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    熒光染色法在淺部皮膚真菌病診斷中的應(yīng)用

    2022-01-07 12:29:54王喜英穆雅琴張海燕白光梅
    關(guān)鍵詞:淺部染色法菌絲

    王喜英,孟 健,王 健,穆雅琴,張海燕,白光梅,薛 敏

    (山西大同大學(xué)醫(yī)學(xué)院,山西大同 037009)

    淺部皮膚真菌病是由真菌侵犯皮膚表皮、毛發(fā)和指(趾)甲引起的傳染性疾病,包括頭癬、體癬、股癬、手足癬、甲癬、花斑癬等。臨床用于真菌檢測(cè)的方法包括直接鏡檢、分離培養(yǎng)和免疫學(xué)檢查等方法[1]。其中直接鏡檢法是淺部皮膚真菌形態(tài)學(xué)檢查的基本方法,常規(guī)采用KOH 濕片法和熒光染色法觀察標(biāo)本中有無(wú)真菌有形成分,這種方法操作簡(jiǎn)單,結(jié)果快速,對(duì)臨床有較好的指導(dǎo)意義[2]。

    KOH 濕片法,一般采用1.78 mol/L KOH 溶液制片,是臨床上用于真菌感染快速診斷最主要的方法。KOH 溶液能夠溶解人體細(xì)胞,但對(duì)真菌無(wú)染色強(qiáng)化作用,因此需要操作者根據(jù)經(jīng)驗(yàn)判讀結(jié)果。因其敏感性和特異性不高,對(duì)臨床檢驗(yàn)技術(shù)人員要求較高,容易出現(xiàn)漏診或誤診的情況。熒光染色法是利用細(xì)胞熒光素可以與真菌細(xì)胞壁的1,3-β-D 葡聚糖結(jié)合的原理,進(jìn)而通過(guò)熒光標(biāo)記進(jìn)行真菌檢測(cè)[3]。特殊熒光素標(biāo)聯(lián)的重組幾丁質(zhì)酶與真菌細(xì)胞壁上的幾丁質(zhì)以高親和力的方式結(jié)合從而產(chǎn)生熒光標(biāo)記,在熒光顯微鏡下可以清楚地觀察到真菌形態(tài)[4]。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)使用萊芙特敏真菌熒光染色液對(duì)臨床疑似真菌感染的標(biāo)本進(jìn)行檢測(cè),并與KOH濕片法相比較,探討熒光染色法在淺部真菌感染中的優(yōu)勢(shì)。

    1 資料與方法

    1.1 標(biāo)本來(lái)源

    標(biāo)本選自于2017 年7 月-2019 年7 月大同市第三人民醫(yī)院皮膚科門(mén)診就診的疑似淺部真菌感染的患者,共553 例。其中手足部位157 例,指(趾)甲部位200例,體股部位146例,頭面部50例。同時(shí)采用2種方法檢測(cè)。

    1.2 材料

    10% KOH 溶液(實(shí)驗(yàn)室自配),萊芙特敏真菌熒光染色液(江蘇萊芙時(shí)代生物科技有限公司)。

    1.3 方法

    1.3.1 取材

    75%酒精消毒患處,每例取2 份標(biāo)本,分別用于KOH 濕片法和熒光染色法。皮損處取皮損邊緣皮屑;指(趾)甲取靠近病甲甲床的甲屑;頭癬取病發(fā)及其周?chē)ば肌?/p>

    1.3.2 KOH濕片法

    采集各種標(biāo)本置于載玻片中央,滴加10% KOH溶液一滴;蓋上蓋玻片,在火焰上方輕微加溫,使標(biāo)本溶解后,輕壓蓋玻片吸出多余液體,置于普通光學(xué)顯微鏡下觀察。

    1.3.3 熒光染色法

    將適量標(biāo)本置于載玻片上,滴加熒光色液一滴,蓋上蓋玻片,輕壓吸出多余液體,置于熒光生物顯微鏡(Olympns L3201)下觀察,高倍鏡下采集圖像。

    1.3.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

    采用SPSS24 軟件進(jìn)行χ2檢測(cè);P<0.05 為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    2 結(jié)果

    對(duì)553 例患者的標(biāo)本分別用KOH 濕片法和熒光染色法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示,2 種方法均可觀察到長(zhǎng)短不等的菌絲,或筆直或纏繞或折疊或呈串珠狀排列。二者比較,KOH 濕片法中背景雜亂,真菌與背景的角質(zhì)細(xì)胞反差比較小,鏡下成像清晰度不高,不易觀察(圖1A);熒光染色法中真菌被熒光標(biāo)記,與背景相差大,可在顯微鏡下觀察到清晰的藍(lán)色菌絲、橫隔結(jié)構(gòu)以及孢子的出芽狀態(tài)(圖1B)。

    圖1 KOH濕片法(A)和熒光染色法(B)的真菌鏡檢結(jié)果

    統(tǒng)計(jì)結(jié)果(表1)表明:553 例臨床可疑標(biāo)本中,KOH 濕片法共檢出362 例(66.5%)陽(yáng)性標(biāo)本,其中手足部114 例(72.6%),體股部106 例(86.3%),頭面部30 例(60.0%),甲部112 例(56.0%);熒光染色法共檢出472 例(85.4%)陽(yáng)性標(biāo)本,其中手足部140 例(89.2%),體股部140例(95.9%),頭面部38 例(76.0%),甲部154 例(77.0%);在2 種方法的比較中,熒光染色法的總陽(yáng)性率(85.4%)明顯高于KOH 濕片法(65.5%),χ2=0.0001,P<0.05。不同部位的陽(yáng)性檢出率,熒光染色法均高于KOH 濕片法。其中手足部、體股部、甲部?jī)烧弑容^,均P<0.05;頭面部?jī)烧弑容^,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

    表1 兩種方法在不同部位標(biāo)本真菌鏡檢結(jié)果比較

    3 討論

    KOH 濕片法是最早使用的一種直接鏡檢法,該法操作簡(jiǎn)單,技術(shù)要求低,無(wú)需特殊儀器。但是由于標(biāo)本中雜質(zhì)較多,背景雜亂,導(dǎo)致陽(yáng)性檢出率較低,主要根據(jù)真菌形態(tài),技術(shù)員的經(jīng)驗(yàn)進(jìn)行判定,結(jié)果受個(gè)人主觀因素影響較大。如:易把細(xì)胞壁、纖維誤認(rèn)為菌絲,把氣泡、油滴誤認(rèn)為孢子;易漏檢存在的菌絲或孢子。

    熒光染色體法使用特殊的熒光染料與真菌細(xì)胞壁的幾丁質(zhì)和纖維素特異性結(jié)合,在熒光顯微鏡特定的激光光波段下(340~ 380 nm)菌絲和孢子發(fā)出明亮的藍(lán)綠色熒光,與黑暗背景形成強(qiáng)烈對(duì)比,易于觀察。熒光素與幾丁質(zhì)親和力高,反應(yīng)僅需數(shù)十秒即可完成,而且熒光染色液中含有9.5%的KOH,易于溶解角質(zhì),使組織透明,提高臨床檢查的靈敏度和效率[5]。

    甲癬是實(shí)驗(yàn)室真菌鏡檢的難點(diǎn),因?yàn)槠錁?biāo)本的背景較厚,并且真菌與背景反差小,結(jié)構(gòu)不易觀察和分辨,容易出現(xiàn)漏診。而熒光染色法,背景及雜質(zhì)為黑色,易于觀察,大大提高了甲癬的檢出率,值得推廣。本實(shí)驗(yàn)中頭面部標(biāo)本的兩種方法比較,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,分析原因可能是例數(shù)較少,標(biāo)本背景較干凈,菌絲和孢子較多。

    通過(guò)KOH 濕片法與熒光染色法的對(duì)比研究表明,對(duì)于真菌直接鏡檢,熒光染色法是一種快速、高效、準(zhǔn)確診斷淺部真菌感染的方法,這一結(jié)果和文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果是相一致的[2-7]。

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