，表明蛋白表達(dá)及純化成功，其純度滿足酶活測定要求。圖3中H蛋白突變體和野生型H-蛋白的條帶位置差異主要是由于H-蛋白具有良好的熱穩(wěn)定性，在電泳之前的沸水滅活處理不能使蛋白三維結(jié)構(gòu)被完全破壞[26]。

圖3 野生型H-蛋白、H蛋白68位非極性殘基突變體和H蛋白70位非極性殘基突變體的SDS-PAGE結(jié)果

2.2.2甘氨酸裂解酶系酶活測定結(jié)果

分別測定野生型H-蛋白、Asp-68位非極性殘基突變體和Tyr-70位非極性殘基突變體的甘氨酸酶系整體酶活，結(jié)果如圖4所示。圖4(a)中，除H-D68L外，Asp-68位非極性殘基突變體的甘氨酸裂解酶系整體酶活相對于野生型H-蛋白均沒有下降，H-D68G突變體的整體酶活相對野生型H-蛋白提高了53.6%。圖4(b)中，Tyr-70位點的4個非極性突變體的整體酶活相較于野生型均沒有下降，H-Y70V和H-Y70L突變體的酶活相較于野生型分別提高了87%和146%。以上結(jié)果表明，將氨甲基掉落過程的潛在關(guān)鍵極性氨基酸突變?yōu)榉菢O性氨基酸后，甘氨酸酶系的整體酶活變化總體上傾向于維持或提升，僅H-D68L突變體對整體酶活不利。

2.3 酶活變化機(jī)制分析

為了進(jìn)一步在分子層面上理解正電突變和非極性突變對酶活的影響，我們選擇酶活變化比較明顯的H-蛋白突變體：H-D68R、H-D68G和H-Y70R、H-Y70L作為研究對象，建立突變體蛋白模型并分析突變前后硫辛酰胺與H-蛋白空腔內(nèi)的氨基酸相互作用的變化，結(jié)果如圖5所示。野生型H-蛋白的Asp-68殘基會與硫辛酰胺中氨甲基的氮原子形成氫鍵相互作用，當(dāng)D68殘基突變?yōu)镽68后，其側(cè)鏈氨基酸殘基帶正電，與同樣帶正電的氨甲基產(chǎn)生靜電斥力。由于突變后的R68殘基空間位置處于氨甲基基團(tuán)的下方，此方向的靜電斥力依然使硫辛酰胺難以掉落，且R68殘基側(cè)鏈更長，靜電斥力存在的時間較長。在這種情況下，硫辛酰胺在H-蛋白空腔內(nèi)的運(yùn)動會受到長時間的阻礙，硫辛酰胺的釋放速度會進(jìn)一步減慢，導(dǎo)致甘氨酸裂解酶系的整體酶活降低。當(dāng)D68突變?yōu)镚68后，野生型H-蛋白中原有的氫鍵相互作用消失，這一過程中硫辛酰胺的釋放不受68位氨基酸的影響，而且甘氨酸側(cè)鏈僅有一個氫原子，占據(jù)的空間更小，H-蛋白的空腔體積由野生型的490 ?3擴(kuò)大至560 ?3，有助于硫辛酰胺的釋放，使得甘氨酸裂解酶系的整體酶活上升。Tyr-70位點位于H-蛋白空腔的邊緣位置，在硫辛酰胺掉落過程中會與之形成氫鍵，從而影響硫辛酰胺離開疏水空腔。當(dāng)Y70突變?yōu)镽70后，相互作用由氫鍵變?yōu)殪o電斥力。與Asp-68位點不同的是，70位氨基酸殘基在空間位置上處于氨甲基基團(tuán)的上方，此方向的靜電斥力會促進(jìn)硫辛酰胺的釋放，引起甘氨酸裂解酶系的整體酶活上升。當(dāng)Y70突變?yōu)長70時，非極性氨基酸Leu與硫辛酰胺的氨甲基無法形成相互作用，原有的氫鍵相互作用消失，有利于硫辛酰胺的釋放。Leu側(cè)鏈在空間位置上朝向空腔外部，占據(jù)的空腔體積小，空腔體積由野生型的490 ?3擴(kuò)大至558 ?3，使得硫辛酰胺在空腔內(nèi)的活動范圍變大，進(jìn)一步促進(jìn)硫辛酰胺的釋放，使甘氨酸裂解酶系的整體酶活提高。

3 結(jié)論

本文對T-蛋白誘導(dǎo)H-蛋白釋放硫辛酰胺過程的潛在關(guān)鍵氨基酸殘基Asp-68和Tyr-70進(jìn)行了系統(tǒng)突變，探究Asp-68和Tyr-70位點對甘氨酸裂解酶系整體酶活的影響。結(jié)果表明，當(dāng)Asp-68突變?yōu)閹д姷陌被岷螅蛔凅w的整體酶活相對野生型呈現(xiàn)下降趨勢，其中H-D68R突變體的酶活下降了90.2%。當(dāng)Asp-68突變?yōu)榉菢O性氨基酸后，突變體的整體酶活傾向于維持或提升，其中H-D68G突變體的酶活相較野生型H-蛋白提高了53.6%。Tyr-70突變?yōu)閹д姲被峄蚍菢O性氨基酸后，可維持或提升甘氨酸裂解酶系的整體酶活，其中H-Y70L突變體的酶活相較于野生型提高了146%。突變前后硫辛酰胺與H-蛋白空腔內(nèi)氨基酸的相互作用分析結(jié)果表明，甘氨酸裂解酶系整體酶活的變化是H-蛋白的68和70位殘基的突變阻礙或促進(jìn)硫辛酰胺釋放所導(dǎo)致的。

本研究通過對H-蛋白進(jìn)行定向突變，實現(xiàn)對甘氨酸裂解酶系整體酶活的調(diào)控，對于定量調(diào)控甘氨酸裂解酶系的催化效率和深入理解硫辛酰胺的釋放過程具有重要作用。同時，為類似的多酶體系復(fù)合物(如丙酮酸脫氫酶系和酮戊二酸脫氫酶系)的深入研究和定向改造提供思路。在后續(xù)的研究中，我們將對硫辛酰胺進(jìn)入H-蛋白空腔過程的機(jī)制和相互作用的方式進(jìn)行研究，在硫辛酰胺的進(jìn)入與釋放兩方面綜合實現(xiàn)對甘氨酸裂解酶系酶活的精準(zhǔn)調(diào)控，為甘氨酸合成的定向改造以及提高C1合成效率提供理論指導(dǎo)。