外泌體非編碼RNA調(diào)控骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的研究進(jìn)展

谷營(yíng)營(yíng) 藺一凡 鄭天霞 董偉

華北理工大學(xué)口腔醫(yī)學(xué)院，河北 唐山 063210

骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞( bone marrow-derived mesenchymal stem cells，BMSCs)起源于中胚層細(xì)胞，增殖能力強(qiáng)，分化譜系多[1]，可在不同誘導(dǎo)條件下分化為成骨細(xì)胞、軟骨細(xì)胞、肌細(xì)胞、基質(zhì)細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞等[2]，具有自我更新、成骨分化及免疫調(diào)節(jié)等功能[3]。骨再生是一個(gè)復(fù)雜而高度調(diào)控的過(guò)程，有膜內(nèi)骨化和軟骨內(nèi)骨化兩種不同的方式，在膜內(nèi)骨化過(guò)程中，由BMSCs成骨分化而來(lái)的成骨細(xì)胞形成骨[4]，故可以通過(guò)調(diào)控BMSCs骨向分化促進(jìn)骨再生[5]。BMSCs的成骨分化功能在骨組織工程中極具應(yīng)用前景[6]，研究調(diào)控其骨向分化的分子機(jī)制對(duì)骨科領(lǐng)域具有重大意義。

外泌體(exosomes)是一種由細(xì)胞內(nèi)多胞體與胞膜融合后再釋放到細(xì)胞外環(huán)境的納米級(jí)膜性脂質(zhì)囊泡，富含核酸、蛋白質(zhì)、膽固醇等多種生物活性物質(zhì)[7]。研究[8]發(fā)現(xiàn)，外泌體源性非編碼RNA主要包括微小RNA(microRNA，miRNA)、長(zhǎng)鏈非編碼RNA(long non-coding RNA，lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA，circRNA)，可以通過(guò)多種作用機(jī)制調(diào)控BMSCs成骨分化。外泌體通過(guò)旁分泌途徑表達(dá)生物學(xué)效應(yīng)[9]，運(yùn)輸生物活性物質(zhì)調(diào)控細(xì)胞間通訊[10]，無(wú)信息傳遞屏障等特殊的生物學(xué)特性，在介導(dǎo)非編碼RNA調(diào)控BMSCs成骨分化過(guò)程中極大的提高了信息傳遞效率[11]，使其在骨質(zhì)疏松癥等骨代謝類疾病診斷及治療方面更具臨床優(yōu)勢(shì)，本文就此研究進(jìn)展做一綜述。

1 外泌體miRNA對(duì)BMSCs成骨分化作用機(jī)制

MiRNA是一類長(zhǎng)度大約18～24個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，通過(guò)與目標(biāo)RNA結(jié)合，參與調(diào)控翻譯后的基因沉默，抑制相關(guān)基因表達(dá)[12]。早在2014年，Xu等[13]對(duì)BMSCs來(lái)源的外泌體miRNAs在調(diào)控BMSCs成骨分化過(guò)程中的表達(dá)譜分析中發(fā)現(xiàn)，9種miRNAs(miR-203、miR-218、miR-219、let-7a、miR-148a、miR-135b、miR-199b、miR-302b和miR-299-5p)被上調(diào)促進(jìn)成骨分化；5種miRNAs(miR-155、miR-221、miR-181a、miR-320c和miR-885-5p)被下調(diào)，抑制BMSCs成骨分化。

研究表明，外泌體miRNA可以通過(guò)不同調(diào)控途徑促進(jìn)BMSCs成骨分化(圖1a)。Chen等[14]發(fā)現(xiàn)，小鼠受體BMSCs能夠從間充質(zhì)干細(xì)胞移植(mesenchymal stem cells transplantation，MSCT)供體中攝取其包含的外泌體及miR-151-5p，通過(guò)過(guò)表達(dá)miR-151-5p抑制白細(xì)胞介素-4(IL4)/IL4Rα表達(dá)，下調(diào)磷酸化mTOR(phosphorylated mTOR，p-mTOR)水平及其通路的級(jí)聯(lián)反應(yīng)，促進(jìn)成骨基因Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子2(Runt-related transcription factor 2，Runx 2)、堿性磷酸酶(alkaline Phosphatase，ALP)及骨鈣素(osteocalcin，OCN)表達(dá)上調(diào)，促進(jìn)成骨分化。Wang等[15]研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)自于間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells，MSCs)分泌的外泌體源性miR-21在BMSCs成骨分化過(guò)程中表達(dá)上調(diào)，通過(guò)激活磷脂酰肌醇-3-羥激酶(phosphatidylinositol-3-hydroxykinase，PI3K),磷酸化Akt(phosphorylated Akt，p-AKT)及糖原合成酶激酶-3β(Glycogen synthase kinase-3β，GSK-3β)通路及靶向結(jié)合成骨分化抑制劑Spry1和Sox2發(fā)揮作用，上調(diào)Runx2表達(dá)促進(jìn)BMSCs成骨分化。

外泌體miRNA還可以抑制BMSCs骨向分化(圖1b)。來(lái)自MSCs分泌的外泌體miR-31通過(guò)下調(diào)Runx 2的下游成骨轉(zhuǎn)錄因子(osterix，OSX)和SATB2抑制BMSCs成骨分化[15]。此外，血紅素加氧酶1(Hmox-1)可以促進(jìn)BMSCs的生長(zhǎng)和成骨分化[16]，而Hmox-1可以作為miR-183-5p的結(jié)合靶點(diǎn)[17]。以此為基礎(chǔ)Davis等[18]發(fā)現(xiàn)，用來(lái)自骨髓間質(zhì)液(bone marrow stromal fluid，BMSF)的外泌體miR-183-5p 模擬物轉(zhuǎn)染BMSCs后會(huì)降低miR-183-5p靶向調(diào)控Hmox-1的蛋白水平，抑制BMSCs成骨分化。Liu等[19]發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)外源性miR-155會(huì)導(dǎo)致BMSCs成骨分化過(guò)程中ALP降低，下調(diào)成骨相關(guān)骨橋蛋白(osteopontin，OPN)、OCN及OSX的表達(dá)，抑制BMSCs成骨分化；該研究還檢測(cè)到Runx 2和骨形態(tài)發(fā)生蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor 2，BMPR2)是miR-155的兩個(gè)直接靶基因，上調(diào)Runx 2和BMPR 2表達(dá)也可以抑制骨向分化。Liu等的實(shí)驗(yàn)只是提示miR-155來(lái)源于外泌體的可能性較大，但并未以實(shí)驗(yàn)確定，故后續(xù)研究可以以此為基礎(chǔ)完善此作用機(jī)制。

還有研究表明，在外泌體源性miRNA調(diào)控BMSCs成骨分化過(guò)程中，改變miRNA表達(dá)水平后，其對(duì)BMSCs成骨分化的作用也隨之改變(圖1c)。Chen等[20]研究報(bào)道，當(dāng)人脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(human adipose-derived stem cells，HADSCS)來(lái)源的外泌體miR-375表達(dá)降低后，其3′-非翻譯區(qū)(3′-UTR)會(huì)抑制胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白3(insulin-like growth factor binding protein 3，IGFBP3)表達(dá)，進(jìn)而抑制BMSCs成骨分化；過(guò)表達(dá)miR-375后則促進(jìn)BMSCs成骨分化。Qin等[21]發(fā)現(xiàn)，BMSCs來(lái)源的外泌體刺激BMSCs成骨分化，可能的調(diào)控機(jī)制是外泌體中高度富集的3種miRNA(miR-196a，miR-27a和miR-206)參與調(diào)控成骨分化，且其表達(dá)量高低會(huì)影響對(duì)BMSCs成骨分化的促進(jìn)或抑制作用。

圖1 外泌體miRNA對(duì)BMSCs成骨分化作用機(jī)制示意圖Fig.1 Mechanism of exosomal miRNA on BMSCs osteogenic differentiation注：a: miRNA通過(guò)不同途徑促進(jìn)BMSCs成骨分化; b: miRNA通過(guò)不同途徑抑制BMSCs骨向分化; c: 改變miRNA表達(dá)水平后，其對(duì)BMSCs成骨分化的作用隨之改變。

綜上可知，外泌體miRNA對(duì)BMSCs的成骨分化作用機(jī)制既有調(diào)控成骨分化相關(guān)基因表達(dá)，也有參與成骨分化信號(hào)通路調(diào)節(jié)，還可調(diào)控miRNA下游靶基因從而調(diào)控BMSCs成骨分化。然而，目前對(duì)外泌體源性miRNA的研究雖多，但關(guān)于其對(duì)BMSCs成骨分化的調(diào)控機(jī)制、作用時(shí)相應(yīng)下游靶基因、表達(dá)時(shí)序性以及全身相關(guān)性疾病等問(wèn)題的認(rèn)識(shí)還是很局限，仍需進(jìn)一步研究，以為臨床診斷和治療提供更為精確的靶點(diǎn)與方向。

2 外泌體lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化作用機(jī)制

LncRNA是長(zhǎng)度大于200個(gè)核苷酸的長(zhǎng)鏈非編碼RNA的一員[21]，比miRNA和circRNA序列更長(zhǎng)，空間結(jié)構(gòu)更復(fù)雜，穩(wěn)定性更差且更易降解[22]，有研究[23]提示，在病理情況下lncRNA在外泌體中表達(dá)量比在細(xì)胞中表達(dá)量高，且可規(guī)避其被內(nèi)源性RNA酶降解的風(fēng)險(xiǎn)，故經(jīng)由外泌體進(jìn)行物質(zhì)交換和信息傳遞可提高lncRNA運(yùn)輸時(shí)的穩(wěn)定性[24]，深入分析外泌體源性lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化的作用機(jī)制極具研究?jī)r(jià)值和臨床實(shí)用性。

研究發(fā)現(xiàn)，lncRNA可以促進(jìn)BMSCs成骨分化。Zhang等[25]通過(guò)基因芯片檢測(cè)技術(shù)和生物信息學(xué)分析篩選出了在BMSCs成骨分化過(guò)程中相關(guān)的1 048條lncRNA，深入研究后發(fā)現(xiàn)lncRNA XR-11150通過(guò)上調(diào)Runx 2表達(dá)促進(jìn)BMSCs成骨分化。還有研究報(bào)道[26]，小干擾RNA(siRNA)轉(zhuǎn)染lncRNA-DANCR后降低DANCR表達(dá)，促進(jìn)BMSCs增殖及成骨分化，而過(guò)表達(dá)DANCR時(shí)，激活p38絲裂原活化蛋白激酶(p38 MAPK)通路，抑制BMSCs增殖和成骨分化(圖2a)。目前的研究只提示了經(jīng)由外泌體介導(dǎo)lncRNA促成骨分化效率更高，穩(wěn)定性更好，但缺乏精確的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)證明lncRNA來(lái)源于外泌體，有待繼續(xù)探索，以找尋更高效便捷的作用途徑。

外泌體源性lncRNA也可以抑制BMSCs成骨分化。Li等[27]發(fā)現(xiàn)，骨髓瘤(multiple myeloma，MM)細(xì)胞來(lái)源的外泌體含有豐富的lncRNA Runx2-AS1，通過(guò)在重疊區(qū)域與Runx 2 premRNA形成RNA雙鏈，降低剪接效率抑制BMSCs中Runx 2的表達(dá)，從而降低BMSCs的成骨分化潛能，且研究結(jié)果提示外泌體源性lncRNA Runx 2-AS1可能成為MM病變的潛在治療靶點(diǎn)，更具研究意義(圖2b)。Wang等[28]用微陣列技術(shù)確定腫瘤源性外泌體處理的BMSCs中l(wèi)ncRNA的全基因組表達(dá)模式后發(fā)現(xiàn)，腫瘤源性外泌體可通過(guò)差異表達(dá)lncRNA降低BMSCs內(nèi)lncRNA和mRNA的表達(dá)水平，進(jìn)而抑制BMSCs成骨分化，但其具體分子作用機(jī)制并未研究，有待深入探索。

盡管目前l(fā)ncRNA已經(jīng)成為研究熱點(diǎn)，但關(guān)于外泌體源性lncRNA對(duì)BMSCs成骨分化作用的研究仍存在許多未知，有待深入研究，發(fā)現(xiàn)更多具有調(diào)控成骨分化作用的lncRNA以及更為精準(zhǔn)的調(diào)控通路，為骨再生機(jī)制提供更多的可能性。

3 外泌體circRNA對(duì)BMSCs成骨分化作用機(jī)制

CircRNA是一類含有共價(jià)閉合環(huán)狀結(jié)構(gòu)的具有高穩(wěn)定性、高保守性且被證明在外泌體中含量豐富的內(nèi)源性非編碼RNA[29]。外泌體源性circRNA已經(jīng)開始在癌癥研究的新領(lǐng)域中發(fā)揮功能性作用，參與胃癌和腫瘤的發(fā)生，發(fā)展及轉(zhuǎn)移[30-31]，作為腫瘤性疾病的診斷標(biāo)志物發(fā)揮了極大的作用[32]，但對(duì)BMSCs成骨分化作用機(jī)制的研究鮮有報(bào)道。

近期研究發(fā)現(xiàn)，外泌體源性circRNA可以作為miRNA分子海綿參與信號(hào)通路，調(diào)控BMSCs成骨分化。Zhang等[33]對(duì)BMSCs成骨分化過(guò)程中circRNAs的表達(dá)譜進(jìn)行了微陣列分析，發(fā)現(xiàn)共有3 938個(gè)circRNAs上調(diào)，1 505個(gè)下調(diào)，并發(fā)現(xiàn)此過(guò)程中表達(dá)的circRNAs可以從基因組的所有區(qū)域合成，但主要來(lái)源于外泌體，經(jīng)研究驗(yàn)證部分外泌體來(lái)源的circRNA與miRNA間呈負(fù)相關(guān)且具有miRNA反應(yīng)元件，其中circRNA IGSF11沉默后提高了miR-199b-5p的表達(dá)水平，激活GSK-3β通路，促進(jìn)BMSCs成骨分化(圖2c)。

另外Yang等[34]在骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis，OP)患者血清中發(fā)現(xiàn)，其miR-217水平較未患OP者高，miR-217通過(guò)靶向結(jié)合Runx 2的3′UTR位點(diǎn)降解Runx 2，抑制成骨分化；血清外泌體中circRNA VANGL1(circ-VANGL1)通過(guò)結(jié)合miR-217阻斷其降低Runx 2表達(dá)的抑制成骨作用，且過(guò)表達(dá)circ-VANGL1后，ALP、Runx 2、OPN和OCN等表達(dá)均上調(diào)，促進(jìn)BMSCs成骨分化。但Yang等的實(shí)驗(yàn)并未涉及circ-VANGL1是否能夠單獨(dú)作用以及circ-VANGL1能否與其他miRNA或mRNA位點(diǎn)結(jié)合，有待進(jìn)一步研究，以期為促進(jìn)骨再生提供新的治療途徑與方法(圖2 d)。

圖2 外泌體lncRNA和circRNA對(duì)BMSCs成骨分化作用機(jī)制示意圖Fig.2 The mechanism of exosomes lncRNA and circRNA on BMSCs osteogenic differentiation注：a: lncRNA-DANCR通過(guò)不同途徑抑制BMSCs成骨分化; b: lncRNA抑制BMSCs成骨分化; c: circRNA抑制BMSCs成骨分化；d: circRNA VANGL1通過(guò)不同途徑促進(jìn)BMSCs成骨分化。

綜上所述，雖然circRNA在細(xì)胞生命活動(dòng)、全身疾病的發(fā)生發(fā)展及作為疾病診斷早期標(biāo)志物方面都顯露了巨大的潛力[35-36]，但circRNAs的豐度較低，很難在外泌體中精確檢測(cè)到，具有很大的挑戰(zhàn)性，且其在外泌體中富集的機(jī)制可能是胞質(zhì)中本就富含circRNAs，被動(dòng)包含在外泌體中，也可能是circRNAs從細(xì)胞質(zhì)主動(dòng)轉(zhuǎn)移，目前尚未有明確定論，故深入探究circRNAs是如何富集到外泌體中的及其調(diào)控BMSCs成骨分化的具體作用機(jī)制，有助于開創(chuàng)新的研究思路，并為骨科疾病提供全新的治療體系。

4 小結(jié)與展望

已有多項(xiàng)研究報(bào)道外泌體對(duì)BMSCs成骨分化具有調(diào)控作用，如人臍帶來(lái)源MSCs分泌的外泌體通過(guò)上調(diào)OCN、ALP、BMP 2、OSX、Runx 2等成骨相關(guān)基因，促進(jìn)BMSCs成骨分化[37]。BMSCs來(lái)源外泌體通過(guò)促進(jìn)BMP 9、Runx 2、OSX等表達(dá)促進(jìn)成骨分化，或通過(guò)促血管再生、鈣化沉積、黏附Ⅰ型膠原蛋白及纖維連接蛋白等細(xì)胞外基質(zhì)附著于骨表面，間接誘導(dǎo)BMSCs骨向分化[38]。但關(guān)于外泌體內(nèi)容物非編碼RNA對(duì)BMSCs成骨分化的研究仍有限，目前已發(fā)現(xiàn)的研究機(jī)制主要集中在調(diào)控成骨分化相關(guān)基因表達(dá)、激活或抑制成骨分化相關(guān)通路、影響成骨上下游靶基因表達(dá)水平以及參與成骨分化相關(guān)蛋白表達(dá)等，多數(shù)研究是miRNA調(diào)控BMSCs成骨分化的作用，關(guān)于lncRNA和circRNA的相關(guān)研究較少，是未來(lái)的熱點(diǎn)研究方向。此外，實(shí)現(xiàn)更加高效提純外泌體非編碼RNA成分并保證其生物學(xué)活性、發(fā)現(xiàn)更多能夠調(diào)控BMSCs成骨分化的途徑以及探索更多調(diào)控BMSCs成骨分化的作用機(jī)制等都有待研究。故深入研究外泌體非編碼RNA對(duì)BMSCs發(fā)揮調(diào)控作用的成分并明確其調(diào)控BMSCs成骨分化的具體作用機(jī)制，有助于研發(fā)促進(jìn)骨再生、抑制骨吸收的新途徑和方法，對(duì)臨床預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松類疾病具有重要意義，研究及應(yīng)用前景十分良好。